Summary
Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.
Abstract
Hücreleri düzgün geçici hücreleri çevreleyen gelen çeşitli faktörler tarafından etkilenmiştir ortamlar değişen yanıt vermesi. Yol sinyal çentik gibi temel moleküler makine normal embriyo gelişiminde önemli roller oynayan hücre hücre iletişim için biridir. Bu yolu bir hücre hücre transfer ultradian ritimleri ile salınım bilgi içerir, ancak moleküler biyoloji teknikleri ilerlemeye rağmen bu çok hücreli etkileşimler salınım gen üzerinde etkisini aydınlatmak için zor oldu dinamiği. Burada, optogenetic kontrol ve canlı gen ifade şekillerinin kesin bir zamansal biçimde izleme izin veren bir protokol mevcut. Bu yöntem başarıyla çentik sinyal, hücre içi ve hücreler arası periyodik giriş frekans ayarlama ve tek hücreli çözünürlükte değişen faz tarafından iç salınımlar trene binmek ortaya koydu. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlayan çeşitli sinyal yolları dinamik özelliklerini analiz için geçerlidir.
Introduction
Hücre hücre iletişim gelişim süreçlerinde embriyonik desenlendirme kritik rol oynamaktadır. Omurgalı embriyo metameric yapıları somites olarak adlandırılan bölümleme saat1adı verilen bir zaman tutma saat kontrol altında kesin bir zamansal doğruluk ile ön-arka gövde ekseni boyunca oluşur. Bu işlem sırasında bir grup presomitic mesoderm (PSM) hücre düzenli olarak dönüştürülür somites zaman uyumlu bir şekilde. Bu işlem eşzamanlı salınım gen ekspresyonu içerir ve aynı somites aşamasında salınım PSM hücreleri oluşturur. Salınım gen ekspresyonu yaklaşık 2-3 h farelerde ve yaklaşık 30 dk içinde Zebra balığı dönemidir. Ayrışmış PSM hücreleri senkronizasyonu2,3kaybetmek, ama yeniden toplanmış oldukları zaman, onlar kendi kendine organize etmek ve nüfus senkronizasyonu4hücre-hücre kaplin eşitlenmiş için bir anahtar olduğunu düşündüren, yeniden elde etmek titreşimler.
Geniş çabaları Delta-çentik yolu sinyal molekülleri segmentasyon genlerine eşitlenmiş salınım için sıkıca bağlandığından emin saptandı. Farmakolojik inhibitörleri veya çentik sinyal, Genetik mutasyonlar osilatörler nüfusu desynchronize. Zebra balığı, DeltaC, DeltaD ve Notch1a, gibi bileşenleri sinyal çentik mutantlar zaman uyumsuz salınımlarını5,6görüntüler. Eşitlenmiş salınımlarını7,8,9için piliç ya da fare embriyo, sadece çentik ligand Delta-like1 (Dll1) aynı zamanda çentik modülatör deli fringe (Lfng) gereklidir. Gen düzenlemesi dinamikler geleneksel pertürbasyon zamansal çözünürlük araştırmak için yeterli değildi çünkü ancak, hücre hücre böyle molekülleri dinamik bilgi aktarımı için fonksiyonel yeteneğini test etmek zor olmuştur zaman ölçeği 2-3 h (ultradian ritimleri) süreçleri.
Biz son zamanlarda kontrol ve monitör gen ifade desenleri memeli hücreleri10entegre bir yöntem geliştirdik. Bu teknoloji, ultradian zaman-ölçeklerde periyodik ışık aydınlatma tarafından gen ifade darbeleri indüksiyon sağlar. Bu iletişim kuralı ışığa duyarlı hücre hatları kurmak ve hücre-hücre iletişim bağlamlarda izleme canlı hücre ışıldama tarafından muhabiri hücre dinamik yanıtlar gözlemlemek için yöntemleri gösterir. Bu yöntem diğer birçok sinyal yolları analiz için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. nesil istikrarlı hücre hatları ile Tol2 sistemi
-
Plazmid vektörel çizimler (şekil 1A) transposase (Tol2) ifade vektör (pCAGGS-mT2TP) ile birlikte optogenetic Tol2 tabanlı modüllerin C2C12 hücrelere transfect. Tüm adımlar, kültür hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve penisilin-streptomisin 37 ° c (tablo 1), aksi takdirde belirtilen % 5 CO2, huzurunda ile takıma DMEM orta ile.
