Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Immunität von der saisonalen Grippe-Impfstoff zur Verfügung gestellt wurde traditionell durch Hämagglutination Inhibition (HI) Assay¹bewertet, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf die Rezeptor-Bindungsstelle des das Hämagglutinin misst. Diese HI-aktive Antikörper sterilisieren Immunität verleihen können, aber sind in der Regel eng in ihrer Breite von Schutz, bietet Immunität gegen nur eine ausgewählte einige Stämme des Influenza-Virus. Die Isolierung und Charakterisierung von weitgehend reaktiven monoklonalen Antikörpern, die das Hämagglutinin (HA) erkennen schlagen vor, dass die Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs in Reichweite^{2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8}. ist eines der Hauptziele des universellen Grippeimpfstoffs induzieren eine starke Antikörperantwort auf die konservierten Bereiche des Influenza-Virus^{9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16}. im großen und ganzen Antikörper, die diese konservierten Epitope, bestehend aus neutralisierende und nicht neutralisierende Antikörper^17,18erkannt haben gezeigt, dass Fc-FcγR Interaktionen für erfordern optimale Schutz in Vivo und Highlight des Beitrags der Fc-vermittelten Immunität gegen die allgemeine Immunantwort auf Influenza Virus^19,20.

Korrelate des Schutzes sind entscheidend bei der Beurteilung der Immunität gegen Infektionen. Diese Metriken ermöglichen Wissenschaftlern und Klinikern, die Wirksamkeit von Impfstoffen, die Bedeutung der Daten und der Verlauf der Behandlung zu schätzen. Das einzige etablierte Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion ist die Hämagglutination Inhibition Assay. Ein Titer von 01:40 ist mit einer 50 % Reduktion des Risikos von Krankheit^1,21 – und spiegelt das Vorhandensein von Antikörpern, die Agglutination zu hemmen, indem Sie auf den Rezeptor verbindlich vor Ort auf den kugelförmigen Kopf des HA. Allerdings sei auch darauf hingewiesen, dass T-Zell-Reaktionen möglicherweise eine bessere Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion bei älteren Menschen. Ein kürzlich veröffentlichten Bericht zufolge Interessanterweise Neuraminidase Hemmung Tätigkeit ein besserer Prädiktor der Immunität gegen Grippe²²sein kann. Glücklicherweise Tests typische in-vitro- , wie z. B. Neutralisation oder Neuraminidase Hemmung Assays HA Stiel oder Neuraminidase-spezifische Antikörper messen können. Die meisten dieser konventionellen in-vitro- Tests jedoch nur berücksichtigen sowohl die Funktion des Antigen-Bindung-Region des Antikörpers und Messen nicht die Rolle der Fc-Region. Darüber hinaus sind der Beitrag der nicht neutralisierende Antikörper, die über Fc-Rezeptor Engagement in Vivo zu schützen nicht erkannten^17,18. Um Schutz durch Antikörper, die Fc-vermittelten Immunität wie Antikörper abhängige Zelle vermittelten Zytotoxizität (ADCC) induzieren zu messen, braucht man ein robuste in-vitro- Assay.

Die unten beschriebene Methode beurteilt die Fähigkeit von murinen monoklonalen Antikörpern, Fc-vermittelten Funktionen durch den Einsatz von gentechnisch veränderten Jurkat Zell-Linie mit dem Ausdruck einer Aktivierung induzieren Murine Typ 1 FcR, FcγRIV. Antikörper-Engagement von der FcγR transduces intrazellulären signalisieren, dass Trigger nuklearen Faktor der aktivierten T-Zellen vermittelten Luciferase-Aktivität. Der Test hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, die Isolierung und Kultur der primären Effektorzellen und die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Aktivierung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen^{19,23,24 Erkennung erfordern ,25,26}. Erstens kann das Protokoll hier beschriebenen leicht verschiedene virale Ziele, FcγRs und Antikörper verschiedener Arten (menschliche und murine) integrieren angepasst werden. Zweitens die Verwendung einer modifizierten Jurkat-Zelle Zeile zum Ausdruck zu bringen, die eine FcγR mit einer Luciferase Reporter-gen unter einem nuklearen Faktor von aktivierten T-Zellen (NFAT) für einen Großformat-Assay ermöglicht, die mit einer Platte Reader Messung der Lumineszenz leicht analysiert werden können. Hier wird die traditionelle Aktivierung des primären Effektorzellen mit der Induktion von NFAT-Luciferase auf Antikörper Engagement von einer FcγR auf der Oberfläche der Zelle Jurkat ersetzt. 96-Well-Platte Format Assays kann für die Messung von bis zu vier verschiedene Proben in Triplicates mit sieben Verdünnungen – eine Reihe von Proben, die umständlich mit traditionellen Techniken werden könnte. Gibt es weitere Punkte, die mit dieser Assay, die das Design von Experimenten und die Interpretation der Daten beeinträchtigen können. Das virale Ziel muss auf der Zelloberfläche in Reihenfolge für die Antikörper Anerkennung ausgesprochen werden. Um dies zu mindern, kann das Ziel-Antigen (z.B. eine interne virale Proteine) direkt auf die Oberfläche der Platte beschichtet werden. Allerdings hat dies noch nicht rigoros getestet. Darüber hinaus die modifizierte Zellinie Jurkat drückt nur eine Art der Aktivierung FcγR und drückt keine hemmenden FcγRs während Primärzelle Linien alle Rezeptoren in einem physiologischen Kontext auszudrücken.

