Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.
Abstract
תאים צריך להגיב כראוי חנותם לסביבות משתנות, אשר מושפעים על ידי גורמים שונים של תאים המקיפים אותם. החריץ איתות הוא אחד כזה מכונות מולקולריות חיוני עבור תקשורת לתא, אשר ממלא את תפקידי המפתח בהתפתחות נורמלית של העוברים. מסלול זה כרוכה לתא העברה של מידע מתנדנדות עם מקצבים ultradian, אך למרות ההתקדמות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, זה מאתגר התירי את ההשפעה של אינטראקציות multicellular על ג'ין מתנדנדות דינמיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר optogenetic בקרה ופיקוח בשידור חי דפוסי ביטוי גנים באופן זמני מדויק. שיטה זו חשף בהצלחה תשומות תקופתיים תאיים, המערכת של חריץ איתות entrain תנודות מהותי על ידי תדר כוונון שלב הסטה ברזולוציה תא בודד. גישה זו ישימה על הניתוח של המאפיינים דינמי של איתות המסלולים השונים, מתן פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות multicellular.
Introduction
תקשורת לתא לשחק תפקידים חיוניים המתבנת עובריים בתהליכים התפתחותיים. ב העוברים בעלי. החוליות, המבנים metameric הנקרא somites נוצרות לאורך הציר הקדמי-אחוריים הגוף עם דיוק טמפורלית מדויק תחת השליטה של שעון זמן, קרא את השעון של פילוח1. במהלך תהליך זה, קבוצה של תאים presomitic והמזודרם (PSM) מעת לעת מומרים somites באופן סינכרוני. תהליך זה דורש ביטוי גנים מתנדנדות מסונכרן ויוצרים תאים PSM נעים בשלב של somites אותו. התקופה של ביטוי גנים מתנדנדות היא בסביבות 2-3 h בעכברים, בערך 30 דקות של דג זברה. הפומבית, PSM התאים מאבדים את2,synchrony3, אך כאשר הם צבורים מחדש, הם יכולים לארגן את עצמי, לשחזר את האוכלוסייה synchrony4, רומז תא-תא צימוד הוא מפתח מסונכרן תנודות.
המאמצים חשף כי מולקולות איתות בשביל חריץ דלתא מחוברים בחוזקה תנודות מסונכרן של גנים שעון פילוח. מעכבי תרופתי או מוטציות גנטיות של חריץ איתות בטל סינכרון האוכלוסייה מתנדים. דג זברה מוטנטים של חריץ איתות רכיבים, כגון DeltaC, DeltaD, Notch1a, להציג תנודות אסינכרוני5,6. עוברי צ'יק או עכבר, לא רק של ליגנד חריץ דלתא-like1 (Dll1), אלא גם הציצית החריץ אפנן המטורף (Lfng) נדרש תנודות מסונכרן7,8,9. עם זאת, זה קשה לבחון את יכולת תפקודית של מולקולות כאלה להעברת מידע דינאמי מתא לתא, כי החלטות הטמפורלי של ההפרעות המקובלת של ג'ין תקנה דינמיקה לא היו מספיק כדי לחקור תהליכים של צירי זמן של 2-3 h (מקצבים ultradian).
לאחרונה פיתחנו שיטה משולבת כדי לשלוט ולפקח ג'ין ביטוי תבניות תאים בתרבית של10. טכנולוגיה זו מאפשרת אינדוקציה של פולסים ביטוי הגן על ידי תאורה אור תקופתיים על פרקי זמן ultradian. פרוטוקול זה מייצג את שיטות ליצור שורות תאים פוטוסנסיטיבית ולבחון תגובות דינמי של הכתב תאים על ידי הפריה חוץ גופית לחיות תאים ניטור בהקשרים של התקשורת לתא. שיטה זו ישימה על הניתוח של רבים אחרים איתות המסלולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של שורות תאים יציב על ידי מערכת Tol2
-
Transfect פלסמיד וקטורים (איור 1 א') של מודולים optogenetic מבוססי Tol2 יחד עם וקטור ביטוי transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) לתוך התאים C2C12. בכל השלבים, התרבות תאים בינונית DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס (טבלה 1), בנוכחות 5% CO2, אחרת מסומן.
- לספור תאים trypsinized עם תא-מונה, צלחת 5 x 10 תאים4 C2C12 לכל טוב בצלחת 12-. ובכן, יום אחד לפני תרביות תאים.
- שיתוף transfect μg 0.375 של וקטורים מבוסס-Tol2 optogenetic (pAI177 או pAI218), μg 0.125 של הווקטור מבחר סמים (pAI170) ו- 0.5 μg של וקטור pCAGGS-mT2TP על-ידי שימוש ריאגנט lipofection.