- Trypsinized hücreleri hücre sayacı ile ve iyi bir 12-şey plaka başına plaka 5 x 104 C2C12 hücre transfection önce bir gün sayısı.
- Optogenetic Tol2 tabanlı vektörel çizimler (pAI177 veya pAI218), 0,125 μg ilaç seçimi vektörünün (pAI170) ve pCAGGS-mT2TP vektör 0.5 μg 0.375 μg lipofection reaktif kullanarak ortak transfect.
- Transfected hücre trypsinize ve onları bir gün transfection sonra 100 mm kültür yemekleri plakası.
- Exchange kültür orta kültür 100 mg/mL hygromycin ile desteklenmiş orta transfected hücreler için.
- Kültür hücreleri un transfected hücreleri ortadan kaldırmak 3 gündür. Orta değiştirmek gerekli olmadığını unutmayın.
- Transfected hücre trypsinize ve floresan proteinler seçimi için ifade hücreleri nüfusu arındırmak. PAI177 taşıyan alıcı hücreler için sıralama kapısı arıtma mCherry pozitif hücre nüfusunun yeşil-PE kanala ayarlayın. PAI218 taşıyan fotoğraf duyarlı gönderen hücreler için sıralama kapısı arıtma iRFP713 pozitif hücre nüfusunun APC kanala ayarlayın.
- (isteğe bağlı) Klonal hücre nüfus sınırlı seyreltme veya tek hücreli FACS tarafından sıralama gibi standart yöntemleri kurmak.
2. fotoğraf-nüfus düzeyinde mühendislik hücreleri hassasiyeti değerlendirilmesi
Not: Bu bölümü qPCR ve Western Blot gibi biyokimyasal testleri tarafından mavi ışık aydınlatma üzerine Dll1 ligand proteinlerin dinamik indüksiyon kontrol etmek için bir protokolünü açıklar.
- İnkübatörler veya ışık kaynakları olmadan ışık kaynaklı koşul veya karanlık bir koşul için iki tür sırasıyla ayarlayın. Set-up ışık-yoğunluğu bir mavi LED trans-ışık ölçer kullanarak ışığı, şekil 1B, gösterildiği gibi. Program zamanlamaları ve bir tek platalı mikro-denetleyicisine aydınlatma (şekil 1 c) için programlanabilir programları sağlayan bir denetim komut yükleme tarafından Işık Aydınlatma süresi.
- Hücre sayacı ile trypsinized hücreleri ve pAI218 ve pAI170 35-mm çaplı plastik kültür yemekleri (ışık durumu için 12'den fazla yemekler ve karanlık durum için 1 çanak) taşıyan plaka 1.0 x 105 fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri saymak ve bulaşıkları ayarla İnkübatörler karanlık/ışık koşulları için ayırın. Yemekler kadar ayarladıktan sonra hücre lysates toplama kadar kapalı İnkübatörler kapıları tutun.
- Bir buçuk gün sonra kaplama, başlangıç ışık aydınlatma (hücrelerin % 80'den fazla olması bekleniyor Konfluent). İstenmeyen fotoğraf-stimülasyon önlemek için gün ışığına yapan hücreleri göstermek yok.
Not: Aydınlatma için zamanlama deneyler bilerek bağlıdır. Unutmayın bir sürekli aydınlatma koşulu (e.g. 1-min süresi ve 10 dk aralıklarla 40 µmol/m2/s ışık-yoğunluğu ile) fotoğraf-indüksiyon ve o güçlü ışık aydınlatma basit bir denetim hücrelere zararlıdır için yeterlidir. Böylece, aydınlatma için zararsız parametreleri seçili olduğuna emin olun. - Yaklaşık 2 gün sonra kaplama, cep-lysate 30 dk aralıklarla hazırlayın. Örnek yemekleri İnkübatörler on Ice ve hücre lysates daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlanıyor başlangıç için hareket ettirin.
3. dinamik Gönderici-alıcı tahlil nüfus düzeyinde: Devresel_ödeme tarafından optik stimülasyon üzerine hücresel tepkilerin gerçek zamanlı izleme
- Trypsinize ve standart yöntemlerle göndereni ve alıcısı hücre sayıları saymak. 1-mL süspansiyon 2, 5 x 104 alıcı ve 1,25 x 105 gönderen hücreleri (1:5 oranı) karıştırma Toplam hacim hazırlayın.
