Summary
ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング ライブにプロトコルを提案する.この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供します。
Abstract
セルは、一時的、変化する周囲のセルから様々 な要因によって影響を受けている環境に適切に対応する必要があります。ノッチ シグナル伝達経路は、胚の正常な発達に重要な役割を果たしている細胞間の通信にこのような重要な分子機械のひとつです。この経路を含むウルトラディアン リズムと振動情報のセルに転送が、振動遺伝子における多細胞間相互作用の影響を解明する分子生物学的手法の進歩にもかかわらずチャレンジしておりますダイナミクス。ここでは、光遺伝学的制御と正確な一時的な方法で遺伝子発現パターンのライブ監視を可能にするプロトコルを提案する.このメソッドは正常に、Notch シグナルの細胞内および細胞間の周期的な入力同調固有振動周波数と位相シフト単一セルの解像度であることを明らかにしました。この方法は、多細胞系における動的遺伝子発現プログラムの機能的意義をテストするためのユニークなプラットフォームを提供する、様々 なシグナル伝達経路の動的特徴の解析に適用されます。
Introduction
細胞間通信は、発達過程で胚のパターン形成に重要な役割を果たします。脊椎動物の胚は、体節と呼ばれる体節構造と身体前後軸に沿って分割クロック1と呼ばれる計時時計の制御の下で一時的な精度で形成されています。このプロセス中に、presomitic 中胚葉 (PSM) セルのグループは、定期的に同期的な方法で体節に変換されます。このプロセスは、同期振動遺伝子発現と位相で振動 PSM 細胞同じ距離。振動遺伝子発現の期間は、約 2、3 時間マウス、ゼブラフィッシュでは約 30 分です。PSM 細胞は同期の2,3を失う解離場合が、再集計が、彼らを自己組織化でき、回復、人口同調4細胞間結合が、同期のためのキーであることを示唆振動。
広範な努力では、デルタ Notch 経路のシグナル伝達分子がセグメンテーション時計遺伝子の同期した振動にしっかりと接続されていることを明らかにしました。薬理学的阻害剤や Notch シグナルの遺伝の突然変異は、発振器の人口を desynchronize します。ゼブラフィッシュ、Notch シグナル コンポーネント、DeltaC、DeltaD、Notch1a などの変異体は、非同期振動5,6を表示します。ひよこやマウス胚では、ノッチ リガンド デルタ 1 に似た (Dll1) だけでなく、ノッチ変調器狂気フリンジ (Lfng) が同期した振動7,8,9に必要です。しかし、それされているセルからセルに動的な情報転送のためのような分子の機能をテストすることは困難摂遺伝子調節動態の時空間解像度を調査するための不足のため、2-3 h (ウルトラディアン リズム) の時間スケールのプロセス。
最近、哺乳類細胞10の遺伝子の発現パターンを制御し、監視する統合的な手法を開発しました。この技術によりウルトラジアン リズムの時間スケールで定期的な照明、遺伝子式パルス誘導します。このプロトコルは、感光性細胞ラインを確立し、細胞間コミュニケーションの文脈で監視ライブ セル発光によるレポーター細胞の動的応答を観察する方法を表します。このメソッドは、他の多くのシグナル伝達経路の解析に適用されます。
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Protocol
1. メダカ Tol2 システムによる安定したセルラインの世代
-
トランスポザーゼ (メダカ Tol2) 発現ベクター (pCAGGS mT2TP) とともにメダカ Tol2 ベース光モジュールのプラスミッドのベクトル (図 1 a) を transfect C2C12 細胞に。すべての手順 10% 牛胎児血清 (FBS) と 5% CO2、そうでなければ示される存在下で 37 ° c (表 1)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン DMEM 培と培養細胞で
- 細胞カウンターと細胞をトリプシンと/12 ウェル プレートのウェル プレート 5 × 104 C2C12 細胞にトランスフェクション前日をカウントします。
- リポフェクション試薬を用いた transfect メダカ Tol2 ベース光遺伝学的ベクトル (pAI177 または pAI218)、薬物選択ベクトル (pAI170) の 0.125 μ g と 0.5 μ g pCAGGS mT2TP ベクトルの 0.375 μ g が共同。
