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Methodenartikel

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

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DOI:

10.3791/56689

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26. Dezember 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.

Zusammenfassung

Makrophagen sind phagocytic angeborene Immunzellen, die Immunantworten auf Krankheitserreger zu initiieren und zu Heilung und Gewebe Wiedergutmachung beitragen. Makrophagen sind ebenso wichtig für die Entzündungsreaktionen ausschalten. Wir haben gezeigt, dass hohe Mengen an die Anti-inflammatorische Zytokine, Interleukin 10 (IL-10) und niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf bakteriellen Lipopolysacchariden (Makrophagen stimuliert mit intravenösem Immunglobulin (IVIg produzieren) LPS). IVIg ist ein polyvalenter Antikörper, vor allem Immunglobulin Gs (IgGs), aus dem Plasma von mehr als 1.000 Blutspendern gebündelt. Es dient der Ergänzung Antikörper bei Patienten mit Immunschwäche oder Immunantworten bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Bedingungen zu unterdrücken. Infliximab, eine therapeutische anti-Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) Antikörper, nachweislich auch Makrophagen produzieren IL-10 in Reaktion auf entzündliche Reize zu aktivieren. IVIg und andere Antikörper-basierten Biologics kann getestet werden, um deren Auswirkungen auf Makrophagen Aktivierung zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung, Stimulation und Bewertung der murinen Knochenmark Makrophagen durch Antikörper in Vitro aktiviert und murinen peritonealen Makrophagen aktiviert mit Antikörpern in Vivo. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von westliche Beflecken, um den Beitrag der bestimmte Zelle Signalwege entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität zu bestimmen. Diese Protokolle können mit genetisch veränderten Mäusen, verwendet werden, um festzustellen, die Wirkung von bestimmten benutzt auf entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung. Diese Techniken können auch verwendet werden, um festzustellen, ob bestimmte Biologics wirken können, indem Makrophagen auf eine IL-10 produzierende entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die Entzündungsreaktionen in Vivoreduziert. Dies kann geben Auskunft über die Rolle der Makrophagen Aktivierung in die Wirksamkeit von Biologika während Krankheitsmodelle in Mäusen und geben Einblick in ein potenzieller neuer Wirkmechanismus im Menschen. Umgekehrt kann dies gegen den Einsatz von spezifischen Antikörpern basierende Biologics Vorsicht zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere dann, wenn Makrophagen eine wichtige Rolle in der Wirt Verteidigung gegen diese Infektion spielen.

Einleitung

Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die mehrere Rollen in der Immunantwort auf Infektionen oder Verletzungen zu spielen. Makrophagen sind verantwortlich für die Einleitung einer Immunantwort auf Infektionen oder Gewebe Schaden, die entzündliche Reaktion zu stoppen und die heilende Antwort1zu fördern. Beispiele für die drei am besten untersuchten Makrophagen Aktivierung Zustände sind: 1) Makrophagen, die Behandlung mit Interferon-Gamma (IFNγ) und bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), M (IFNγ + LPS) bezeichnet, die dazu beitragen, die entzündliche Reaktion; (2) Makrophagen stimuliert mit Interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), die mit dem Heilungsprozess verbunden sind; (3) Makrophagen stimuliert mit Immunkomplexe (IC) und LPS, M (IC + LPS), die die Fähigkeit haben, die entzündliche Reaktion2,3deaktivieren. M (IC + LPS) unterscheiden sich von M(IL-4) Wundheilung Makrophagen und nicht ausdrücken, das Enzym Arginase (Arg-1) oder FIZZ14. Der beste Marker für diese entzündungshemmende Makrophagen ist ihre Zytokin-Produktion-5. Makrophagen haben mehrere Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit, aber auch zu entzündlichen Erkrankungen und Krebs3beitragen. Aus diesem Grund sind Makrophagen eine wichtige therapeutische Ziel für die Behandlung von einer Vielzahl von Krankheiten. Es ist wichtig zu untersuchen, die Auswirkungen von Antikörpern auf ihren Aktivierungsstatus zu Makrophagen-basierte Therapien für Krankheiten zu entwickeln.

