Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.
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Methodenartikel
Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zelluläre Adhäsion und Differenzierung ist bedingt durch die nanoskaligen Disposition Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) mit lokalen Konzentrationen, die eine große Wirkung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns von Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) zu erhalten-funktionalisierten Dendrimere, die es die nanoskaligen Kontrolle der lokalen RGD ermöglichen Oberfläche Dichte. Nanopatterns von Oberfläche Adsorption von Dendrimere aus Lösungen in verschiedenen ursprünglichen Konzentrationen gebildet werden und zeichnen sich durch Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und scanning Mikroskopiertechniken wie z. B. Sonde Scanning tunneling Microscopy (STM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Die lokalen Oberflächendichte des RGD wird gemessen mit AFM Bilder mittels Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände und dann korreliert mit Zell-Adhäsion-Antwort und Differenzierung. Die hier vorgestellte Methode der Nanopatterning ist ein einfaches Verfahren, das auf einfache Weise zu großen Flächen skaliert werden kann. Es ist daher voll kompatibel mit Zelle Kultur Protokolle und kann auch auf andere Liganden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.
Einleitung
Hier beschreiben wir eine einfache und vielseitige Dendrimer-basierte Nanopatterning Prozedur Zelloberflächen Kultur zu erhalten, die der Kontrolle der lokalen Haftfähigkeit im Nanobereich zu ermöglichen. Nanoskalige Details der ECM-Organisation wurden gemeldet,1,2,3 und die Nanopatterning der Zelle Klebeflächen hat tiefe Einblicke in die zellulären Anforderungen in Bezug auf Haftung4zur Verfügung gestellt, 5. Experimente mit Mizellen Lithographie-basierte Nanopatterns ergab einen Schwellenwert von etwa 70 nm für RGD....
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Protokoll
(1) Substrataufbereitung
-
1,4 x 1,1 cm Au(111) auf Glimmer Substraten glühen.
- Ein Glaskeramik-Kochfeld setzen Sie Au(111) Substrat auf und Tempern Sie es mit Butan Flamme für 3 min. zulassen das Substrat unter Argon Atmosphäre abkühlen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Au(111) Substrat.
Hinweis: Au(111) Substrate sollten sofort nach dem Glühen verwendet werden.
- Ein Glaskeramik-Kochfeld setzen Sie Au(111) Substrat auf und Tempern Sie es mit Butan Flamme für 3 min. zulassen das Substrat unter Argon Atmosphäre abkühlen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Au(111) Substrat.
-
Vorbereitung von Poly (L-Milchsäure) (PLLA)-beschichtete Glassubstrate.
- Schneiden Sie und waschen Sie den Objektträger.
- Geschnitten Sie Mikroskopie-Folien in 18 Folien von 1,25 x 1,25 cm mit einem D....
- Schneiden Sie und waschen Sie den Objektträger.
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Ergebnisse
Wir präsentieren eine Nanopatterning Methode, die Oberfläche Haftfähigkeit auf der Nanoebene (Abbildung 1) angesprochen werden kann. Die chemische Struktur der RGD-Cys-D1 zeigt Abbildung 1A. Dendrimere wurden auf elektrische leitende Au(111) Oberflächen für hochauflösende STM Charakterisierung gemustert. Niedrige Dendrimer-Konzentrationen in Lösung (bis zu 10-5% w/w) gerendert isoliert Dendrimere 4-5 Nm im Dur.......