Not: iş 2:1, 1:1, ya da 1:2 Gönderici-alıcı oranları da 1.5 x 10 toplam hücre sayısı ile5. 10 - Plaka kültür orta ile 1 mM biyoluminesans içeren hücrelerde 24-şey siyah plakaların her şey karışık.
- Plaka okuyucu luciferase tahlil için hücrelerdeyse analiz ve çıkış sinyalleri kayıt sistemi için çok yüksek olmadığını doğrulayın.
Not: Eğer çıkış sinyalleri 1 x 106 foton sayar/sn yüksek, onlar doymuş. Bu durumda, çıkış sinyalleri 1 x 106 foton sayar/sn düşük olan biyoluminesans en uygun değerlere konsantrasyonu azaltma. - Plaka üzerinde kayıt sistemi ayarlayın ve bir kayıt programı (şekil 1 d) başlatın. Örneğin, ışık aydınlatma 18 h kayıt ayarladıktan sonra başlar.
Not: Geçici filtreleme ortalama ve Çetinkaya-deniyordun filtreleme, hareketli detrending sinyalleri gibi dalga formları görselleştirme için yararlı ve tespitlerde zirve.
4. dinamik Gönderici-alıcı tahlil tek hücre düzeyinde: gerçek zamanlı Optogenetic pertürbasyon kontrol altında tek hücreli tepkilerin görüntüleme
- Plaka 0.5 x 105 alıcı ve 2. 5 x 27, mm, çapı, cam, taban 35 mm çap yemekleri üzerine 105 gönderen hücreleri. Bu karışım oranları ve bir toplam hücresini sayı (bir hücre yoğunluğu) doğru olarak ayarlanır emin olun.
- Bir gün kaplama sonra orta kayıt orta 2 mL ile döviz (fenol kırmızısı ücretsiz DMEM orta % 5 ile desteklenmiş FBS, penisilin-streptomisin ve 1 mM biyoluminesans) ve cam-base çanak mikroskobunun ayarlayın. Gerekirse, PBS (-) ile ölü hücreleri enkaz dışarı yıkamak.
Not: Bu adımı karanlık bir durumda yapmak için tercih edilir. - Bir çevre odası 37 ° C ve % 5 CO2ile donatılmış bir ters mikroskobu ayarlayın.
- Soğutulmuş bir CCD kamera ayarla. CCD sensör sıcaklığını hedef değeri (genellikle,-90 ° C) soğuduktan emin olun.
-
Otomatik Alım yazılımında görüntüler 5 dk aralıklarla ve daha fazla 288 yakalamak için "Çok boyutlu Timelapse" pencere için parametreleri belirleme (birden fazla gecede kayıt) zamanlar.
- "Çok boyutlu Timelapse" penceresini açın, bir ışıldama kanal ve yavaş 50 kHz okuma modu aşağı açılır menüden seçin ve 4 x 4 4-min pozlama ile binning ayarla. Okuma modu zayıf yayan kollarındaki ışık algılamak için okuma sesleri azaltmak için önemlidir yavaş 50 kHz modu için ayarlandığından emin olun.
- "Çok boyutlu Timelapse" penceresini açın, Floresans kanalları ve hızlı 1 MHz okuma modu aşağı açılır menüden seçin ve 2 x 2 400 ms pozlama ile binning ayarla. Okuma modu hızlı 1 MHz moduna Floresans görüntüleme için gereken süreyi azaltmak için ayarlandığından emin olun.
- "Al" düğmesini tıklatarak kayıt hızlandırılmış başlatın.
- Tek hücreli izleri ışıldama kanalları hızlandırılmış film görüntü analiz yazılımı tarafından aşağıdaki gibi ayıklayın. Öncelikle, ışıma ve floresan yığın görüntüleri görüntü analiz yazılımı için görüntü veri alarak olun. Işıma görüntüler için gelen kozmik ışınları zamansal ortalamasına ("SpikeNoise filtre" olarak uygulanan), önceki ve sonraki kare piksel değerlerini yerine geçici bitişik görüntülerde piksel yoğunluklarda karşılaştırarak elde edilen sıcak piksel kaldırmak Bu işlenmiş görüntüler bir dağınık şekilde düzeltme uygulamak ve arka plan piksel değerlerini out-field sayısı her çerçeveden çıkarın. Sonra bir "bölge" ilgi belirlemek (ROI) her hücre, her zaman bir noktada floresan image için yatırım Getirisi Işıksaçan resimler için geçerlidir ve her yatırım Getirisi Işıksaçan yoğunluğunu ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu ile 2 - 3 h periodicity genetik osilatörler çalışma memeli hücrelerinde sağlayan aydınlatacağı sistemi11,12, uyarlanmış. Bu sistemi iki bölümden oluşur: fotoğraf-indüklenebilir transkripsiyon harekete geçirmek hGAVPO ve sürücü transkripsiyon ilgi rasgele genlerin için UAS organizatörü kaset. Fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu pulsatil Kinetik hızlandırmak için UAS organizatörü kaset polyA sırayla fare Hes1 3' UTR, fare fibroblastlar içinde 20 dk mRNA yarı ömrü kısalır tarafından değiştirildi.