Dieses Dokument konzentriert sich auf die Verwendung von murinen Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) und peritonealen Makrophagen, die Wirkung von Antikörpermedikamente auf Entzündungsreaktionen in Vitro und in Vivozu testen. Vor kurzem gab es mehrere Studien, die zeigen der Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung6,7,8. Gemeinsam mit Immun-komplexe, die Antikörper mit einem Antigen und LPS, normalerweise Entzündungsreiz komplexiert sind aktiviert Makrophagen produzieren sehr hohes Maß an den Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 und sehr niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukin 12 (IL-12)9. In Addition, Infliximab, ein monoklonaler Antikörper gegen TNF zur Arbeit, zum Teil durch Induktion entzündungshemmende Makrophagen durch seine Fragment kristallisierbares (Fc) Region7festgestellt wurde. Wir haben berichtet, dass IVIg + LPS entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung, die ähnlich M (IC + LPS) induzieren, wobei Co stimulierte Makrophagen produzieren große Mengen von IL-10 und geringe Mengen an die Untereinheit Pro-inflammatorische Zytokin Interleukin-12 oder 23 p40 ( Il-12/23p40), Interleukin-6 (IL-6) und TNF-8. IVIg ist ein Medikament, bestehend aus polyclonal Antikörper vor allem IgG, die aus dem Blut von mehr als 1.000 Spender10gebündelt hat. Es wird zur Behandlung einer Vielzahl von Immunkrankheiten wie idiopathische thrombozytopenische Purpura und chronische demyelinisierende Polyneuropathie, aber sein Wirkmechanismus ist nicht vollständig verstanden11. Die Auswirkungen der Antikörpermedikamente basierend auf Makrophagen Aktivierung können beurteilt werden, hierin beschriebene Methoden verwenden.

Die Auswirkungen von spezifischen Biologics auf Makrophagen Aktivierung können in BMDMs und peritonealen Makrophagen getestet werden. Mit Hilfe dieser Makrophagen Quellen ermöglicht Bewertung von Primärzellen. Vorläufige Tests von Antikörpern auf kultivierten Primärzellen erfordert weniger Zeit und finanzielle Investition als andere Zeit- und kostenintensiv Krankheitsmodelle. Durch Einspritzen eines Medikaments in einem gesunden Maus in Vivo, und die Zellen zu isolieren und ex Vivozu analysieren, kann man feststellen, ob Studien gerechtfertigt sind, um zu beurteilen, ob die Behandlung mit Biologics Makrophagen Aktivierung in Krankheitsmodellen betrifft.

Unsere Techniken bieten nur wenige Studien die Wirkung von biologischen Therapien auf Makrophagen Aktivierung in Vitro und in Vivo direkt testen einen Vorteil gegenüber alternativen Techniken. Aktuelle Techniken beinhalten Tests biologischen Drogenwirkungen auf gemischte Zelle Bevölkerungen in Vitro, wie z. B. die Wirkung von Infliximab in einem gemischten Lymphozyten Reaktion (MLR) oder IVIg auf menschliche Makrophagen in peripheren mononukleären Blutzellen, wo die Wirkung kann nicht auf eine bestimmte Zelle Typ7,12zurückführen. Mit BMDMs und peritonealen Makrophagen ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Zelllinien, wie RAW264.7 Zellen, die nicht die Pro-inflammatorische Zytokine produzieren, IL-12, als Reaktion auf LPS8,13. Testen die Wirkung von einem Antikörper-basierten Medikament auf Makrophagen Antworten ex Vivo hat Vorteile, weil direkt auf Makrophagen Cytokine Reaktionen zurückführen lassen, anstatt herleiten von Makrophagen Antworten durch die Messung der Serumspiegel Zytokin14 . BMDMs und peritonealen Makrophagen können abgeleitet und von genetisch veränderten Mäusen zu bestimmen, die spezifische Rolle eines Proteins in entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung isoliert. Wir haben z. B. Il10 mangelhaft(- / -) BMDMs zu zeigen, dass IVIg-induzierte Verringerung der Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen IL-108teilweise abhängig ist. Ein Medikament Wirkmechanismus untersucht werden kann verwenden westliche Beflecken, wo die Rolle der spezifischen Proteine und Signalisierung Ereignisse ermittelt werden kann. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) kann durchgeführt werden, auf BMDMs oder peritonealen Makrophagen Muster der Genexpression zu zeigen, die durch Antikörper Aktivierung entstehen. Krankheitsmodelle bei Mäusen bieten Informationen über die mögliche Wirksamkeit von Antikörper-basierten biologischen Therapien in Modellen für Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit, rheumatoide Arthritis und Krebs15,16, 17. jedoch die hier beschriebenen Techniken informieren über den Wirkmechanismus von diese Biologics durch die Bestimmung, ob sie entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität induzieren.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of British Columbia genehmigt.

