Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Blätterteig-Technik, durch die pharmakologische Reagenzien können während der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verabreicht werden, und verschiedene Aspekte der Funktionen, die für den Erfolg entscheidend sind.

Zusammenfassung

Pharmakologische Verwaltung wird häufig verwendet, wenn Sie ganze Zelle Patch-Clamp in Hirnschnitten Aufnahme durchführen. Eine der besten Methoden der Zulassungsantrag bei der elektrophysiologischen Aufnahme ist der Blätterteig-Technik, die verwendet werden kann, um die Wirkung der pharmakologischen Reagenzien auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben zu studieren. Der größte Vorteil der Blätterteig-Anwendung ist, dass die Wirkstoffkonzentration rund um den Ort der Aufnahme schnell erhöht und verhindert so die Desensibilisierung von Membranrezeptoren. Erfolgreichen Einsatz von Blätterteig Anwendung beinhaltet besondere Aufmerksamkeit auf die folgenden Elemente: die Konzentration des Medikaments, die Parameter der Blätterteig Mikropipette, der Abstand zwischen der Spitze des einen Blätterteig Mikropipette und das Neuron aufgenommen und die Dauer und Druck der Zug fahren (Pfund pro Quadratzoll, Psi). Dieser Artikel beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Erfassung der ganzen Zelle Ströme induziert durch Gamma - Aminobuttersäure (GABA) auf ein Neuron eine präfrontalen kortikalen Scheibe schnaufend. Insbesondere kann das gleiche Verfahren mit geringfügigen Änderungen, andere Hirnareale wie Hippocampus und das Striatum und verschiedene Präparate, wie z. B. Zellkulturen angewendet werden.

Einleitung

Die Patch-Clamp-Technik, ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von elektrischen Signale in Neuronen, wurde in den 1970er Jahren^1,2entwickelt. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie wissen wie bestimmte Behandlungen bietet (z. B. pharmakologische) neuronale Funktionen oder Kanäle in Echtzeit³verändern kann. Pharmakologische Bewertung der neuronalen Funktion während der gesamten-Zelle in einer Gehirn-Scheibe Aufzeichnung erfordert die Anwendung von Medikamenten, wie z. B. Agonisten oder Antagonisten von spezifischen Rezeptoren, die Neuronen aufgenommen wird. Diese Methode ermöglicht die Identifikation von neuronalen Veränderungen, die auftreten, nach der Anwendung eines bestimmten Medikaments, führt zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen-⁴. Obwohl pharmakologische Verwaltung über entweder Perfusion⁵ oder Blätterteig⁶durchgeführt werden kann, ist letzteres die überlegene Technik. Insbesondere: (i) Blätterteig Anwendung rasch erhöht Medikament Konzentration um das aufgezeichnete Neuron auf ein Niveau, so dass Desensibilisierung der Membranrezeptoren verhindert wird; (Ii) das Volumen der Droge aufgeblasen ist äußerst gering, so dass es kaum Auswirkungen auf die Bad-Lösung, die daher Nebenwirkungen der verabreichten Chemikalien auf Gehirnscheiben reduziert; (Iii) das Blätterteig-Protokoll kann eingestellt und gespeichert, so dass das Experiment sehr genau reproduzierbar; (iv) Blätterteig Anwendung steht für sparsamen Umgang mit Agonisten/Antagonisten, besonders wo solche Reagenzien sind teuer oder schwer zu erlangen.

Hier konzentrieren wir uns auf die ganze Zelle Ströme induziert durch schnaufend GABA in akut bereit Gehirnscheiben, ein Präparat, das hat den Vorteil, relativ gut erhaltene Hirnschaltkreisen Aufnahme. Wie führen wir Blätterteig-induzierte hemmenden Strömungen⁷ werden in diesem Artikel beschrieben werden. Mithilfe von Cäsium (Cs⁺)-interne Lösungen, und halten die Neuronen bei 0 mV, präsentieren wir GABA-Blätterteig hervorgerufen inhibitorischen postsynaptischen Ströme (eIPSCs) mit entsprechenden technischen Details. Mit einem Maus-Modell der Depression induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) Injektion⁸, wir zeigen, dass die eIPSC ist Amplitude, hervorgerufen durch einen GABA-Zug in Scheiben von LPS injiziert Mäusen im Vergleich zu Kontrollen Fahrzeug deutlich reduziert. Unsere Absicht ist, dass dieser Artikel zeigen sollte, wie die Blätterteig-Technik ist überall anwendbar, Studien zur Bewertung der Wirkung von Chemikalien, Verbindungen oder Drogen auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben.

Protokoll

Tierhaltung und alle Tierarten, die Experimente wurden nach Verfahren genehmigt von der Ethikkommission für Tierversuche an South China Normal University, nach den Richtlinien für Animal Care vom National Institute of Gesundheit.