Tri-cistronic vektörler Tol2 transposase sistemi temelinde istikrarlı hücre hatları kurmak, kullanılan13 (şekil 1A) oldu. Tol2 ifade vektör plazmid kaset14kromozom entegrasyon verimliliği arttırmak için esastır. Bu vektörel çizimler sadece da fotoğraf duyarlı protein hGAVPO ve floresan proteinleri (iRFP71315 veya mCherry) ifade kaset UAS-düzenleyici tarafından tahrik ışık-indüklenebilir genlerin ifade kaset taşırlar. Bu tasarım etkili plazmid ana bilgisayar genleri entegre hücreleri nüfusu arındırmak izin verdi.
Dll1 ligand proteinler mavi ışık aydınlatma (şekil 2A) üzerine üretmek fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri kurduk. Bu amaçla, bir Tol2 sistemi tabanlı BI cistronic vektör (pAI218) kullanılmıştır. Dll1 ligand ışık aydınlatma üzerine indüksiyon denetlemek için hücre içinde gösterilen şekil 1B ve 1 Cprogramlanmış LED mavi ışık kaynakları ile donatılmış İnkübatörler kültürlü. Dll1 protein ifade dinamikler fotoğraf kaynaklı Western Blot analizi ile tespit temsilcisi sonuçları şekil 2B ve 2 Cgösterilir.
Giriş sinyal çentik için yanıt hücreleri oluşturmak için biz bozulma luciferase muhabir çentik efektör gene Hes1 ve phosphoglycerate organizatörü kontrol altında taşıyan bir Tol2 sistemi tabanlı BI cistronic vektör (pAI177) kullanılan kinaz (PGK) organizatörü tahrik çekirdeği lokalize kırmızı floresan muhabir H2B-mCherry. Bu durumda, floresan muhabir arıtma ve tek hücreli hızlandırılmış mikroskobu izleme için yararlıdır.
Fotoğraf-indüklenebilir gönderen hücreleri ve alıcı hücreler başarıyla oluşturulduktan sonra bu hücreler (şekil 2A) ortak kültür tarafından dinamik Gönderici-alıcı tahlil gerçekleştirmek hazırdır. Bu tahlil, çentik ligand protein Hızlı fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri Dll1 mavi ışık aydınlatma üzerine taşımak endojen Hes1 osilatör ve bir bioluminescence Hes1 muhabir (fotoğraf-duyarlı alıcı hücrelerle birlikte kültürlü pHes1-dLuc) (şekil 2B). Alıcı hücreler komşu hücreleri tarafından sunulan Dll1 duyarlı olduğu çentik reseptör endogenously hızlı.