- Trypsinize transfected セルやトランスフェクション後 1 日 100 mm 培養皿にそれらを板します。
- 100 mg/mL hygromycin 添加培養液中に transfected セルの培養液を交換します。
- 非 transfected セルを除去するために 3 日間の培養細胞。中型の変更は必要ないことに注意してください。
- Trypsinize transfected セルと選択のための蛍光タンパク質を発現する細胞の人口を浄化します。受信機電池 pAI177 を運ぶ、グリーン PE チャネル mCherry 陽性細胞の人口の浄化のために並べ替えのゲートを設定します。送信者感光性細胞 pAI218 を運ぶ、APC チャネル iRFP713 陽性細胞の人口の浄化のために並べ替えのゲートを設定します。
- (省略可能)限られた希釈または単一細胞の FACS によるソートなどの標準的な方法によって栄養系セル人口を確立します。
2. 人口レベルで設計された細胞の写真感度の評価
注: この部分では、生化学的な試金、qPCR など西部にしみが付くことによって青色光照明に Dll1 ligand 蛋白質の動的誘導を確認するプロトコルについて説明します。
- 光誘起条件あるいは暗条件のためのインキュベーター光源の有無の 2 種類をそれぞれ設定します。青色 LED トランス-照明、図 1 bに示すように光メーターを使用しての光強度をセットアップします。プログラムのタイミングと、シングル ボード マイクロ コント ローラー照明 (図 1) のプログラム可能なスケジュールを可能に制御スクリプトをロードすることによって光照射の期間。
- 細胞カウンターと細胞をトリプシンと pAI218 と 35 mm 径プラスチック文化料理 (光条件の以上 12 の料理、暗条件の 1 皿) に pAI170 を運ぶ板 1.0 x 105感光性送信者セルをカウントし、料理闇/光の条件のためのインキュベーターを区切ります。料理の設定後、セル lysates の収集まで閉鎖インキュベーターのドアを保ちます。
- めっき後, 1 日開始光照射 (電池は 80% 以上に期待されて合流)。望ましくない光刺激を避けるために光に細胞を公開しないでください。
注: 照明用スケジュールは、実験の目的によって異なります。注意持続的な照明条件 (e.g。 光強度 40 µmol/m2/s で 1 分持続時間と 10 分間隔) は十分な写真誘導とその強い光の簡単なチェックは細胞に有害であります。したがって、照明のための無害なパラメーターが選択されていることを確認します。 - メッキ後、約 2 日間を 30 分間隔で細胞ライセート準備します。氷に、さらなる分析のためのセル lysates の準備を開始、インキュベーターから料理を移動します。
3. 動的送信者-受信者人口レベルの試金: 光電子増倍管による光刺激に応じて細胞応答のリアルタイム モニタ リング
- Trypsinize し、標準的な方法で送信者と受信機のセルの数をカウントします。5送信者細胞 (比率 1:5) 104受信機と 1.25 x 10 x 2.5 の懸濁液を混合の 1 mL の容量を準備します。
注意: 2:1、1:1 または 1:2 送信者と受信者間の比も動作 1.5 x 10 の総細胞数5。10 - 板 1 mM ルシフェリンを含む培養液中で 24 ウェル ブラック プレートの各ウェルに細胞を混合します。
- ルシフェラーゼ アッセイ用のプレート リーダーの細胞を分析し、出力信号が記録システムのあまり高くはないことを確認します。
注: 出力信号は 1 x 106光子数/秒より高い場合は、彼らを飽和可能性があります。出力信号が 1 x 106光子数/秒よりも低い場合、最適な値にルシフェリンの濃度を低減します。 - 記録システムのプレートを設定し、録画プログラム (図 1) を開始します。たとえば、記録を設定した後 18 時間で光照射を開始します。
注: トレンド除去信号平均化とサビツキー ・ ゴーレイ フィルター、移動などの時間フィルタ リングは、ウェーブ フォームの可視化に役立ちます、ピークが検出されました。
4. 単一細胞レベル動的に送信者と受信者間の試金: リアルタイム光遺伝学的摂動の制御の下で単一細胞応答のイメージング
- プレート 0.5 x 105受信機と 2.5 倍の 27 mm 径ガラス基 35 mm 直径の皿に 105送信者細胞。その混合の割合と総細胞数 (セル密度) が正しく調整されことを確認します。