1. Vorbereitung der Lösungen

1. bereiten 500 mL standard künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) mit den Komponenten in unseren veröffentlichten Werk ⁷ beschrieben, wie in Tabelle 1 aufgeführt.
   1. Verwendung sauberes Glas Becher mit entionisiertem Wasser, eine frische ACFS Lösung vorzubereiten. Spachteln mit entionisiertem Wasser reinigen und trocknen, bevor Sie mit NaCl, KCl, NaH hinzufügen ₂ PO ₄, Nahco3 ₃, MgSO ₄, D-Glucose, und fügen Sie das CaCl ₂ nach haben sprudelte die Lösung mit 95 % O ₂ / 5 % CO ₂ Mischung für ~ 20 min (wie in Tabelle 1) bis 500 mL entionisiertem Wasser. Rühren, bis Sie vollständig aufgelöst.
   2. Stellen Sie sicher der ACFS völlig ist klar, ohne jede Niederschlag. Dann stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4. Blase mit einem Gasgemisch bestehend aus 95 % O ₂ und 5 % CO ₂ für ~ 20 min.
2. 250 mL Slice Cutting-Lösung mit den Chemikalien ⁷ in Tabelle 2 beschrieben vorbereiten.
   1. KCl, MgCl ₂, NaH ₂ PO ₄, Nahco3 ₃, Choline·Cl, D-Glucose hinzufügen und fügen Sie das CaCl ₂ zuletzt gemäß 1.1.1 bis 250 mL entionisiertem Wasser und auflösen wie in 1.1.1 und 1.1.2 beschrieben.
   2. Nach sprudeln mit 95 % O ₂ / 5 % CO ₂, stellen die Lösung in eine Tiefkühltruhe für 15-20 min, so dass die Cutting-Lösung wird eiskalt und teilweise gefrorenen.
      Hinweis: Wir verwenden diese Cutting-Lösung bei der Scheiben von 1-2 Monate-alten Mäusen; die Formel für Mäuse, die älter als 2 Monate abweichen.
   3. Bereiten LPS Lösung durch Auflösen in sterilen Endotoxin-freie isotonische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl). LPS ist intraperitoneal verabreicht (0,5 mg/kg) und mit der Aufnahme 2 h später.

2. Vorbereitung des präfrontalen Cortex Slice

1. Cutting-Lösung aus dem Gefrierschrank nehmen und homogenisieren um ein Matsch zu erhalten. Legen Sie die Lösung auf dem Eis und Blase ständig mit 95 % O ₂ / 5 % CO ₂.
2. Mit großen, scharfen Schere, schnell eine Maus als beschriebenen ⁹ enthaupten und sofort legte den Kopf in ein Becherglas gefüllt mit eiskalten (0-4 ° C) Schneidlösung.
3. Schneiden Sie die Spitze des Schädels entlang der Mittellinie in Richtung kaudalen Nasal mit einer feinen Schere und die seitlichen Schädel Teile zu entfernen. Entfernen Sie das Gehirn mit einem feinen Spachtel und Drop ins eiskalte Schneidlösung.
   Hinweis: Schritte 2.2-2.3 erfolgen schnell (im Idealfall < 1 min).
4. Legen Sie das Gehirn auf den Deckel einer 9 cm Petrischale mit Eis gefüllt. Spülen Sie das Gehirn mit eiskalten Schneidlösung. Das Kleinhirn und der Riechkolben mit einer Rasierklinge abgeschnitten.
5. Anwenden Cyanacrylat-Klebstoff auf die Probe Inhaber einer Vibratome. Legen Sie vorsichtig den Gehirn-Block auf den Tropfen Klebstoff, rostral Seite nach oben, und sofort eintauchen in eiskaltes Schneidlösung.
6. Einstellen den Klingenhalter Vibratome in einem Winkel von 15° mit Bezug auf die horizontale Ebene und bereiten 350 µm koronalen Gehirnscheiben (Klinge Schwingungsfrequenz = 85 Hz, Geschwindigkeit = 0,1 mm/s).
7. Mit einer Pipette, die Scheiben in die Erholung-Kammer voller ACFS, Transfer inkubieren 1 h (bei RT) mit konstanten sprudeln von 95 % O ₂ / 5 % CO ₂.