(1) Knochenmark Makrophagen Ableitung und Aktivierung mit Antikörpern

  1. Führen Sie Sterbehilfe mit CO2 Erstickung.
    1. Statt Maus Induktion Kammer. Einschläfern Sie Maus mit 5 % Isoflurane Narkose, für 60-90 s, bis unbeweglich und atmen tief und langsam ist.
    2. Isofluran-Narkose schalten Sie und verwalten Sie ca. 6-8 L/min CO2 bis Maus atmen aufgehört hat. Lassen Sie Maus mit CO2 für mindestens weitere 5 min. überprüfen, dass es nicht mehr ein Herzschlag oder Atmung. Führen Sie eine zervikale Dislokation um Tod zu gewährleisten.
      Hinweis: 8-12 Wochen alte Mäusen bieten den höchsten Ertrag von Makrophagen.
  2. Spray Maus Beine mit 70 % Ethanol und Pin, die sie mit Armen und Beinen in Rückenlage auf eine Dämmplatte verteilt. Machen Sie mit Schere und Pinzette die Haut halten einen flachen Schnitt (0,2 cm), die Haut und das Fell von der Oberfläche eines jeden der Hinterbeine zu entfernen.
    Hinweis: Führen Sie dieses Verfahren und alle Gewebekultur Manipulationen in einer sterilen Kapuze.
  3. Schneiden Sie Muskel um Tibien und Oberschenkelknochen sichtbar zu machen. Entfernen Sie die Schienbeine und Oberschenkelknochen, durch Schneiden von Knochen und Muskeln unterhalb des Hüftgelenks und über den Knöcheln. So viele Muskeln wie möglich abschneiden.
  4. Sprühen Sie Knochen mit 70 % Ethanol und warten Sie 1 Minute zu verdunsten, dann legen Sie sie in 6-well-Platte Knochen bündig Medium (Iscoves modifizierte Dulbecco Medium (IMDM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).
  5. Schneiden Sie die Enden der Knochen von 0,1 cm des Knochens aus die Knöchel und die Oberseite des Oberschenkelknochens schneiden, so dass der Knochenhohlraum ausgesetzt ist. Sicherstellen Sie, dass das Knochenmark sichtbar ist und eine 26 Gauge-Nadel in den Knochenhohlraum platziert werden kann.
  6. Schneiden Sie die Knochen und Muskeln, die Schienbeine und Oberschenkelknochen aus den Kniegelenken zu trennen. Legen Sie eine 26 Gauge-Nadel befestigt, eine 10 mL Spritze in den Hohlraum. Spülen Sie das Knochenmark in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL des Knochens bündig mittlere. Spülen Sie zwei Schienbeine und zwei Oberschenkelknochen von einem einzigen Mausklick in jede 50 mL Tube.
  7. Pipette nach oben und unten mehrere Male oder Wirbel das Knochenmark mit langsamer Geschwindigkeit, Klumpen behutsam zu zerstreuen. Strings von Knochenmark sollte in klein (weniger als 0,5 mm) Flecken von Knochenmark aufgeteilt werden. Füllen Sie das konische Rohr bis 50 mL mit Knochen bündig mittlere. Pipette Inhalt des konischen Rohres in einer Gewebekultur 75 cm2 behandelt Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 1 h.
    Hinweis: Ältere Makrophagen und mesenchymalen Zellen werden an den Kolben und verworfen werden, während die gewünschte hämatopoetischen Vorläuferzellen in der Schwebe bleiben.
  8. Das Medium mit hämatopoetischen Vorläuferzellen in ein 50 mL konische Röhrchen Pipette. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den Überstand und das Pellet in 5 mL Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (MCSF) Kulturmedium Aufschwemmen (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL MCSF und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin 150 μM Monothioglycerol (MTG)).
