Hydrodynamisk nyrebækken injektion for ikke-virale udtryk af proteiner i nyrerne
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at injicere plasmid DNA i musenyre via nyrebækken at producere transgen udtryk specielt i nyrerne.
Abstract
Hydrodynamisk injektion skaber en lokal, højtryks miljø for at transfect forskellige væv med plasmid DNA og andre stoffer. Hydrodynamisk hale vene injektion, for eksempel, er en veletableret metode hvormed leveren kan være transfekteret. Dette manuskript beskriver en ansøgning af hydrodynamiske principper ved indsprøjtning af en musenyre direkte med plasmid DNA for nyre-specifikke genekspression. Mus er bedøvede og nyrerne er udsat ved en flanke indsnit efterfulgt af en hurtig injektion af et plasmid DNA-holdige løsning direkte ind i nyrebækkenet. Nålen er holdt på plads i ti sekunder og webstedet incisionen sutureres. Den følgende dag, live animalske imaging, vestlige skamplet eller Immunhistokemi kan anvendes til assay genekspression, eller andre assays egnet til transgen valg der anvendes til påvisning af protein af interesse. Offentliggjort metoder til at forlænge genekspression omfatter transposon-medieret transgen integration og cyclophosphamid behandling for at hæmme immunresponset til transgenet.
Introduction
Hydrodynamisk hale vene injektionsteknik er blevet et almindeligt anvendte måde til at opnå høje niveau af genekspression i mus lever1,2. Nyrerne er også transfekteret af denne teknik på et meget lavere niveau, ca 100-fold mindre3. Den hydrodynamiske nyrebækken injektion beskrevet her giver en enkel måde at kontrollere specificiteten af orgel udtryk gennem fysiske processer ved hjælp af de samme hydrodynamiske principper, der er fastlagt tidligere i leveren4,5 , muskel6, og andre organer7,8. Denne metode transfects celler i levende dyr i vivo ved hjælp af tryk og hastighed at tvinge væske indeholdende DNA i cellerne, samtidig fremkalde skader på det organ, der er hurtigt løst9. Ved hjælp af veletablerede kirurgiske teknikker til at visualisere nyre via en flanke indsnit10 sammen med en enkelt injektion af insulin sprøjte, har vi fundet vellykket Transfektion af forskellige typer af nyreceller, hovedsagelig interstitiel fibroblaster, tubuli, og indsamle kanal11. Dissektion af disse mus har vist, at andre organer ikke er transfekteret på et niveau højt nok til at visualisere ved luciferase imaging teknikker11. Da teknikken er ikke-virale, tillader anvendelse af plasmid DNA til Transfektion hurtig og nem forberedelse af reagenser kræves til injektion.
Vi har brugt lokaliserede hydrodynamiske injektioner for at udtrykke antioxidant glutathion S-transferase A4, insulin-lignende vækstfaktor-1 receptoren og hormon erythropoietin i nyrerne, alle med forventede biologiske virkninger11, 12 , 13. grundig evaluering af indgiftsmåde, injektionsvolumen, DNA dosering, og promotor valg har været udført11. Derudover begge piggyBac transposon system og/eller cyclophosphamid behandling til at undertrykke immun reaktion transgenet har vist sig at forbedre langsigtede gen expression resultater11. Andre efterforskere har brugt en nyre-vene tilgang i rotte med succes, at opnå høj Transfektion effektivitet for perioder på mere end en måned14. Dog genetiske korrektion af fænotyper efterligne menneskers sygdom er normalt udføres i mus først som en proof-of-concept da mest pattedyr genetiske modeller er musemodeller. Vi sammenlignede nyre-vene injektion til nyrebækken injektion og fandt, at injektion i nyrebækkenet var overlegen i forhold til nyre-vene for genekspression (cirka ti gange højere) og overlevelse11. Nyrebækkenet er en ideel ruten træder i nyrerne, fordi det er fleksibelt nok til at tolerere udsving i urinproduktion og er ofte i stand til at opretholde sin strukturelle integritet selv når forstørrede under hydronefrose. Derudover injektion i nyrebækkenet tilladt adgang til nyrerne uden piercing nyre kapsel, at lade den injicerede væske skal beholdes synligt af nyre bedre end intraparenchymal injektion. Andre mus organer har ikke en rute af post end Vaskulaturen, men den urinveje plads i nyrerne er en ideel injektionsstedet. Derudover resulterede injektion i nyre-vene i udsivning af blod ind i bughulen. Den samlede nyre volumen i wild-type mus nyrerne er blevet anslået ved magnetisk resonans at være cirka 0,2 cm3, så mængden af en enkelt nyre er omtrent lig med mængden af væske sprøjtes af nyrebækken hydrodynamiske injektion (100 µL)15. Heri, har vi stillet til rådighed alle detaljerede nuancerne i den hydrodynamiske nyrebækken injektion protokol til opnå reproducerbare Transfektion af nyrerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol er en robust metode til at opnå reproducerbare genekspression specifikt i nyrerne beskrevet. I hænderne på en moderat erfaren kirurg har vi fundet procentdelen af mus transfekteret ved denne teknik skal være i intervallet 50-100%, afhængigt af musen alder og følsomheden af udlæsning af transgenet. Luciferase genekspression var over baggrunden for adskillige måneder i mus modtage piggyBac transposoner og opretholdes helt i flere uger i immunkompromitterede mus modtager den samme transposo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En karriere udvikling Award fra Department of veterananliggender [BX002797] støttede L.E.W. og National Institutes of Health [R01-DK095867] og American Heart Association [15GRNT25700209] J.C. National Institutes of Health [DK093660], Department of veterananliggender [BX002190] og Vanderbilt Center for nyresygdom understøttes M.H.W. Dette materiale er et resultat af arbejde støttes med ressourcer og brug af faciliteterne på VA Tennessee Valley Healthcare System.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
Referenzen
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