Dinamik Gönderici-alıcı deneyleri temsilcisi sonuçları şekil 2E ve 2Fgösterilir. Biz ilk foton sayma ve ışık stimülasyon ( için bir LED mavi ışık kaynağı için bir yüksek-duyarlı Foto-çarpanı tüp (PMT) ile donatılmış bir canlı hücre izleme sistemi bioluminescence kaydıyla alıcı hücrelerin dinamik yanıtlar algılamak için kullanılan Şekil 1 d). Bu sistem bioluminescence sinyalleri zamanlanmış ışık aydınlatma ile nüfus düzeyinde gerçek zamanlı kayıt sağlayan. Hücreler bu iki tür ortak kültürlü ve tekrarlayan ışık aydınlatma (30 s süresi, 2,5 h aralıklarla) maruz, alıcı hücreleri döngüsel yanıt oranları (şekil 2E) karıştırma çeşitli koşullarda tespit edildi. Bu örnekte, biz Çetinkaya-deniyordun (4th sipariş ve 13 bir veri noktası pencere) gürültülü sinyalleri azaltmak için filtre uygulanır. Tekrarlayan ışık aydınlatma (2 dk süresi, 2.75 h aralıklarla) ile hızlandırılmış mikroskobu, aynı zamanda alıcı hücreleri tek hücre düzeyinde ( şekil 2Fiçinde gri çizgiler) ve nüfus düzeyi (kırmızı çizgi şekil içinde eşzamanlı yanıt ortaya 2F). bu veri gönderen hücrelerdeki Dll1 proteinin döngüsel ifade alıcı hücreler komşu Hes1 salınım eşitlemek için yeterli olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: optogenetic tedirginlikler üzerine hücresel yanıt-e doğru çözümlemek için strateji. (A) şeması bu iletişim kuralı için kullanılan temsilcisi plazmid vektörel çizimler. Bu Plasmid'ler istek üzerine temin edilir. (B) 6-şey hücre kültür plaka altında mavi LED aygıtı ile donatılmış bir CO2 kuluçka makinesi bir fotoğraf. (C) şematik diyagramı bir elektrik devresi kontrol Güç LED ışık kaynağı için programlanabilir bir mikro-bilgisayar tarafından tedarik. Solid-state röle (SSR), açık/kapalı durumları açık/kapalı durumları LED ışık kaynağı mikro-bilgisayar dijital PIN-dışında geçiş için ayarlandı. (D) bir fotoğraf ve izleme sistemi bir canlı hücre bioluminescence şematik. Motorlu sahne karakter Devresel_ödeme dedektörü üst kısmında bir kayıt konumdan LED ışık kaynağı üst kısmında bir aydınlatma duruma taşıyabilirsiniz unutmayın. Ayrıca, devresel_ödeme dedektörü için de izlemek için taşıyabilirsiniz Not bireysel kuyulardan sinyalleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: optogenetic pertürbasyon deneyler örnekleri. Bu örneklerde, fare C2C12 myoblast hücre hatları kullanılmıştır. (A) şeması dinamik Gönderici-alıcı testin. (B, C) Işık kaynaklı Dll1 ifade tarafından Western Blot analizi analiz temsilcisi sonuçları. Dll1 proteinler 2,5 h nokta, 2 dk süresi ve yoğunluğu 24,7 W/m2periyodik ışık aydınlatma tarafından indüklenen. (D) floresan ortak kültür sisteminin gönderici ve alıcı hücrelerin görüntüsünü. (E, F) Dinamik Gönderici-alıcı tahlil sonuçlarını temsilcisi. (E) ödeme ile donatılmış canlı hücre izleme sistemi tarafından kaydedilen alıcı tepkilerin zamansal desenleri Toplam hücre sayısı 1.5 x 105 hücreleri için sabit ama oranları Gönderenler ve alıcılar arasında 5: 1'den 1: 2'ye dağıtıldı. (F) tarafından periyodik ışık aydınlatma (2 dk süresi, 2.75 h aralıklarla) indüklenen, salınım bilgi transfer gönderenden gelen alıcı hücrelere tek hücreli görüntüleme saptandı. 1.5 x 5:1 gönderen alıcı oranı 105 hücreler kullanıldı. Referans 10 uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen ifade dynamics periyodik olarak 2-3 h ile denetlemek için bir yöntem gösterdik. Bu zaman-ölçek Tet tarih sistemi ve özgün aydınlatacağı sistemi de dahil olmak üzere diğer geleneksel sistemleri daha çok kısadır. Ultradian zaman ölçekleri ulaşmak için anahtar parametreleri yarı-hayat moleküler ürünleri fotoğraf kaynaklı, mRNA'ların ve proteinler vardır. Bu kinetik parametrelerin hücre tipleri ve türler üzerinde bağlı olabilir. Dizileri ve hedef proteinlerin işlevlerini değiştirmez Kinetik ayarlamak için başkalarıyla Hes1 3' UTR dizileri yerine bir düz ileri şekilde, çünkü. Diğer 3' UTRs pulsatil özellikle ilgi hücre desenleri arzu elde etmek için arayan, canlı-hücre dLuc tarafından ışık indüksiyon izleme iyi bir başlangıç noktası ve tarama ve doğrulama için kullanılır.
Işığa duyarlı hücreler günlük işleme hakkında en sık sorulan sorulardan biri. Çentik sinyal dinamik Gönderici-alıcı tahlil söz konusu olduğunda, biz bizim sistemleri (fotoğraf-indüklenebilir dLuc veya Dll1 hücreleri ve alıcı hücreleri) hücre çoğalması alter ve dinlenme için hızlı bir şekilde dönmek hücre pasajlar Oda ışıkları altında her gün yok başardık Birleşik hücreler için karanlık bir koşul taşındıktan sonra 6 saat içinde. Genler ilgi kader tayini faktörler varsa, sızan ifade hücresel başkalaşım teşvik veya hücrelerin Açılımları önlemek ve bu nedenle istenmeyen optogenetic pertürbasyon sırasında önlemek için kırmızı ışık ortamı kurmak için önemlidir hücre işleme.