  9. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer18. Fügen Sie Medium, um Zellen zu einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/mL, 1, 5 x 107 Zellen/Kolben in 30 mL Medium, Aufschwemmen und pipette vorsichtig nach oben und unten hinzu. Pipette 30 mL der Suspension in eine neue 75 cm2 Gewebekultur behandelt Kolben.
  10. Am Tag 4 und 7. Tag nach der ursprünglichen Kultur im Schritt 1,9 überprüfen Sie die Zellen anhaftende und leicht verzweigt mit einem invertierten Phase Kontrast Hellfeld-Mikroskop. Entsorgen Sie das Medium mit den nicht-anhaftende Zellen. Waschen Sie die Zellen mit IMDM einmal und 30 mL MCSF Kulturmedium.
  11. Wenn die Zellen sind Reifen von Tag 10 (> 95 % positiv für F4/80 und Mac-1), noch einmal überprüfen, ob die Zellen sind Anhänger und leicht.
  12. Platte Zellen für Stimulationen, das Kulturmedium aus der Flasche zu entfernen und Hinzufügen von 8 mL Enzym frei, EDTA-basierte Zelle Dissoziation Puffer (Table of Materials). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C, 5 % CO2.
  13. Kratzen Sie Zellen sanft, mit einer kleinen Menge des Drucks, mit einem sterilen Zelle Schaber. Check-in das Mikroskop, das Zellen von der Oberfläche der Küvette getrennt haben. Pipette dissoziiert Zellen in ein 50 mL konische Röhrchen. Spülen Sie den Kolben 3 Mal mit 5 mL IMDM und bündeln Sie die Spüllösung mit Zellen, die geerntet wurden. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min.
  14. Die Zelle Pellet in 3 mL MCSF Kulturmedium pro 50 mL konische Röhrchen aufzuwirbeln. Anzahl vitaler Zellen mit einem Hemocytometer18. Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL und Platte 100 μl Zellsuspension (1 x 105 Zellen/Na) pro Bohrloch einer 96-Well Gewebekultur behandelt, flache Bodenplatte aufzuwirbeln.
    Hinweis: Knochen aus einem einzigen Mausklick erzeugt genügend Zellen für 100 Brunnen. Auf Wunsch können 1 mL der Zellen in einem 6-Well-Platte (Gewebekultur behandelten, flacher Boden) überzogen. Eine größere Anzahl von Zellen (1 x 106 ) kann für western-Blot Analysen nützlich sein.
  15. Sobald anhaftende, doppelte oder dreifacher Brunnen jeweils mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, 30 mg/mL IVIg, oder IVIg + LPS zu stimulieren. Dosen von LPS oder IVIg können titriert werden, um Antworten zu optimieren. Doppelte oder dreifacher Brunnen als unstimulierte Steuerelemente zu verlassen. Inkubieren sie für 24 h (37 ° C, 5 % CO2).
    Hinweis: Neu vergoldete Zellen sollte Gewebekultur Brunnen innerhalb 1 h entsprechen.
  16. Sammeln Sie Zelle Überstände jede Vertiefung in einzelnen 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie Partikel enthält durch Spinnen bei 10.000 x g für 5 min.
  17. Entfernen Sie die Zelle überstand und nicht zu stören das Pellet. Ort der geklärte Zelle in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch überstand.
    Hinweis: Zelle Überstände können Zytokine IL-10 und Zytokin-Untereinheit, IL-12 / 23p 40, durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) sofort untersucht, oder bei-80 ° C langfristig gelagert. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials). Andere Pro-inflammatorische Zytokine kann geprüft werden, wie IL-6 und TNF, wie auch sie durch Behandlung mit IVIg sinken + LPS Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein. Nach der Stimulation können Techniken wie westliche Beflecken oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) 19,20adhärente Zellen vorbereitet sein.

