Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Summary

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Abstract

Echtzeit-dreidimensionale Einzelkorn tracking (RT-3D-SPT) hat das Potenzial, schnell, 3D Prozesse in zellulären Systemen beleuchten. Obwohl verschiedene RT-3D-SPT-Methoden in den letzten Jahren vorgeschlagen haben, bleibt high-Speed-tracking 3D diffundierende Teilchen bei niedrigen Photon Zählraten eine Herausforderung. Darüber hinaus sind RT-3D-SPT-Setups in der Regel komplex und schwierig zu implementieren, Begrenzung ihrer weitverbreitete Anwendung auf biologische Probleme. Dieses Protokoll stellt ein RT-3D-SPT-System namens 3D dynamische Photon Lokalisierung Tracking (3D-DyPLoT), die Partikel mit hoher diffusiven Geschwindigkeit (bis zu 20 µm2/s) verfolgen können bei niedrigen Photon Zählraten (bis 10 kHz). 3D-DyPLoT beschäftigt einen 2D elektrooptischen Deflektor (2D-EOD) und eine einstellbaren akustischen Farbverlauf (TAG) Objektiv zu fahren, die eine einzige konzentrierte sich laser-Spot dynamisch in 3D. In Kombination mit einer optimierten Position Schätzung Algorithmus, kann 3D-DyPLoT auf einzelne Partikel mit hoher Verfolgungsgeschwindigkeit und hohe Lokalisierung Präzision sperren. Aufgrund der einheitlichen Erregung und einzelne Erkennung Pfad Layout ist 3D-DyPLoT robust und einfach einzurichten. Dieses Protokoll beschreibt die 3D-DyPLoT Schritt für Schritt aufbauen. Erstens ist das optische Layout beschrieben. Als nächstes wird das System kalibriert und optimiert durch Raster eine 190 nm fluoreszierende Perle mit piezoelektrischen Nanopositionierer scannen. Schließlich, um Echtzeit-3D tracking-Fähigkeit zu demonstrieren, werden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser verfolgt.

Introduction

Die Entstehung der modernen bildgebenden Verfahren hat ein Fenster um zu sehen, je mehr detaillierte Struktur der zelluläre Phänomene bis hin zum molekularer Ebene geöffnet. Methoden wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)^1,2,3, Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM)^4,5,6,7 , strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)^8,9,10<....

Protocol

1. setup Layout und Ausrichtung

1. Laser-Installation und Kollimation der Tracking-Anregung
   1. Befestigen Sie den Laser auf die optischen Tisch mit einer selbstgebauten Halterung. Die Halterung ist eine einfache Aluminium-Platte mit Befestigungsbohrungen für den Laserkopf und optischen Tisch. Der Laser ist fest eine Metallfassung für Stabilität und Wärmeableitung beizufügen. Verwenden Sie für diese Arbeit 488 nm Festkörperlaser für Beleuchtung (Abbildung 1), obwohl die Wellenlänge ausgewählt werden kann, entsprechen einem bestimmten Fluorophore oder experimentieren. Ein kritischer Faktor ist, dass die Wellenlänge des Laser....

Results

Feste Partikel (Abbildung 4) scannen und frei diffundierende 110 nm fluoreszierende Partikel tracking (Abbildung 5) wurden nach der oben genannten Protokolls durchgeführt. Das Teilchen Scannen erfolgte durch den piezoelektrischen Nanopositionierer und bin Photonen bewegen, während gleichzeitig Berechnung des Partikels Position an jedem Punkt im Scan geschätzt. Der Scan Bild zeigt ein Quadrat von sogar Intensität (

Discussion

Obwohl viele Sorten von 3D Einzelkorn tracking-Methoden in den letzten Jahren entstanden sind, ist robuste Echtzeitverfolgung von high-Speed 3D Diffusion bei niedrigen Photon Zählraten mit einer einfachen Einstellung immer noch eine Herausforderung, die ihre Anwendung auf wichtige biologische Grenzen Probleme. Die 3D-DyPLoT-Methode beschrieben in dieser IP-Adressen diese Herausforderungen in mehrfacher Hinsicht. Erstens sind die Anregung und Erkennung Wege vereinfacht erheblich im Vergleich zu anderen Implementierungen A.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D Elektrooptischer Deflektor	ConOptics	M310A	2 erforderliches
Netzteil für EOD	ConOptics	412	wandelt den FPGA-Ausgang in Hochspannung für EOD
TAG um Objektiv	TAG Optics	TAG 2.0	Wird verwendet, um den Laser entlang der axialen Richtung abzulenken
XY piezoelektrischer Nanopositionierer	MadCity Labs	Nano-PDQ275HS	Wird verwendet, um die Probe zu bewegen, um das Partikel im objektiven Brennvolumen zu fixieren;
Z piezoelektrischer Nanoposiitoner	MadCity Labs	Nano-OP65HS	Wird verwendet, um die Objektivlinse zu bewegen, um dem diffundierenden Partikel zu folgen
Mikropositionierer	MadCity Labs	MicroDrive	Wird verwendet, um Proben grob zu positionieren und auszuwerten
Objektiv	Zeiss	PlanApo	Hohe numerische Apertur für beste Empfindlichkeit erforderlich. 100X, 1,49 NA, M27, Zeiss
sCMOS-Kamera	PCO	pco.edge 4.2	Zur Überwachung der Teilchenposition
APD	Excelitas	SPCM-ARQH-15	Niedrigere Dunkelzahlen vorteilhaft
Field Programmable Gate Array	National Instruments	NI-7852r
Software	National Instruments	LabVIEW
Tracking Anregungslaser	JDSU	FCD488-30
Objektiv	ThorLabs	AC254-150-A-ML	L1
Objektiv	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L2
Lochblende	ThorLabs	P75S	PH
Glan-Thompson Polarisator	ThorLabs	GTH5-A	GT
Halbwellenplatte	ThorLabs	WPH05M-488	WP
Objektiv	ThorLabs	AC254-75-A-ML	L3
Objektiv	ThorLabs	AC254-250-A-ML	L4
Objektiv	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L5
Objektiv	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L6
dichroitischer Spiegel	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	DC
Fluoreszenzemissionsfilter	Chroma	D535/40m	F
10/90 Strahlteiler	Chroma	21012	BS
PBS	Sigma	D8537
190 nm fluoreszierende Nanopartikel	Bangs laboratories	FC02F/9942
110 nm fluoreszierende Nanopartikel	Bangs laboratories	FC02F/10617
Deckglas	Fisher Scientific	12-545A
Powermeter	Thorlabs	PM100D
CMOS	Thorlabs	DCC1545M
Iris	Thorlabs	SM1D12D
Mikroskop	Mad City Labs	RM21