- めっき後の 1 日は記録媒体の 2 mL の培地を交換 (- フェノールレッド フリー DMEM 培 5 %fbs、ペニシリン ・ ストレプトマイシンと 1 mM ルシフェリン)、し、顕微鏡のガラス ベース料理を設定。必要に応じて、PBS (-) で死んだ細胞の残骸を洗い流します。
注: それは暗い状態でこの手順を実行することが望ましいです。 - 37 ° C、5% CO2環境チャンバーを搭載した倒立顕微鏡を設定します。
- 冷却 CCD カメラを設定します。CCD センサーの温度が送信先の値 (通常は、-90 ° C) まで冷却されることを確認します。
-
288 以上と 5 分間隔で画像をキャプチャする自動獲得ソフトウェアで「多次元タイムラプス」ウィンドウ パラメーターを設定 (1 つ以上一晩記録) 回。
- 「多次元タイムラプス」ウィンドウを開き発光チャンネルと遅い 50 kHz 読み出しモード プルダウン ・ メニューから選択 4 × 4 の 4 分露出でビニング設定。読み出しモードが弱く発光生物発光を検出する読み出しノイズを減らすために不可欠な 50 kHz の低速モードに設定されているを確認します。
- 「多次元タイムラプス」ウィンドウを開き蛍光チャンネル、高速の 1 MHz 読み出しモードをプルダウン ・ メニューから選択 2 × 2 の 400 ms 露出とビニングします設定。読み出しモードは、蛍光イメージングに必要な時間を短縮する高速の 1 MHz モードに設定されていることを確認します。
- 時間経過「取得」ボタンをクリックして録音を開始します。
- コマ撮り映画からの発光チャンネルの単一セルのトレースを画像解析ソフトで、次のとおり抽出します。まず、発光と蛍光画像をスタックを画像解析ソフトに画像データをインポートしてください。発光イメージ (「SpikeNoise フィルター」として実装)、前と次のフレームの時間のなかにピクセル値を置き換える、一時的に隣接する画像のピクセルの強度を比較することにより宇宙線由来のホット ピクセルを削除します。これらの加工イメージを空間的に平滑化フィルターに適用し、各フレームから out-field ビューの背景のピクセル値を減算します。その後、「関心領域」を決定 (ROI) 各時点で蛍光画像をセルごとに発光画像に ROI を適用し、各 ROI の発光強度を測定。
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Representative Results
我々 は、ライトン システム11,12, 2-3 h の周期性をもつ遺伝的発振器の研究の哺乳類細胞における光誘起遺伝子発現を可能にする適応。このシステムは 2 つの部分の構成: 写真誘導性の転写活性化因子 hGAVPO および興味の任意の遺伝子の転写をドライブする UA プロモーター カセット。光誘起遺伝子発現の拍動の速度を加速するには、UA プロモーター カセットのポリア シーケンスはマウス Hes1 3' UTR 20 分マウス線維芽細胞で mRNA の半減期を短くと取替えられました。
安定したセルラインを確立、メダカ Tol2 転移システムに基づいて cistronic トライ ベクトルだった使用13 (図 1 a)。メダカ Tol2 発現ベクターは、プラスミド カセット14染色体統合の効率性の向上に不可欠です。それらのベクトルは、UAS プロモーターによって駆動される光誘導性遺伝子の発現カセットだけでなく、(iRFP71315または mCherry) の感光性タンパク質 hGAVPO と蛍光タンパク質の発現カセットを運ぶ。この設計では、ホストのゲノムに、プラスミドを効果的に統合セルの人口の浄化することができました。
青い照明 (図 2 a) に Dll1 ligand 蛋白質を作り出す送信者感光性細胞を設立しました。このため、メダカ Tol2 系 bi cistronic ベクトル (pAI218) が使用されました。光照射時に Dll1 を配位子の誘導を確認するには、細胞は図 1 bと1 Cに示すようにプログラムされた LED 青色光のソース搭載インキュベーターで培養しました。西部のしみが付く分析によって検出された光誘起 Dll1 タンパク質発現ダイナミクスの代表の結果は、図 2 bおよび2 Cに表示されます。