3. Ganze Zelle Patch Aufnahme

1. machen Glas Borosilikat Mikropipetten für als Aufnahme Elektroden verwenden oder Blätterteig Mikropipetten nach den vorgegebenen Richtlinien der Puller-Betriebsanleitung. Für die Aufzeichnung von Elektroden, Tipp Widerstände sind im Bereich von 4-6 M Ω, während Blätterteig Mikropipetten Spitze Durchmesser im Bereich von 2 bis 5 µm haben.
2. Na ⁺-Kanal-Blocker (TTX, 1 µM), Block schnell Na ⁺ Kanal und damit Aktionspotentiale zu ACFS hinzufügen und Verwalten von konstantem Volumenstrom dieser Lösung von 2-3 mL/min in der Kammer Aufnahme durch peristaltische Pumpe in die Kammer und streben aus ihm heraus. Blase der ACFS mit 95 % O ₂ / 5 % CO ₂ ständig um die Lebensfähigkeit der Scheiben gewährleisten.
3. Übertragen eine Gehirn-Scheibe in der Aufnahme-Kammer mit einer modifizierten Pasteurpipette deren feiner Spitze geschnitten wurde, um die Scheibe Größe passen. Decken Sie die Scheibe mit einem Platin Slice-Anker mit parallel Nylonfäden Abstand ≥ 2 mm auseinander, die Scheibe auf der Plattform zu halten.
4. Füllen Sie die Aufnahme Mikropipette mit internen Lösung ⁷ (Tabelle 3), und füllen Sie die Blätterteig Mikropipetten mit GABA bei 10 µM, 50 µM und 100 µM (aufgelöst in ACFS) oder ACFS als Fahrzeugkontrolle.
5. Gegen Verstopfung mit Schutt, üben Sie leichten positive Druck mit eine 1 mL Spritze vor die Aufnahme Elektrode in der ACFS eintauchen. Mit einem Mikromanipulator unter dem Mikroskop (4 X Objektiv), die Aufnahme Elektrode und Blätterteig Mikropipette so positionieren, dass die Spitzen in der Mitte des video-Bildes auf dem Monitor ( Abbildung 1 A) erscheinen.
6. Stellen Sie den Mikroskop-Fokus (40 X Objektiv) schrittweise Senkung der Blätterteig Mikropipette und legen Sie es über das Neuron Aufnahmen in einem Winkel von 45°. Halten Sie den Abstand zwischen der Spitze des Blätterteig Mikropipette und das Neuron, aufgenommen zwischen 20-40 µm ( Abbildung 1 B). Nähern Sie langsam und vorsichtig das Neuron mit der Aufnahme-Elektrode und lassen Sie dann den positiven-Luftdruck. Eine schwache und kurze Absaugung durch den Schlauch angeschlossen, der Elektrodenhalter erstelle ich ein Giga-Ohm-Siegel bewerben.
7. Pflegen die Spannung auf 0 mV. Nach Bildung der Giga-Ohm-Dichtung schnell kompensieren Sie und verlangsamen Sie Kapazität zu, manuell oder automatisch. Dann bewerben Sie sich eine kurze und starke Absaugung durch die Schläuche erwähnt, um in den gesamten Zelle Modus bekommen.
8. Datensatz eIPSC in Voltage-Clamp-Modus. Die Blätterteig-Mikropipette mit einer Picospritzer durch einen Master 8 Schritt Generatorspannung gesteuert, einzeln oder paarweise GABA Puffs ( Abbildung 2) liefern niedrigen Gasdruck (Stickstoff, 4-6 Psi) zuweisen.
9. Ändern die Blätterteig-Dauer um das beste eIPSC erzielen ( Abbildung 3) und Messen Sie die eIPSC in die LPS-induzierte Depression-Modell ( Abbildung 4).

Ergebnisse

Die Blätterteig-Technik erlaubt Forschern, die Wirkung von Medikamenten auf bestimmte Rezeptoren auf der Oberfläche eines bestimmten Neurons zu studieren. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf Strömungen durch GABA-Rezeptoren vermittelt. Abbildung 1 zeigt die Blätterteig und Aufnahme Mikropipetten. Keine Auswirkungen auf die aufgezeichneten Neuronen des physischen Drucks zu beseitigen durch das Blätterteig ACFS generiert und Saccharose Puffs (

Diskussion

Blätterteig-Anwendung ist weit verbreitet, postsynaptischen Rezeptor-Funktion^3,4,7zu bewerten, sondern erfordert eine präzise Steuerung in jedem Experiment. Wir beschreiben hier ein Verfahrens unter Beteiligung ganz-Zell-Patch zu spannen, was beweist, dass GABA-Blätterteig IPSCs (z.B. eIPSCs) im präfrontalen kortikalen Gehirnscheiben induziert. Der Widerstand der Elektrode Aufnahme beträgt ca. 5 MΩ, während der Kopfkreis des Blä...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glas Borosilikat-Mikropipetten	Shutter Instruments	BF150-86-10	1,50 mm Außendurchmesser; 0,86 mm Innendurchmesser
Mikropipette Puller	Shutter Instruments	MODELL P-97	Flaming/Brow Mikropipetten-Abzieher
Mikromanipulatoren	Shutter Instruments	MP-285
Computergesteuerter Verstärker	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digitales Erfassungssystem	Molecular Devices	Digidata 1440A
Imaging-Kamera	Nikon	2115001	Prüfgeräte
Mikroskopie	Nikon	Eclipse FN1
Master 8	A.M.P.I.	Master-8 Pulsstimulator
Vibratome Slicer	Leica	VT 1000S
Rasierklinge	Gillette	74-S	FLYING EAGLE
Videomonitor	Panasonic	WV-BM 1410
502 Glue	Deli	7146	Cyanacrylat-Kleber
Schlauchpumpe	Shanghai JIA PENG Corporation	BT100-1F
Videokamera	Olympus America Medical	OLY-150
Transfer Pipets	Biologix	30-0138A1