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dieses Protokoll folgt Experimente in zugelassen: (1) Menschen von der Ethik Komitee der Monash Medical Center und (2) Tiere, die von der Ethikkommission der Universität Melbourne.
1. alvéolaire Lavage (BAL) Makrophagen
- Verwendung BAL Lung Makrophagen in zu erhalten: (1) menschliche Themen durch Bronchoskopie 6 und (2) Mäuse mit Intra-trachealen streben 13 .
Hinweis: Erwerb von den Makrophagen führt in der Regel einige Aktivierung dieser Zellen. Makrophagen stammen aus Patienten, die erfordern eine Bronchoskopie, ein mögliches medizinisches Problem zu untersuchen und möglicherweise nicht alle Themen geeignet für die Analyse der METs (Dies müssen für jedes einzelne Projekt ermittelt werden).
- BAL Lösung und Spin-down (500 X g für 10 min.) in Form einer Tablette nehmen, waschen zweimal mit Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) mit fetalen Kälberserum 5 % und 1 % L-Glutamin) bei Raumtemperatur und verdünnen Sie Zellen in 4 mL Kultur medi Umm.
- Bei Bedarf anfordern eine formalen differenzielle Graf; die meisten Zellen (in der Regel > 80 %) werden Makrophagen 6.
Hinweis: Dies wird in der Regel erfolgen durch einen klinischen Histologie-Service über die morphologische Darstellung der verschiedenen Zellen Typen 6.
- Führen eine tragfähige Makrophagen Zelle zählen auf die BAL-Lösung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und ein Hemocytometer.
Hinweis: BAL Lösung ergibt sich aus Mensch und Maus wie unter Schritt 1.1.
- Add 1-4 x 10 5 Makrophagen zu 24-Well-Platten auf Deckgläsern in 500 µL Kulturmedium pro gut und lassen Sie über Nacht bei 37 ° C; die Zellen haften an den Deckgläsern. Fügen Sie für Humanproben, Antibiotika (z.B. Penicillin und Streptomycin, 10 4 U/mL), bakterielle Kontamination zu verhindern.
2. Immunfluoreszenz Beschriftung/Mikroskopie von Makrophagen BAL
Hinweis: Zellen auf Deckgläsern eingehalten werden, wie oben erwähnt.
- Das Kulturmedium zu entfernen und waschen Sie die Zellen einmal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Beheben von Zellen in 2 % Paraformaldehyd/periodate/Lysin (PLP) Fixiermittel für 10 min.
- Zellen kurz in PBS waschen, und dann permeabilize in 0,2 % Tween 20 in PBS für 20 min.
- Block-Zellen mit 10 % Huhn Sera in 5 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt mit PBS-Puffer für 30 min.
- Inkubation mit Primär- und Isotype Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur in 1: 100-Konzentrationen (weitere Einzelheiten finden Sie in Tabelle of Materials) bei 37 ° c
Hinweis: Für die BAL-Proben, ein spezifische Marker von Makrophagen ist in der Regel nicht erforderlich.
- Nach der Zugabe von Primärantikörpern, waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, und weiter mit der entsprechenden Sekundärantikörper für 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-basierte Eindeckmittel zur Visualisierung mit einem confocal Mikroskop (siehe oben) am Laser Erregungen 405, 488, 561 und 647 nm und 40 X, 1,0 NA Öl Ziel.
3. Lunge Gewebeproben
Hinweis: für in Vivo Studien von Lungengewebe, studieren die Proben nach der entsprechenden Exposition (z. B., wie beschrieben durch O ' Sullivan Et Al. 7). die Belichtung, die am besten für dieses Experiment sind infektiöse Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Maus-Stämmen, die für diese Methode verwendet werden könnten sind C57BL/6 oder BALB/c Mäuse, 10-12 Wochen alt, Gewicht 25-30 g und männlich.
- Einschläfern Mäuse, über eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (400 mg/kg) und Xylazin (40 mg/kg). Öffnen der Brusthöhle und aussetzen von Lunge und Herz mit chirurgischen Pinzetten und Scheren.
- Einflößen warm PBS mit einer 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel zum Auswaschen des Blutes aus den Gefäßen für 30 s, dann die Infusion 10 mL 2 % PLP Fixativ für 30 s (in den rechten Ventrikel).
- Verwenden um Lavage der offenen Brustraum warm PBS (42 ° C). Intubation der Trachea mit einer 21-Gauge-Nadel und ein Stück 0,8 mm Schlauch geschnitten, und 800 µL vorgewärmten (bis 42 ° C) zu injizieren, niedrigschmelzende 3 % Agarose-Lösung zeigen.