Wir haben zuvor dieser Assay verwendet, um zu zeigen, dass Epitop-Spezifität in einem polyklonalen Kontext eine entscheidende Rolle spielt bei der Regulierung der Fc-vermittelten Effektor-Funktionen und optimale Aktivierung des Antikörper-abhängige zellvermittelte Reaktion zwei Punkte erfordert wenden Sie sich an^27,28. Hier beschreiben wir eine Methode, die bewertet die Fähigkeit von Stiel-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu engagieren und aktivieren die Murine FcγRIV aktivieren. Zwar gibt es Ausnahmen^29,30, eine große Anzahl von weitgehend Antikörper Ziel antigenetisch erhaltenen Stiel und Umgebung das Hämagglutinin und somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer universellen Grippe Impfstoff.

Die Experimente in diesem Manuskript vorgeformt wurden folgende Icahn School of Medicine der institutionellen Code von Ethik und Vorschriften durchgeführt.

1. Ausdruck des Influenza-Virus Hämagglutinin über Transfektion oder Infektion

Transfektion:

1. Platte menschlichen embryonalen Niere (HEK 293T) Zellen bei einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte und lassen Sie es für 4 h in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO₂).
2. Transfizieren Zellen mit 100 ng der DNA Kodierung für virale Hämagglutinin und 0,2 μl Transfection Reagens pro Bohrloch in einem Gesamtvolumen von 50 μL.
   Hinweis: Beide Plasmid und Transfectant Reagenz 1 x Opti-Minimum wesentlichen Medien (MEM) reduziert Serum Medium verdünnt werden.
3. Entfernen Sie nach Platten in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO₂ für 18 h Inkubation, Transfektion Medium.

(2) Infektion

1. Platte A549 oder Madin Darby canine Nieren-Zellen bei einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur wachsen mindestens 18 Stunden in einem 37 °C Inkubator mit 5 % CO₂und 96-Well-Platte behandelt.
2. Verdünnten Virus in 1 x MEM und infizieren Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 3, 1 oder 0,33 für 1 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO₂. Gesamtvolumen sollte 100 μL entsprechen.
   Hinweis: 10 X MEM wird verdünnt mit Wasser zu einer 1 x MEM arbeiten Lager für die oben genannten Virus-Verdünnung.
3. Nach der Infektion, entfernen das Inokulum und 100 μl 1 x MEM in die Platte in der Abwesenheit von Trypsin.
4. Wachsen Sie infizierte Zellen für 18 bis 24 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO₂.

3. Beurteilung der FcRg/NFAT-vermittelte Aktivierungs der Luciferase-Aktivität durch monoklonale Antikörper oder Sera

1. Zunächst ersetzen Sie Wachstumsmedien transfizierte oder infizierten Zellen mit 25 µL Assays Medien (1 X RPMI 1640 ergänzt mit 4 % (Vol/Vol) niedrige IgG fetalen bovine Sera).
2. Durchführen Sie in eine separate 96-Well-Platte vierfach Verdünnungen der Antikörper des Interesses ab 30 μg/mL mit Hilfe der Assay-Medien. Verdünnungen in Triplicates durchführen und eine Beispiel-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, ein Steuerelement, das Antikörper (keine Antikörper-Kontrolle) ausschließt sowie ein Hintergrund-Steuerelement (Testpuffer allein).
   Hinweis: für beide der "keine Antikörper" und Hintergrund-Kontrollen, fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Antikörper.
3. Übertragen Sie 25 μL der seriell verdünnten Antikörper von Schritt 3.2 in entsprechenden Vertiefungen auf Platte transfizierten Zellen oder infizierten Zellen.
4. Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO₂) für 15 min.
5. Fügen Sie 25 μL der entsprechenden veränderten Effektor Jurkat Zelle murinen FcgRIV oder menschliche FcgRIIIa (75.000 von Zellen/weit) zum Ausdruck bringen. Gesamtvolumen für jede sollte gut 75 µL und der Start Endkonzentration des Antikörpers ist bei 10 µg/mL (Abbildung 1 b).
   Hinweis: Für das Hintergrund-Steuerelement fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Effektorzellen hinzu. Um Antikörper-abhängige zellvermittelte Phagozytose zu untersuchen, kann eine modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der menschlichen FcgRIIa verwendet werden.
6. Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂ 6 h.
7. Tauwetter und warmen Luciferase Substratpuffer in einem 37 °C Wasser für ca. 1 h vor dem Gebrauch.
   Hinweis: Um die Luciferase Substratpuffer machen, bereiten Sie lyophilisierter Luciferase Assay Substrat in Testpuffer zur Verfügung gestellt. Die rekonstituierte Substratpuffer kann bis zu sechs Wochen bei-30 °C bis-10 °C aufbewahrt werden.
8. Alle Vertiefungen mit Ausnahme der Hintergrundkontrolle 75 μl/Well der Luciferase Substratpuffer hinzufügen.
9. Lesen Sie auf einem Luminometer.
10. Falten-Induktion mit folgender Gleichung berechnen: Falten Induktion (induzierte Wert-Background-Wert) = / (keine mAb-Wert-Background-Wert).

