태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델
Summary
여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.
Abstract
산 모 비만 가능성이 autophagy의 dysregulation, 부분에서, 표시 될 수 있습니다 손상 된 태 반 기능에 의해 중재 불리 한 perinatal 결과의 위험 증가와 연결 됩니다. 비만 임신에서 반응과 autophagy 레 귤 레이 터의 식에서 벗어난 변화는 비만 및 임신과 관련 된 염증 과정에 의해 통제 될 수 있습니다. 여기서 설명 하는 것은 villous 조직의 샘플링 및 기본 세포 배양에 대 한 용어는 인간의 태 반 으로부터 villous cytotrophoblasts의 격리에 대 한 프로토콜이입니다. 이것은 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), proinflammatory cytokine은 고가의 비만 마른 임신에서 기본 trophoblasts 치료 하 여 비만 자궁내 환경에 선 동적인 환경 시뮬레이션을 위한 방법으로 뒤 임신입니다. 여기에 설명 된 프로토콜의 구현을 통해 외 인에 노출 있다 TNFα 루비콘, 여성 태아와 마른 임신에서 trophoblasts에서 autophagy의 부정적인 레 귤 레이 터의 표현을 조절. 다양 한 비만 자궁내 환경에 생물학적 요인 trophoblasts 중요 한 통로 변조 가능성이 유지,이 비보 전 시스템은 식 패턴 vivo에서 관찰 된 경우 결정 하는 데 특히 유용 모성 비만과 인간의 반응과에서 TNFα 신호의 직접적인 결과입니다. 궁극적으로,이 방법은 월급 autophagy 및 다른 중요 한 세포 경로에 영향을 미칠 가능성이 있는 trophoblasts 모성 비만과 관련 된 염증의 규제 및 분자 의미 밖으로 구문 분석 하는 기회 태 반 기능입니다.
Introduction
비만 과잉 지방이 많은 직물 및 양분 가용성에서 형태소 분석 만성 낮은 학년 염증이 특징 염증 성 상태입니다. 비만, proinflammatory cytokines는 상승 된 대사 조직 뿐만 아니라 체계적으로 순환. 증거의 강력한 시체는 TNFα 크게 상승 비만의 설정에서 의미와 함께 인슐린 저항성 및 대사 부전1에 보이고 있다. TNFα의 활성화는 또한 암 등 면역, 그것에 게 매력적인 치료 대상2를 만드는 조건에서 질병 병 인에 기여.
염증 비만에서 임신, 또한 proinflammatory 상태3,4에 의해 복합입니다. 그것은 이전 보였다 태 반 TNFα 콘텐츠 여성 태아와 임신에서 모성 adiposity와 증가. 또한, TNFα 처리 TNFα는 성적으로 동종이 형 방식으로5placental 신진 대사 조절에 관여 하는 것을 건의 하는 여성만 아니라 남성 trophoblast 셀에 미토 콘 드리 아 호흡을 억제. 산 모 비만 임신 동안에, 사 산를 포함 하 여 남성 태아는 가장 취약3,6,7,8 되와 관련 된 다양 한 합병증의 발생률이 증가 . 때문에 산 모 신생아 인터페이스에서의 주요 역할, 염증 신호에 대 한 응답 비만 자궁내 환경에 태 반의 기능 용량에 변화 중재 비만 임신의 결과에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
Cytotrophoblasts 및 syncytiotrophoblasts는 태 반의의 villous 조직에 내 분 비 신호 및 어머니와 개발 태아9영양소와 산소 교환에 대 한 중요 하다. 태아 건강 및 개발 villous cytotrophoblasts (trophoblasts 라 함)의 기능 용량에 중단 위태롭게 될 수 있습니다. 이 프로토콜 멀리 trophoblasts 기본 세포 배양에 대 한 격리에 대 한 최적화 절차를 함께 chorionic 및 기저 판 해 부하 여 villous 조직의 인간의 용어 태에서 샘플링 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 기질 trophoblasts10, 을 차동 밀도 원심 분리에 의해 뒤에서 셀 출시 villous 조직의 효소 소화와 관련 된 설립된 방법론에서 파생 된 11,12. 이 프로토콜 세부 사항 산 모 비만과 관련 된 방법을 반응과 마른 임신에서에서 기본 trophoblasts 문화 미디어 TNFα 선 동적인 환경에의 한 구성 요소를 시뮬레이션 하기 위해 보충으로 취급 됩니다. 마지막으로, TNFα 처리 trophoblasts 유전자 발현에서 변화를 감지 하 더럽혀 서 뒤에서 총 세포 lysates 수확에 대 한 간단한 절차 설명 되어 있습니다.