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Diskussion
Bei der Entwicklung des Protokolls beschrieben sollte eine Reihe von kritischen Schritte berücksichtigt werden. Die erste bezieht sich auf Nanopattern Charakterisierung mit Scan-Sonde-Mikroskopie-Techniken. Um die Nanopatterns sichtbar zu machen, muss die Oberfläche, wo Musterung entsteht liegt der Rauheitswert unterhalb der mittlere Durchmesser der Dendrimere, was ungefähr 4 – 5 nm gemessen an STM (Abbildung 1 b). Auch sollte berücksichtigt werden, dass hochauflösende STM Bildgebung auf leitfähigen Subs.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren erkennen Oriol Font-Bach und Albert G. Castaño für ihre Hilfe bei dmin Quantifizierung. Sie erkennen auch die erweiterte digitale Mikroskopie Einheit am Institut für Forschung in der Biomedizin (IRB Barcelona), die Autoren, die das Video in ihren Räumlichkeiten aufnehmen zu lassen. Diese Arbeit wurde durch die Vernetzung Biomedical Research Center (CIBER), Spanien unterstützt. CIBER ist eine Initiative der VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Programm, CIBER Aktionen und das Instituto de Salud Carlos III, mit Unterstützung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung finanziert. Diese Arbeit wurd....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gold (111) auf Glimmer. 1,4x1,1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glas-Objektträger, glatt | Corning | 2947-75x25 | |
| Deionisiertes Wasser | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactid/DL-Lactid Copolymer | Corbion | 95/05 molare Übersetzung | |
| 1,4 - Dioxan | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silikonöl, Hochtemperatur | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Laminar-Flow-Haube für Gewebekulturen | Telstar | Bio II Advance | Klasse II biologische Sicherheitswerkbank |
| Filtereinheit | Millex-GP | SLGP033RB | 0,22 µ m |
| Spritze 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Rasterkraftmikroskop | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM-Instrument | |
| Silikon-AFM-Sonden | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonanzfrequenz 300 kHz, k = 40 N/m |
| Rastertunnelmikroskop | Molekulare Bildgebung | PicoSPM-Mikroskop | |
| Pt0,8:Ir0,2 Draht | Advent | PT671012 | Durchmesser 0,25 mm |
| WSxM 4.0 Software | Nanotec electronica | ||
| Optisches Kontaktwinkelsystem (CA) Dataphysics | |||
| SCA20 Software | Dataphysics | ||
| Röntgen-Photoelektronenspektrometer | Physikalische Elektronik | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronektin aus Rinderplasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1,0 mL Lösung |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Pulver |
| Mausembryo Fibroblasten | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) flüssiges flüssiges Serum mit hohem Glukosegehalt | Gibco | 11960044 | flüssiges Serum mit hohem Glukosegehalt, kein Glutamin, 500 mL |
| fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Natriumpyruvat | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 Kulturflaschen | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Zentrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Nicht mit Gewebekulturen behandelte Platte, 12 Well | Falcon | 351143 | Nicht adhärente |
| hMSCs aus Fettgewebe | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Zellfläschchen 1 mL |
| MSC Basalmedium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC Growth Kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Niedriges Serum |
| Chondrozyten-Differenzierungswerkzeug | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalinlösung | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral gepuffert, 10% |
| Ammoniumchlorid | Sigma-Aldrich | A9434-500G | für die Molekularbiologie, geeignet für Zellkultur, ≥ 99,5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | für die Molekularbiologie, verwendet als nichtionisches Tensid, Adjuvans |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Kaninchen monoklonal [Y113] Anti-Paxillin Antikörper | Abcam | ab32084 | Verdünnt 1:200 |
| Maus monoklonal [1F5] Anti-Kollagen alpha-1 XX Kette | Acris Antikörper | AM00212PU-N | Verdünnt: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper | Invitrogen | A10667 | 2 mg/ml. Verdünnter 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-Sekundärantikörper | Invitrogen | A11036 | 2 mg/ml. Verdünnt 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/ml. Verdünntes 1:1000 |
| Deckglas 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluoreszenzmikroskop | Nikon | Eclipse E1000 aufrechtes Mikroskop | mit CCD-Kamera |
| Konfokales Mikroskop | Leica Microsystems | Leica SPE aufrechtes konfokales Mikroskop | |
| ImageJ 1,50g Freeware | |||
| MATLAB-Software | Die MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 Software | OriginLab Zusammenarbeit |
Referenzen
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