- Tie abseits die Luftröhre mit geflochtenen Seide (4.0 USP). Legen Sie den Faden um die Luftröhre, knapp unterhalb der Einfügemarke an die Stelle der Kanüle, und sichern Sie sie über eine einfache Überhandknoten. Um die Agarose erstarren, eiskaltem PBS um die Lunge zu verwalten. Entfernen Sie die Lungen und das Herz als einen Block von der Brusthöhle mit Schere und stumpfe Dissektion. Jede Lunge einzeln entfernen und dann beheben sie für 16 h in 2 % PLP oder Formalin bei 4 ° c
- Speichern die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Gewebe zu schneiden. Diese Methoden für den Erhalt der Lungengewebe wurden zuvor beschriebenen 13.
- Zur Vorbereitung des Lungengewebes Beispiele verwenden die folgenden Schritte.
- Fix Lungengewebe Gewebe (reseziert im Schritt 3.1)-10 % natürlichen gepuffert Formalin für 24 h bei Raumtemperatur. Übertragen auf 75 % Ethanol und stellen in einem Gewebe-Prozessor auf einem 12 h Zyklus, (2,5 h in 75 % EtOH, 3 h in absolute EtOH, 3,5 h im Lösungsmittel 3 b und 3 h in Paraffin).
- Einbetten in standard Paraffin, Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Blöcke, die gespeichert sind bei Raumtemperatur zu schaffen.
Hinweis: In diesem Stadium ist es in der Regel zweckmäßig, die Lunge Querschnitte für standard Folien.
- Die Proteinkinase Lungen-Abschnitte bei 4-5 µm Dicke mit einem Mikrotom schneiden und montieren auf aufgeladen, beschichtete Folien wie oben beschrieben durch O ' Sullivan Et Al. 7
- , Folien zu montieren, 3 Tropfen Eindeckmittel auf Deckgläsern 60 mm x 24 mm (Größe 1,5), invertieren die Folie auf das Deckglas und push-out überschüssige Mittel. Hermetisch dichten mit Nagellack und bei Raumtemperatur lagern.
4. Vorbereitung/Mikroskopie von Gewebeproben Lunge
- de-einwachsen, rehydrieren und die Proteinkinase Lunge Gewebeprobe mit Antigen-Retrieval-Lösung vorbehandeln.
- Ofen trocken gleitet die Proteinkinase für 60 min bei 60 ° C. Dann legen Sie die Folien in Xylol Lösung für 30 min und den Transfer zu 70 % Ethanol Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Spülen in Leitungswasser.
- Ort in hitzebeständigen Folie eingeschweißt und unterliegt HIER-Antigen-Retrieval im Schnellkochtopf für 10 min in 10 m/Mol/L Tris, 1 Mmol/EDTA pH 9.0. Cool für 20 min. Waschen zweimal im Leitungswasser für 5 min auf einer Wippe, dann einmal mit PBS auf Rocker.
- Block mit 10 % Huhn Serum in 5 % BSA/PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
- Des Gewebes zu beflecken.
- , METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 1 % BSA/PBS 16 h bei 4 ° C in 1/100 Verdünnung (genauere Angaben zu Mengen Antikörper sind in Tabelle Materialien aufgeführt). Waschen zweimal mit PBS für 5 min auf einer Wippe.
- Erreichen-Fluoreszenz-Detektion durch Inkubation mit entsprechenden sekundären Antikörper in 1 % BSA/PBS für 40 min bei Raumtemperatur. Antikörper sind: (1) Huhn Anti-Maus 488 (grün), Huhn (2) Anti-Ziege 594 (rot) und (3) Esel Anti-Maus (weit rot) 647.
- Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-haltigen Eindeckmedium für das Chromatin beflecken.
- Fluoreszierenden Bilder mit einem konfokalen Laser-scanning-Kopf befestigt an einem inversen Mikroskop zu erhalten.
- Excite die Vorbereitung mit 405, 488, 561 und 647 nm Laser. Einziges Flugzeug 512 x 512 Pixel großen Bildern zu erfassen, durch Anklicken der Linie-sequentielle, Nivellierung Knopf (2 Zeile durchschnittlich) mit 20 X 0,1 NA Luft- und 40 X 1.0 NA Öl Ziele.
- Erhalten mindestens zehn Gesichtsfelder pro Abschnitt für Analysen und Daten für jedes Ergebnis (d.h. 10 Hochleistungs-FOV (HFOV) für das Steuerelement, 10 für die angeregten Probe, etc., für jede Maus).
Hinweis: Um eine repräsentative Stichprobe von das gesamte Feld zu erhalten, eine Matrixsystem kann verwendet werden in dem Bereich unterteilt ist in verschiedenen Abschnitten und für jede andere Probe die gleiche Matrix verwendet wird, um die Sichtfelder auswählen (z.B. Feld kann in 9 Abschnitte unterteilt werden, und das Zentrum und die 4 Ecken, zwei HFOV sind entnommen).