이 모델에는 전체에서 환경에 utero obesogenic 정리 하지 않습니다, 하는 동안 trophoblasts’ 응답으로 TNFα 중재 염증의 개별 기여에 밖으로 구문 분석할 수 있도록 제어 시스템 제공 임산부 비만입니다. 이 모델 발견 하거나 직접 TNFα trophoblasts에서 신호에 의해 통제 하는 분자 목표를 확인 하는 모두 기회를 월급으로 유전자 식 패턴의 변화에서 관찰 vivo에서 모자와 반응과에서 테스트 한 비만은 TNFα 중재 염증의 결과 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법은 인간의 trophoblasts autophagy의 규제에 염증 TNFα 중재의 효과 테스트 하려면 구현 되었습니다. 남성 태아 전시와 함께 비만 임신에서 trophoblasts autophagic 회전율, 또는 autophagosome 성숙13중단. 리소좀을 늦은 endosomes 지역화, 최근으로 설명 하고있다 “브레이크” autophagic 매출 과정에서 그것은으로 작동 하기 때문에 (실행 도메인 단백질 상호 작용 하는 Beclin1 및 시스테인-부자 포함), 루비콘 이라고 불리는 단백질 autophagosome 성숙14,15의 레 귤 레이 터. 사실, 루비콘 autophagy, 그것에 게 귀중 한 치료 목표를 억제 하는 단백질의 드문 예입니다. 아주 작은 정보는 microbials16,17 cardiomyocyte 보호18에 타고 난 면역 반응에 있는 그것의 역할을 제외 하면 루비콘의 병 태 생리 의미에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 루비콘 upregulated 여성 기본 trophoblasts 250 pg/mL까지 TNFα의 농도 증가 함께 치료에 대 한 응답에서에 발견 된다. 루비콘의 규제 수 역할 어떻게 여성 태아 요금에 임신에 남성 보다 더 나은 산 모 비만. 에 중요 한 통로의 규칙에 비만 자궁내 환경에 미치는 영향을 연구 플랫폼을 제공 업과 인간의 trophoblasts 외 인 TNFα 노출 하 여 비보 전 산 모 비만과 관련 된 염증 trophoblasts 및 확장, 태 반 기능.
Protocol
Representative Results
Discussion
태 반, 태아의 성장 조절에 대 한 책임6비만 환경 손상 된 기능을 전시 한다. Trophoblasts의 높은 신진 대사 요구에도 불구 하 고 산 모 비만과 반응과 미토 콘 드 리아 기능 장애 호흡6,19전시. Placental 대사에서 변화는 합병증과 비만 임신3,,67에서 관찰 된 불리 한 태아 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 여자를 들이 연구에 대 한 그들의 반응과 기증 감사 합니다. 우리 또한 조정 반응과의 컬렉션에 대 한 노동 및 배달 부 오 스 모자와 태아 연구 팀에 감사. 우리는 에릭 왕, 박사, 그리고 켈리 쿠오, MD 지원 감사 하 고 실험 방법 및 최적화에 도움이.
이 작품은 NIH HD076259A (오전)에 의해 투자 되었다와 AHA GRNT29960007 (오전).
Materials
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
Referenzen
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells’ calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -. S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -. S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
