Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Injizieren von Plasmid DNA in der Mausniere über das Nierenbecken, Transgene Ausdruck speziell in der Niere zu produzieren.
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Methodenartikel
Hydrodynamische Nierenbecken Injektion für nicht-virale Expression von Proteinen in der Niere
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hydrodynamische Injektion schafft eine lokale, Hochdruck-Umfeld, um verschiedenen Geweben mit Plasmid-DNA und anderen Substanzen zu transfizieren. Hydrodynamische Schweif Vene Injektion, ist zum Beispiel eine etablierte Methode, die durch die Leber transfiziert werden kann. Dieses Manuskript beschreibt eine Anwendung der hydrodynamischen Prinzipien durch Injektion von der Mausniere direkt mit Plasmid DNA für Nieren-spezifische Genexpression. Mäuse werden betäubt und die Niere durch eine Flanke Inzision, gefolgt von einer schnellen Injektion ein Plasmid DNA-haltigen Lösung direkt in das Nierenbecken ausgesetzt ist. Die Nadel ist für zehn Sekunden gehalten und Ortsbild Einschnitt vernäht. Am nächsten Tag live Animal Imaging, Western-Blot oder Immunohistochemistry, Genexpression assay verwendet werden oder anderen Assays geeignet, um das Transgen Wahl dienen zur Erkennung des Proteins des Interesses. Veröffentlichten Methoden der Genexpression zu verlängern zählen Transposon-vermittelten Transgen Integration und Cyclophosphamid behandelt, um die Immunantwort auf das Transgen hemmen.
Einleitung
Die hydrodynamischen Schweif Vene Injektionstechnik ist eine häufig verwendete Möglichkeit, hohe Genexpression in Maus Leber1,2geworden. Die Nieren sind auch durch diese Technik auf einem viel niedrigeren Niveau, etwa 100-fold weniger3transfiziert. Die hydrodynamischen Nierenbecken-Injektion, die hier beschriebenen bietet eine einfache Möglichkeit zu steuern, die Besonderheit der Orgel Ausdruck durch physische Mittel nach den gleichen hydrodynamischen Grundsätzen, die zuvor in Leber,4,5 festgelegt wurden , Muskel-
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUCs) des Baylor College of Medicine und Vanderbilt University Medical Center genehmigt.
1. bereiten Sie die DNA-Lösung zur Injektion
- Wählen Sie die Plasmid(s) der transgene sorgfältig, um zu maximieren die wünschenswerten Eigenschaften zur Verbesserung der Effizienz der Transfektion und Transgene Ausdruck zum Ausdruck bringen.
Hinweis: Hydrodynamische Nierenbecken Injektion von Plasmiden, die fluoreszierenden Marker TdTomato, das Hormon Erythropoietin (Epo) und Firefly Luciferase auszudrücken wurden zuvor beschriebenen
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Ergebnisse
Die Chirurgie und Injektion Technik sind einfach durchzuführen, einmal gemeistert, erfordert keine große Ausrüstung oder teuren Materialien. Wenn neue zur Flanke-Schnitt Niere Chirurgie, einen Trainingstag auf mehrere Mäuse geplant für Euthanasie dürfen in denen die Mäuse sind nicht wiederhergestellten nach der Operation, weil der erste Versuch dieser Operation wesentlich länger als normal dauern kann. Alternativ können Forscher mit ähnlichen Techniken vertraut ganz einfach finden. Befolg.......
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Diskussion
In diesem Protokoll wird eine robuste Methode zur Erreichung reproduzierbare Genexpression speziell in der Niere beschrieben. In den Händen eines mäßig erfahrener Chirurgen fanden wir den Prozentsatz der Mäuse, die durch diese Technik im Bereich von 50-100 %, je nach Alter der Maus und die Empfindlichkeit der Anzeige des Transgens transfiziert. Das Niveau der Luciferase-gen-Expression war über Hintergrund für mehrere Monate in den Mäusen erhalten PiggyBac Transposons und für mehrere Wochen bei immungeschwächten .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offen zu legen und kein Interessenkonflikt zu erklären.
Danksagungen
Ein Career Development Award vom Department of Veterans Affairs [BX002797] L.E.W. und die National Institutes of Health [R01-DK095867] American Heart Association [15GRNT25700209] unterstützt und j.c. Die National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] und der Vanderbilt-Zentrum für Nierenerkrankungen unterstützt M.H.W. Dieses Material ist das Ergebnis der Arbeit mit Ressourcen und Nutzung der Einrichtungen im VA Tennessee Valley Healthcare System unterstützt.
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Materialien
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|---|---|---|---|
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| BD Insulinspritze 0,5 mL 29G 1/2 Zoll | Cardinal Health | 309306 | Erforderliche Spritzen |
| Buprenex | Apotheker/Tierarzt | Analgesie - Kontrollierte Substanz | |
| Dynarex Einweg-Handtuchtuch | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Über dem Wärmekissen |
| platzieren EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Nur endotoxinfreie Plasmid-DNA verwenden |
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| Gaymar Wärmepumpe | Paragon Medical | TP-700 | Wasserzirkulierende Wärmepumpe |
| Germinator 500 | Roboz Chirurgisches Instrument | DS-401 | Zur Wiederverwendung von chirurgischen Instrumenten während der Operation |
| Graefe Pinzette | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5136 | Chirurgisches Werkzeug |
| Graefe Gewebezange | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5153 | Chirurgisches Werkzeug |
| Halsey Nadelhalter, 5" Länge | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-7841 | Chirurgisches Werkzeug |
| Heizkissen - 15" x 21" - benötigen mindestens 3 | Paragon Medical | TP22G | Zur Verwendung mit der Gaymar Wärmepumpe |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | Für Bildgebung und Euthanasie |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizer | Smiths Medical | VCT3K2 | Für Bildgebung und Euthanasie |
| Ketamin | Apotheker/Tierarzt | Anästhetikum - Kontrollierte Substanz | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laborgewebe |
| Lebendbild-Software | Caliper Life Sciences | Für die Bildgebung von lebenden Tieren | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | Für die Bildgebung von lebenden Tieren |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spektralphotometer für die DNA-Messung |
| Prevantics Tupfer | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | Für die Vorbereitung von Hautoperationen |
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| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | Für die Bildgebung lebender Tiere |
Referenzen
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