Notch シグナル入力に反応する細胞を確立するためにメダカ Tol2 系 bi cistronic ベクトル (pAI177)、ホスホ グリセリン酸及びノッチ エフェクター遺伝子Hes1プロモーターの制御下で不安定化ルシフェラーゼ レポーターを運ぶキナーゼ (PGK) プロモーターに駆動される核局在赤蛍光レポーター H2B mCherry。この場合、蛍光レポーターは浄化と単一細胞タイムラプス顕微鏡の追跡に便利です。
細胞写真誘導送信者と受信機細胞が正常に確立されると、これらの細胞 (図 2 a) の混合養殖による動的な送信者と受信者間の分析を実行する準備が整いました。このアッセイでノッチ ligand 蛋白質を表現送信者感光性細胞青色光照射時に Dll1 が内因性 Hes1 発振器と発光 Hes1 記者 (運ぶ写真を区別しない受信機細胞との共培養pHes1-dLuc) (図 2 D)。受信機細胞は内生、Dll1 隣接する細胞によって提示されるへの応答である Notch 受容体を発現します。
図 2 eおよび2 fに動的に送信者と受信者間の試金の典型的な結果を示します。発光記録受信機電池の動的応答を検出するためには光子計数と光刺激 (の LED 青色光ソースのための高感度写真-増倍管 (PMT) 装備住セルイメージ監視システムを使用する最初図 1)。このシステムは、スケジュールされた照明の人口レベルで発光信号をリアルタイム録音できます。ときこれらの 2 種類の細胞共培養し、反復的な光照射 (30 秒期間、2.5 h の間隔) にさらされる、受信機細胞の循環応答混合比率 (図 2 e) の様々 な条件で検出しました。この例では、サビツキー ・ ゴーレイ フィルター (4th順序および 13 のデータ ポイント ウィンドウ) ノイズの多い信号を減衰させるを適用されます。反復的な照明 (2 分持続期間、2.75 h 間隔) と微速度顕微鏡観察はまた受信機細胞単一細胞レベル (図 2 fに灰色の線) および人口レベル (図の赤い線の同期応答を明らかにしました。2 階). 送信者セルの Dll1 蛋白質の周期的な発現が隣接する受信機細胞におけるHes1振動を同期するための十分なことが示唆されました。
図 1: 光摂動により細胞の応答を分析する方法です。このプロトコルで使用される代表的なプラスミッドのベクトルの(A)の模式図。これらのプラスミッドはリクエストを承ります。(B) 6 も細胞培養プレートの下で青い LED デバイスを備えた CO2インキュベーターの写真。(C)電源を制御する電気回路の回路図は、プログラム可能なマイクロ コンピューターによる LED 光源の供給します。ソリッドステート リレー (SSR) は、オン/オフ オン/オフ LED 光源の状態にマイクロ コンピューターのデジタルの入出力の状態を中継に設定されました。(D)写真と生細胞生物発光モニタリング システムの模式図。なお、電動ステージ上に LED 光源の照明位置に PMT 検出器の上に録音の位置から一方向に移動できます。また、PMT 検出器は、個々 の井戸からの信号を監視するためにも同様にから移動することメモ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 光摂動実験の例です。これらの例では、マウス C2C12 筋芽細胞のセルラインが使用されました。(A)動的に送信者と受信者間の試金の模式図。(B, C)西部のしみが付く分析を行った光誘起 Dll1 式の代表の結果。Dll1 蛋白質は、2.5 時間、持続時間 2 分 24.7 W/m2の輝度と定期的な光照射によって誘導されました。送信者と受信者の細胞の共培養システムの(D)蛍光イメージ。(E, F)動的に送信者と受信者間の試金の典型的な結果を。(E) 、PMT. を備えた住セルイメージ監視システムによって記録された受信応答の時空間パターン総細胞数は、1.5 倍の 10 の5セルに修正されましたが、送信者と受信者の間の比は 5:1 から 1:2 に配られました。(F)単一細胞イメージングは、振動については、定期的な照明 (2 分持続期間、2.75 h 間隔) によって引き起こされ、移った送信者から受信機のセルに明らかにしました。1.5 倍の送信者に受信機比 5:1 の 10 の5細胞は使用されました。文献 10 より適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 は 2-3 h の周期性と遺伝子発現ダイナミクスを制御する手法を示した。このタイム スケールはテトのシステムと元のライトン システムなどを含む他の従来のものよりもはるかに短い。ウルトラジアン リズムの時間スケールに到達するための重要なパラメーターは、光誘起分子製品、Mrna、タンパク質の半減です。これらの速度論的パラメーターは、セルタイプおよび種によって異なります。速度をチューニングするには、シーケンスおよびターゲット蛋白質の機能は変わりませんのでストレートな方法は、Hes1 3' UTR シーケンスを他の人と交換します。他 3' 望ましい拍動パターンに特に興味のセルを取得する UTRs を求めて、生細胞の誘導灯で dLuc の監視は良い出発点、審査と検証に使用します。