(2) herausfordernd Mäuse In Vivo mit IVIg und Ernte peritoneale Makrophagen

  1. Wiegen Sie jede Maus.
Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht für jede Maus zur Verfügung stellen.
Hinweis: zum Beispiel ist bei einer Maus 20 g 500 µL IVIg erforderlich.
  • Zeichnen die erforderliche Menge an IVIg in eine sterile 1 mL Spritze mit einer sterilen 26 ausgestattet gauge Nadel. Verwalten Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten eine Äquivalentdosis Volumen von sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4 statt IVIg.
  • SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.
  • Legen Sie die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, oben abgeschrägt und Einfügen von 1,5 cm von der Nadel. Injizieren Sie die IVIg oder PBS intraperitoneal. Warten Sie 1 h.
  • Mäuse mit 5 % Isofluran-Narkose gefolgt von 6-8 L/min CO2 Erstickung einschläfern (siehe Schritte 1.1.1 - 1.1.2), oder nach ethischen Richtlinien des Instituts.
  • Heften Sie die Maus, um eine Dämmplatte mit Gliedmaßen ausgebreitet. Sprühen Sie die Teile mit 70 % Ethanol.
    Hinweis: Führen Sie die Prozedur in einer sterilen Kapuze.
  • Machen Sie einen flachen Schnitt in der Haut (0,2 cm) mit einer Schere entlang der Mittellinie der Maus, um zu vermeiden, schneiden die Bauchhöhle. Ziehen Sie die Bauchhaut Ausschalten der Maus Bauch mit Pinzette, damit das Futter von der intakten peritonealen Wand sichtbar ist.
  • Füllen Sie eine 5 mL Spritze mit 5 mL sterilem PBS (pH 7,4). Legen Sie ein 25 oder 27 gauge Nadel an der Spitze des Hohlraums aus entweder links oder rechts in Richtung der Mitte der Maus mit der Schräge der Nadel auf.
    Hinweis: Legen Sie die Nadel vorsichtig in der Maus, so dass Sie PBS nicht in die Organe, sondern vielmehr in den peritonealen Raum injizieren.
  • Drücken Sie die Flüssigkeit in der Bauchhöhle. Ziehen Sie die Nadel aus dem Hohlraum und massieren Sie das Peritoneum für 10 s, alle Zellen zu verdrängen. Stechen Sie die Nadel an der Spitze der Kavität und vermeiden Sie Organe zu. Sammeln und die Lavage-Flüssigkeit erholte sich in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis legen.
    Hinweis: Für jede 5 mL Flüssigkeit injiziert, wird etwa 3,75 mL wiederhergestellt werden.
  • Wiederholen Sie die Injektion und Erholung (Schritte 2,8-2,9) 3 mehr Mal (insgesamt Injektionsvolumen von 20 mL), 15 mL Lavage-Flüssigkeit insgesamt wiederherstellen. Sammeln Sie Lavage jede Maus in einem separaten 15 mL konische Rohr.
    Hinweis: Nach der letzten Injektion kann es einfacher sein, die Flüssigkeit von den weit linken und rechten Seiten der Maus, extrahieren wo Flüssigkeit angesammelt hat. Die Organe werden weniger Interferenzen mit der Nadel an dieser Stelle führen.
  • Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zellen in 500 μL der Beschichtung Medium (IMDM, 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin) per Mausklick geleert. Zählen Sie tragfähige Makrophagen mit einem Hemocytometer18.
    Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen. Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus.
    Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt um sie zu entfernen, mit 1 X roter Blutkörperchen Lyse Puffer nach Anweisungen des Herstellers.
  • Zellen im Medium 1 x 106 Makrophagen/ml Plattieren Aufschwemmen und Platte 100 μL pro Well in eine 96-Well flache Bodenplatte Gewebekultur behandelt.
    Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment, wenn mit dreifacher Brunnen oder Titration Stimulanzien. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich. Gäbe es genügend Zellen für 5 Brunnen oder 1 Experiment in zweifacher Ausfertigung mit einer Dosis von LPS.
  • Inkubieren Sie Zellen für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 zu Makrophagen werden Anhänger. Adhärenten Zellen sind die peritonealen Makrophagen. Entfernen Sie Zelle Überstände und nicht anhaftende Zellen. Spülen Sie die Brunnen zweimal mit 200 μL IMDM (vorgewärmt auf 37 ° C), warten Sie 10 s und langsam kippen die Platte. Ersetzen Sie das Überzug Medium. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 30 min vor der Stimulation der Zellen.
  • Stimulieren Sie die Makrophagen mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, oder lassen Sie unstimulierte als Kontrolle. 24 h inkubieren, sammeln und Zelle Überstände (siehe Schritte 1.16 1.17) für IL-10 Zytokin Analyse von ELISA zu klären. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials).
    Hinweis: Nach Stimulation können adhärente Zellen Techniken wie western-Blot oder PCR vorbereitet sein.