Wir konnten zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, aber nicht Kopf-spezifischen Kopf-spezifische mAb, PY102, konnte durch heraufregulierende CD107a und Interferon-γ-19primäre natürliche Killerzellen aktivieren. Um die Fähigkeit einer Stiel-spezifischen Antikörper, primären menschlichen NK-Zellen aktivieren zu modellieren, wir zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, robust aktivieren kann, die modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der murinen FcγRIV von ~ 14-fold. Auf der anderen Seite machen die Kopf-spezifische mAb, PY102 und die Kontrolle IgG nicht (Abbildung 2)28.

Um zu untersuchen, wenn die Multiplizität der Infektion (MOI) die Induktion von Jurkat-Zellen mit dem Ausdruck der murinen FcγRIV beeinflussen kann, infizierten wir MDCK Zellen mit X31 (ein Reassortant Influenza A Virus Ausdruck der Hämagglutinin und Neuraminidase von A/Hong Kong/1/68 (H3N2) Virus mit den internen Segmenten des A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)) mit einer MOI von 3, 1 oder 0,33. Vierundzwanzig Stunden später wurden Jurkat Zellen murinen FcγRIV und mAb auszudrücken 9H 10 hinzugefügt die infizierten MDCK-Zellen. In Abbildung 3zeigen wir, dass Zellen mit einer MOI von 3 infiziert die Lumineszenz ca. 3-fach höhere als MDCK-Zellen infiziert mit einer MOI von 0,33 hervorrufen können.

Abbildung 1 : Eine schematische Darstellung des eine Beispielanlage Platte und Zusammensetzung der experimentellen Gruppen. (A) die Start Konzentration für jede Probe Antikörper ist bei 10 µg/mL und seriell über die Platte (Spalte 1, Spalte 12) 4-fach verdünnt. Jede Probe erfolgt in Triplicates. Reihe G ist reserviert, für die keine mAb-Kontrolle und Zeile H Hintergrund. (B) Endvolumen für jede Versuchsgruppe vor Zugabe der Luciferase Substratpuffer ist 75 µL. Beachten ist haben die Probe und "keine mAb-Gruppen" 25 µL der Effektorzellen hinzugefügt, während der Hintergrund Kontrollgruppen 75 µL Assays Medien haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Induktion von modifizierten Jurkat Zellen mit dem Ausdruck FcgR durch einen Stiel Monoclonal Antikörper. A549 Zellen infiziert wurden mit A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) mit einer MOI von 3. Bei 24 Stunden post-Infektion, murine FcγRIV exprimierenden Jurkat Zellen in Kombination mit PY102, 6F12 oder ein IgG-Steuerelement hinzugefügt wurden. Induktion von Jurkat-Zellen wurden bewertet, durch Lumineszenz-Signal von Firefly Luciferase unter NFAT-Response-Element erzeugt. Fehlerbalken = Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Die Multiplizität der Infektion betrifft Induktion von einem Stiel-spezifischen Antikörper. MDCK-Zellen wurden mit X31 (H3N2) mit einer MOI von 3, 1 oder 0,33 infiziert. Bei 24 h post Infektion, FcgR exprimierenden Jurkat Zellen in Kombination mit 9H 10 (ab Verdünnung von 10 µg/mL) hinzugefügt. Induktion von Jurkat-Zellen wurden bewertet, durch Lumineszenz-Signal von Firefly Luciferase unter NFAT-Response-Element erzeugt. Fehlerbalken = Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Autoren erklären keine Interessenkonflikte.