Bu protokol için fotoğraf-indüklenebilir gen ifade kasetleri ile istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için yordamlar sunduk. Bu dinamik Gönderici-alıcı tahlil güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik bir adımdır. Bir-ebilmek iyice düşünüp taşınmak optogenetic modülleri giriş hücreleri için geçici transfection, ama o does değil iş-ultradian bakliyat nicel ölçümler için bizim ellerde de. UAS organizatörü kaset yol açar, karanlık bir koşulda bile nispeten yüksek düzeyde Sızan ifade taşıyan plazmidlerin geçici o transfection bulduk. Bu Sızan ifade yüksek bir arka plan olmadan herhangi bir ışık stimülasyon neden olur ve güvenilir bir ölçüm zamanı-tabii engellemektedir. İstikrarlı hücreleri oluşturmak için alternatif bir yöntem transfection12için uygun değildir hücre tipleri için yararlı olan bir lentivirus sistemidir. Klonal hücre hatları mevcut türdeş olmayan hücre hatları daha daha homojen yanıt, ama bir klonal nüfus bile, hücre yanıt-e doğru her zaman düzgün değildir: bazı hücreler stimülasyon ışık ve bu nedenle dağıtılmış bir düzeyde sunmak için ışık kaynaklı yanıt verme protein ifadesi. Bu değişken ifade hGAVPO protein ve/veya değişken flavin, ışık hGAVPO algılama için gerekli bir chromophore endojen bereket düzeyde olabilir.
Burada sunulan Protokolü gen ifade dinamikleri analiz için güçlü bir araç sağlar, ancak bazı sınırlamalar vardır. Bazı Floresans kanalları canlı-cep mikroskobu için mavi ışık stimülasyon ile uyumlu olmayan bir dezavantajıdır. Mavi ışık aydınlatma etkinleştirir mavi ışığa duyarlı proteinler hem de floresan proteinler, duyarlı olan yeşil ve sarı floresan proteinler (GFPs ve YFPs), dahil olmak üzere fotoğraf beyazlatma. Aksine, GFP görselleştirme floresan görüntü yakalama sırasında istenmeyen harekete geçirmek-in fotoğraf-duyarlı hücreler tetikleyebilir Mavi ışıklı uyarma gerektirir. Bright-alan (Faz-kontrast) ortam ışık kaynağı tarafından Imaging Ayrıca mavi ışık optogenetic deneyler ile uyumlu değil, ama bir görüntüleme için yeşil veya daha uzun dalga boyu ışık kaynakları kullanarak bu sorunu aşmak.
Dinamik Gönderici-alıcı tahlil diğer sinyal yolları soruşturma için yararlı olacaktır. Bir olasılık sistemleri sinyal salgılayan için bir uygulamadır. Bu tür analizleri için saflaştırılmış ligandlar mikro-sıvı cihazlarda uygulama alıcı hücreleri hassas geçici şekilde16,17uyarmak için alternatif bir yoludur. Ancak, bu yaklaşımlar gönderen hücrelerdeki ligand moleküllerin dinamik üretim süreçleri için erişilemez olur. Dinamik Gönderici-alıcı tahlil ile birlikte fotoğraf-indüklenebilir ligand ifade istihdam daha fazla sinyal iletim diseksiyon gönderenden gelen alıcı hücreler için olanak sağlayacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser evrimsel bilimi ve teknolojisi (JPMJCR12W2 (yazar)), Grant-in-Aid (Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT), Japonya yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için JST, PRESTO (AI), çekirdek araştırma tarafından desteklenmiştir 26119708 (yapay zeka) ve 16 H 06480 (yazar)), bilimsel araştırma (A) (Japonya toplum bilim (JSP'ler) 24240049 teşviki (yazar)) ve genç bilim adamları (A) (JSP'ler 15 H 05326 (yapay zeka)) ve yenilikçi alanlarda "floresan bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid Canlı MEXT, Japonya ve Platform için dinamik yaklaşımlar yaşayan için MEXT, Japonya görüntüleme sistemi".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