    • (3) herausfordernd Mäuse in Vivo mit IVIg + LPS und Ernte peritoneale Makrophagen

    1. Wiegen Sie jede Maus. Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht bereitzustellen. Berechnen Sie die Höhe der LPS (100 μg/mL Konzentration Lager in IMDM) benötigt, um eine endgültige Dosis von 0,2 μg/g Körpergewicht bereitzustellen.
      Hinweis: zum Beispiel ist für eine Maus 20 g 500 µL der Stammlösung IVIg und 40 μl einer 100 μg/mL Lösung von LPS erforderlich.
    2. Zeichnen Sie die erforderliche Menge an IVIg und LPS in eine sterile 1 mL Spritze, ausgestattet mit einem sterilen 26 gauge Nadel. Ersetzen Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten gleichwertigem Umfang von IVIg mit sterilen PBS pH 7.4.
    3. SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.
    4. Ort die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, Fase, und fügen Sie 1,5 cm. Spritzen die IVIg + LPS, oder PBS + LPS, intraperitoneal wie in Schritt 2.4.
    5. Ernten Sie nach 1h peritoneale Makrophagen durch Schritten 2,5-2.10.
    6. Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. 1 mL der wiederhergestellten Lavage-Flüssigkeit zu entfernen und IL-10 und IL-12 / 23p 40 Analysen von ELISA nach Herstellerangaben verwenden oder Einfrieren bei-80 ° C für zukünftige Analysen.
      Hinweis: Um genauer Vergleich zwischen den Behandlungen für Lavage Fluid Zytokin Analyse zu gewährleisten, führen Sie 5 mL Flushs von der Bauchhöhle 4 Mal für ein finales Volumen von 15 mL. Nicht alle Flüssigkeit wird aus jeder Spülung wiederhergestellt werden.
    7. Wie in Schritt 2.11 Aufschwemmen und tragfähige Makrophagen zu zählen.
      Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen.
    Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus.
    Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt nach Herstellerangaben zu entfernen, wie in Schritt 2.11.
  • Wie in Schritt 2.12, erneut aussetzen Sie Zellen in Galvanik Medium.
    Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich.
  • Wie in 2.13, inkubieren Zellen für 1 h bei 37 ° C 5 % CO2 zu Makrophagen werden Anhänger.
  • Sammeln und konditionierten Medium gemäß Schritte 1,14 1,15, aus allen peritonealen Zellen zu klären.
    Hinweis: Proben können sofort verwendet oder eingefroren und bei-80 ° C für die Zytokin-Analyse von ELISA gespeichert.
  • Führen Sie Schritt 2.11, aber inkubieren Sie Zellen für 24 h unstimulierte. Sammeln und Zelle Überstände nach Schritte 1.16-1.17 für Zytokin-Analyse von ELISA zu klären.
    Hinweis: Zellen können Techniken wie western-Blot oder PCR, wie in den Schritten 1.16 1.17 und 2.14 vorbereitet werden.