5. Dreidimensionale (3D) Imaging der METs
Hinweis: da METs 3-d-Strukturen sind, indem man mehrere Z-Stapel Bilder, die wieder hergestellt werden, können geben wertvolle Informationen.
- Abschnitt der Lunge Exemplare aus Paraffin-Blöcke bei 200 µm mit einem Vibratome bei einer Amplitude auf 1,8 mm und die Geschwindigkeit von 0,1-0,5 mm/s
- Blockieren Lungengewebe mit 20 % des jeweiligen Serum (10 % fetalen Kälberserum und 10 % Huhn Serum) und dann permeabilize in PBS ergänzt und 3,75 % Triton X 100 für 7 h bei Raumtemperatur unter sanften Agitation.
- Fleck in den Abschnitten 16 h bei 4 ° C mit der entsprechenden Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 200 µL Bände in Mikrozentrifugenröhrchen (Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle Materialien aufgeführt).
- Waschen Sie die Abschnitte in PBS, 3 Mal für 10 min vor der Inkubation mit sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
- Der Lunge Abschnitte für DAPI (1:5 000) in Lösung für 20 min, färben, bevor das Mikroskop schlüpft die Cover hinzufügen in PBS Folien.
- Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem inversen konfokalen Mikroskop (40 x 1.3 NA) ausgestattet mit 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm und 635 nm Laser.
- 3-d-Z-Stapel von 0,54 µm Dicke mit optimalen Z-Schnitt für das 40 x 1.3 NA Öl Ziel aufnehmen.
Hinweis: Die verwendete Software variieren je nach dem individuellen Mikroskop. Ein Beispiel für die Verwendung der Software für ein Mikroskop erfolgt in ergänzende Datei 1.
6. Bildanalyse
Hinweis: die Analyse der Proben erfordert den Einsatz von speziellen bildgebenden Analyse-Software und Beispiele sind in Tabelle Materialien aufgeführt. Während die Analyse der Ergebnisse abhängig von der spezifischen Programm verwendet wird, die unten aufgeführten Punkte sind wichtig.
- Analyse von BAL-Proben
- definieren die Anzahl der Makrophagen durch den blauen Kanal für DAPI auswählen und zuweisen eine Mindestgröße für die Zellen (z.B., > 18 µm im Durchmesser). Mit der entsprechenden Software, die Gesamtzahl der Makrophagen pro Feld messen.
- Die Anzahl der Zellen, die die Merkmale einer MET durch die Anwesenheit von extrazellulären Chromatin röntgenologisch DAPI mit Co Ausdruck von anderen Markern (z. B. MMP12, PAD2 und H3Cit).
Hinweis: Die Anzahl der Markierungen, die analysiert werden können hängt von der Anzahl der Laser zur Verfügung, sondern im Idealfall neben DAPI, sollten mindestens zwei andere Marker einbezogen werden. Andere, weniger spezifische Parameter für MET Ausdruck (z. B. Anzahl der Zellen mit extrazellulären Chromatin und einem erweiterten Kern) verwendet werden.
- MET Ausdruck in BAL vergleichen Proben (zwischen Kontrolle, Rauch und Rauch/DNase behandelt Gruppen), ein Minimum von 100 BAL Makrophagen pro Probe.
- Zur Messung Sekundärantikörper und Isotype Ebenen der Fluoreszenz zu kontrollieren, ein Minimum von 100 Zellen in jeder Probe für ihre Fluoreszenz zu messen. Messen Sie das durchschnittliche Niveau der Hintergrundfluoreszenz für jede Markierung (z.B. H3Cit) mit standard-Software.
- MET Ausdruck definieren zählen die Zellen mit den typischen Phänotyp (z. B. extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit und MMP9) und für jede MET, messen die Höhe der Fluoreszenz von Markern (z. B. H3Cit und MMP9). Zellen produzieren METs, wenn ihre Färbung nicht über Hintergrund und Isotype Kontrolle lag ausschließen.
- Für BAL Humanproben, analysieren Sie ein Minimum von 100 Zellen für jede Probe für den Anteil von Makrophagen, die METs zu machen. Für murinen Proben analysieren wie die Zellen kleiner sind und METs schwerer sind zu definieren, eine größere Anzahl von Zellen für jede Probe (z. B. 200 Makrophagen).
- Analyse von Gewebeproben Lunge
- verwenden um festzustellen, das Vorhandensein von METs im Lungengewebe spezifischen Makrophagen Marker wie F4/80.
- Definieren die Anwesenheit von METs in Lungengewebe mit Co Lokalisierung von F4/80 in Zellen, die extrazelluläre Chromatin mit anderen Parametern zu äußern, wie in Abschnitt 6.1 aufgeführt.
- Bestimmen den Umfang der Hintergrundfluoreszenz in Proben mit sekundären Antikörper und die Isotype-Steuerelemente. Analyse, die nicht über dem Hintergrund METs ausschließen.