Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Zusammenfassung

Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.

Zusammenfassung

Makrophagen sind phagocytic angeborene Immunzellen, die Immunantworten auf Krankheitserreger zu initiieren und zu Heilung und Gewebe Wiedergutmachung beitragen. Makrophagen sind ebenso wichtig für die Entzündungsreaktionen ausschalten. Wir haben gezeigt, dass hohe Mengen an die Anti-inflammatorische Zytokine, Interleukin 10 (IL-10) und niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf bakteriellen Lipopolysacchariden (Makrophagen stimuliert mit intravenösem Immunglobulin (IVIg produzieren) LPS). IVIg ist ein polyvalenter Antikörper, vor allem Immunglobulin Gs (IgGs), aus dem Plasma von mehr als 1.000 Blutspendern gebündelt. Es dient der Ergänzung Antikörper bei Patienten mit Immunschwäche oder Immunantworten bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Bedingungen zu unterdrücken. Infliximab, eine therapeutische anti-Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) Antikörper, nachweislich auch Makrophagen produzieren IL-10 in Reaktion auf entzündliche Reize zu aktivieren. IVIg und andere Antikörper-basierten Biologics kann getestet werden, um deren Auswirkungen auf Makrophagen Aktivierung zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung, Stimulation und Bewertung der murinen Knochenmark Makrophagen durch Antikörper in Vitro aktiviert und murinen peritonealen Makrophagen aktiviert mit Antikörpern in Vivo. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von westliche Beflecken, um den Beitrag der bestimmte Zelle Signalwege entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität zu bestimmen. Diese Protokolle können mit genetisch veränderten Mäusen, verwendet werden, um festzustellen, die Wirkung von bestimmten benutzt auf entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung. Diese Techniken können auch verwendet werden, um festzustellen, ob bestimmte Biologics wirken können, indem Makrophagen auf eine IL-10 produzierende entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die Entzündungsreaktionen in Vivoreduziert. Dies kann geben Auskunft über die Rolle der Makrophagen Aktivierung in die Wirksamkeit von Biologika während Krankheitsmodelle in Mäusen und geben Einblick in ein potenzieller neuer Wirkmechanismus im Menschen. Umgekehrt kann dies gegen den Einsatz von spezifischen Antikörpern basierende Biologics Vorsicht zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere dann, wenn Makrophagen eine wichtige Rolle in der Wirt Verteidigung gegen diese Infektion spielen.

Einleitung

Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die mehrere Rollen in der Immunantwort auf Infektionen oder Verletzungen zu spielen. Makrophagen sind verantwortlich für die Einleitung einer Immunantwort auf Infektionen oder Gewebe Schaden, die entzündliche Reaktion zu stoppen und die heilende Antwort¹zu fördern. Beispiele für die drei am besten untersuchten Makrophagen Aktivierung Zustände sind: 1) Makrophagen, die Behandlung mit Interferon-Gamma (IFNγ) und bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), M (IFNγ + LPS) bezeichnet, die dazu beitragen, die entzündliche Reaktion; (2) Makrophagen stimuliert mit Interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), die mit dem Heilungsproz....

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of British Columbia genehmigt.

(1) Knochenmark Makrophagen Ableitung und Aktivierung mit Antikörpern

1. Führen Sie Sterbehilfe mit CO₂ Erstickung.
   1. Statt Maus Induktion Kammer. Einschläfern Sie Maus mit 5 % Isoflurane Narkose, für 60-90 s, bis unbeweglich und atmen tief und langsam ist.
   2. Isofluran-Narkose schalten Sie und verwalten Sie ca. 6-8 L/min CO₂ bis Maus atmen aufgehört hat. Lassen Sie Maus mit CO₂ für mindestens weitere 5 min. überprüfen, dass es ni....

Ergebnisse

Murine Knochen Knochenmark abgeleitet Makrophagen können aus Vorstufen der blutbildenden Zellen im Knochenmark Aspiraten kultiviert werden. Knochenmark Aspiraten gebündelt in der Regel vom Oberschenkelknochen und Gebeinen der Mausklick C57BL/6 Ertrag 10⁷ Knochenmark abgeleitet Makrophagen, so dass sie eine günstige Quelle von Makrophagen für Experimente. BMDMs kann verwendet werden, basieren Medikament Antikörperantworten als mit einem Entzündungsreiz in Vitroherausgef.......

Diskussion

Makrophagen Aktivierung Staaten spielen eine wichtige Rolle in beiden Gewebe Homöostase und Krankheit²². Makrophagen können unterschiedliche sowie überlappende Aktivierungsstatus abhängig von Cues in ihrer Mikroumgebung³haben. Sie haben unterschiedliche Rollen in allen Phasen der Entzündungsreaktion: Verteidigung gegen Krankheitserreger, Wunde heilen und Gewebe Restitution und haben auch eine ausgeprägte entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die wichtig für das Ausschalte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Iscove' s modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM)	Life technologies	12440053
Fötales Rinderserum (FBS)	Life technologies	12483-020
Rekombinanter makriner Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF)	Stammzelltechnologien	78059
Penicillin-Streptomycin	Lebenstechnologien	15140148
Monothioglycerin (MTG)	Sigma	88640
1X Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen	eBioscience
Puffer für die Zelldissoziation	Life-Technologien	13150016	Enzymfreies, auf Hanks basierendes
(LPS)	Sigma aldrich	L 4516	aus E. coli 0127:B8
IVIg (Gammunex)	Grifols	aus dem BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin
IVIg (Gammagard flüssig)	Baxter Healthcare Corporation	erhalten vom BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin
IVIg (Octagam)	Octapharma	erhalten vom BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (steril), pH 7,4	Lebenstechnologien	10010023
Maus IL-10 ELISA	BD biosciences	555252
Maus IL-12/23p40 ELISA	BD Biosciences	555165
Anti-Erk1/2 Antikörper	Zellsignaltechnologie	9101
Anti-PP38 Antikörper	Zellsignaltechnologie	9211
Anti-GAPDH Antikörper	Fitzgerald industries	10R-G109A
26 g Nadel	BD Biowissenschaften	305110
1 mL Spritze	BD biosciences	309659
10 mL Spritze	BD biosciences	309604
15 mL konisches Röhrchen	BD biosciences	352096
50 mL konisches Röhrchen	BD biosciences	352070
Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)	Diamed	SPE155-N
75 cm2 Gewebekultur-behandelter Kolben	BD biosciences	353136
Zellschaber	BD biosciences	353085
Forcepts	VWR	82027-386	feine Spitze, präparieren
Schere	VWR	82027-582	Delicate, 4 1/2"
Hellfeldmikroskop	Motic	AE31	Inverser Phasenkontrast
Skala	Mettler	PE 3000

EDTA-Lipopolysaccharid