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    Ergebnisse

    Murine Knochen Knochenmark abgeleitet Makrophagen können aus Vorstufen der blutbildenden Zellen im Knochenmark Aspiraten kultiviert werden. Knochenmark Aspiraten gebündelt in der Regel vom Oberschenkelknochen und Gebeinen der Mausklick C57BL/6 Ertrag 107 Knochenmark abgeleitet Makrophagen, so dass sie eine günstige Quelle von Makrophagen für Experimente. BMDMs kann verwendet werden, basieren Medikament Antikörperantworten als mit einem Entzündungsreiz in Vitroherausgef...

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Diskussion

    Makrophagen Aktivierung Staaten spielen eine wichtige Rolle in beiden Gewebe Homöostase und Krankheit22. Makrophagen können unterschiedliche sowie überlappende Aktivierungsstatus abhängig von Cues in ihrer Mikroumgebung3haben. Sie haben unterschiedliche Rollen in allen Phasen der Entzündungsreaktion: Verteidigung gegen Krankheitserreger, Wunde heilen und Gewebe Restitution und haben auch eine ausgeprägte entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die wichtig für das Ausschalte...

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    Offenlegungen

    Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

    Danksagungen

    L.k. ist der Empfänger von der University of British Columbia 4-Jahres-Stipendium (4YF) Diplom Zugehörigkeit Award. L.M.S ist der Empfänger der Canadian Association of Gastroenterology / Morbus Crohn und Colitis Kanada / CIHR neue Ermittler Gehalt Award und biomedizinische Stipendiat der Stiftung Michael Smith für die Gesundheitsforschung. Diese Arbeit wurde durch einen Projekt-Zuschuss von Canadian Blood Services in Zusammenarbeit mit der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (gewähren # CIHR2016-LS).

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Iscove' s modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM)Life technologies12440053
    Fötales Rinderserum (FBS)Life technologies12483-020
    Rekombinanter makriner Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF)Stammzelltechnologien78059
    Penicillin-StreptomycinLebenstechnologien15140148
    Monothioglycerin (MTG)Sigma88640
    1X Puffer für die Lyse roter BlutkörpercheneBioscience
    Puffer für die ZelldissoziationLife-Technologien13150016Enzymfreies, auf Hanks basierendes
    (LPS)Sigma aldrichL 4516aus E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)Grifolsaus dem BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin
    IVIg (Gammagard flüssig)Baxter Healthcare Corporationerhalten vom BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin
    IVIg (Octagam)Octapharmaerhalten vom BC Children's Hospital, Transfusionsmedizin
    Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (steril), pH 7,4Lebenstechnologien10010023
    Maus IL-10 ELISABD biosciences555252
    Maus IL-12/23p40 ELISABD Biosciences555165
    Anti-Erk1/2 AntikörperZellsignaltechnologie9101
    Anti-PP38 AntikörperZellsignaltechnologie9211
    Anti-GAPDH AntikörperFitzgerald industries10R-G109A
    26 g NadelBD Biowissenschaften305110
    1 mL SpritzeBD biosciences309659
    10 mL SpritzeBD biosciences309604
    15 mL konisches RöhrchenBD biosciences352096
    50 mL konisches RöhrchenBD biosciences352070
    Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)DiamedSPE155-N
    75 cm2 Gewebekultur-behandelter KolbenBD biosciences353136
    ZellschaberBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386feine Spitze, präparieren 
    SchereVWR82027-582Delicate, 4 1/2"
    HellfeldmikroskopMoticAE31Inverser Phasenkontrast
    Skala Mettler PE 3000
    EDTA-Lipopolysaccharid

    Referenzen

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
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