最もよく寄せられる質問の 1 つは光感受性細胞の毎日の処理についてです。Notch シグナルの動的な送信者と受信者間の試金、場合体制 (写真誘導 dLuc Dll1 セルおよび受信機細胞) は、細胞増殖を変更できず、すぐに休憩に戻るできないので部屋のライトの下で細胞の通路を毎日行うことができました暗い状態に細胞が移動された後 6 時間以内の状態。したがって中に望ましくない光摂動を避けるために赤い光環境の設定が不可欠です興味のある遺伝子は運命決定因子である場合と漏れやすい表現は細胞分化を誘導したり、細胞の拡大を防ぐためセルの処理。
このプロトコルでは、我々 は写真誘引可能な遺伝子発現カセットを安定したセルラインを生成するための手順を提示しました。これは、動的な送信者と受信者間のアッセイで信頼性の高い結果を得るための重要なステップです。1 つはトランスフェクション細胞への光モジュールの導入を検討することが、ウルトラディアン パルスの量的な測定のための我々 の手でよく働かない。その暗い条件下でも比較的高いレベルで漏れやすい表現に UA プロモーター カセット リードを運ぶプラスミッドのトランスフェクションがわかった。この漏洩式任意の光刺激せず高いバック グラウンドを引き起こすため、時間経過の正確な測定を妨げます。安定した細胞を確立するための代替メソッドは、トランスフェクション12に適さない種類の細胞に適しているレンチ ウイルス システムです。クローン細胞株現在異種細胞株よりもより均一な応答が、クローン集団でも細胞の応答は常に制服: いくつかの細胞では、光による光刺激とそのための分散のレベルを提示するが応答しません。蛋白質の表現。HGAVPO 蛋白質や変数内因性豊かなフラビン、hGAVPO の光センシングに必要な発色団の可変式レベル可能性があります。
ここで提示されたプロトコル遺伝子発現ダイナミクスの解析のための強力なツールを提供しますが、いくつかの制限があります。1 つの欠点は、生細胞の顕微鏡検査のためのいくつかの蛍光チャネルが青色光刺激と互換性がないことです。青色光照明はブルー光感受性タンパク質だけでなく、緑と黄色蛍光蛋白質 (受けたおよび YFPs)、されやすいを含む蛍光蛋白質をアクティブに写真漂白します。逆に、GFP の可視化には、青色光励起蛍光画像をキャプチャ中に感光性細胞の好ましくない活性化を引き起こす可能性がありますが必要です。明視野 (位相) 周囲の光源によるイメージングはまた、青色光の光遺伝学的実験と互換性が、イメージングの緑以上の波長の光源を使用してこの問題を回避することができます 1 つ。
動的に送信者と受信者間の試金は他のシグナル伝達経路を調査するために有用であります。1 つの可能性は、システムのシグナルを分泌するアプリケーションです。そのような分析のため、正確な一時的な方法16,17受信機細胞を刺激する方法は、精製有機配位子のマイクロ流体デバイスを適用します。ただし、これらのアプローチは送信者細胞におけるリガンド分子の動的生産プロセスにアクセスできません。一緒に写真誘導リガンド式動的送信者-受信者アッセイを採用できるようになるさらに信号伝送の解剖送信者から受信機細胞。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、進化科学技術 (JPMJCR12W2 (R.K.))、革新的な地域 (文部省、文化、スポーツ、科学、および技術 (文部科学省)、日本の科学研究費補助金科学技術振興機構、さきがけ (人工知能)、コア研究によって支えられました。26119708 (人工知能) と 16 H 06480 (R.K.))、科学 () (日本学術振興会 (JSPS) 24240049 (R.K.))、研究、若手研究 (A) (日本学術振興会 15 H 05326 (人工知能)) と、新学術研究領域「蛍光ライブ イメージング」文部科学省、日本、そしてプラットフォームの動的アプローチの生活システムを文部科学省、日本から。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
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