- Trypsinize transfected תאים, צלחת אותם 100 מ מ תרבות מנות יום לאחר תרביות תאים.
- חילופי תרבות בינונית עבור תאים transfected לבינונית תרבות בתוספת 100 מ"ג/מ"ל hygromycin.
- התרבות תאים במשך 3 ימים לחסל תאים transfected האו ם. שימו לב כי שינוי בינוני לא הכרחי.
- Trypsinize transfected תאים, לטהר אוכלוסיה של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט לבחירה. תאים מקלט נושאת pAI177, להגדיר את השער המיון לערוץ ירוק-PE לטיהור מאוכלוסיית תא mCherry-חיוביות. תאי צילום רגיש השולח נושא pAI218, להגדיר את השער המיון לערוץ APC לטיהור מאוכלוסיית תא iRFP713-חיוביות.
- (אופציונלי) צור אוכלוסיה המשובטים תא על-ידי בשיטות הרגילות, כגון דילול מוגבלת או תא בודד מיון לפי FACS.
2. הערכה של צילום-רגישות של תאים מהונדסים ברמת האוכלוסייה
הערה: החלק הזה מתאר פרוטוקול כדי לבדוק אם אינדוקציה דינמי של חלבונים ליגנד Dll1 על תאורה אור כחול מבחני ביוכימיים, כגון qPCR וסופג המערבי.
- להגדיר שני סוגי חממות עם או בלי מקורות אור תנאי אור-induced או תנאי כהה, בהתאמה. הגדרת אור בעוצמה של כחול-LED הטרנס-המאייר, כפי שמוצג באיור 1B, באמצעות מד האור. תזמוני תוכנית ומשך ההארה האור על-ידי טעינת תסריט-שליטה על יחיד פנסיון מיקרו-בקר המאפשר לתכנות לוחות זמנים עבור תאורה (איור 1C).
- לספור תאים trypsinized עם תא-מונה ותאים צלחת 1.0 x 105 צילום רגיש השולח נושא pAI218 ו- pAI170 על מנות תרבות פלסטיק בקוטר 35 מ מ (יותר מ-12 מנות עבור מצב אור ומנה 1 עבור תנאי כהה) ולהגדיר את הכלים הפרד חממות לתנאי תאורה/כהה. לאחר הגדרת מנות, לשמור על דלתות אינקובטורים סגור עד איסוף תא lysates.
- אחד וחצי ימים אחרי ציפוי, הפעלת תאורה אור (תאים צפויים להיות יותר מ- 80% confluent). לא לחשוף תאים להדליק כדי להימנע תמונה לא רצויה-גירוי.
הערה: לוחות זמנים עבור תאורה תלויה המטרה של ניסויים. חשוב לציין כי תנאי תאורה מתמשכת (למשל. מרווחי משך ו- 10 דקות 1-מין עם 40 µmol/m2/s אור בעוצמה) מספיקה עבור בדיקה פשוטה של צילום-אינדוקציה, תאורה אור חזק כי הוא מזיק לתאים. לפיכך, להבטיח כי לא מזיק פרמטרים עבור תאורה נבחרים. - כ- 2 ימים לאחר ציפוי, להכין תא-lysate עם 30-מין במרווחים. העבר מנות מדגם של חממות על הקרח, ולהתחיל להתכונן תא lysates ניתוח נוסף.
3. דינמי השולח-מקלט Assay ברמת האוכלוסייה: ניטור בזמן אמת של תגובות הסלולר על גירוי אופטי על-ידי PMT
- Trypsinize, לספור את המספרים של השולח ושל התאים מקלט בשיטות הרגילות. להכין 1-mL הנפח הכולל של ערבוב ההשעיה של 2.5 x 10 מקלט4 ו- 1.25 x 105 השולח תאים (היחס 1:5).
הערה: 2:1, 1:1 או 1:2 יחסי שולח-מקלט גם לעבוד עם מספר בתא סכום של 1.5 x 105. 10 - צלחת מעורב בתאים כל טוב של לוחות 24-ובכן שחור עם תרבות בינוני המכיל 1 מ luciferin.
- לנתח את התאים על צלחת קורא עבור לוציפראז assay, וודא כי אותות הפלט אינם גבוהים מדי עבור מערכת הקלטה.
הערה: אם אותות הפלט גבוה יותר מאשר פוטון6 עונה 1 פרק 10 ספירות/s, הם עשויים להיות רווי. במקרה זה, להפחית את ריכוז luciferin לערכים אופטימליים כך אותות הפלט הם נמוכים יותר עונה 1 פרק 106 פוטון ספירות/s.... - הגדר את הצלחת על מערכת הקלטה ולאחר הפעלת תוכנית הקלטה (איור 1D). לדוגמה, להתחיל תאורה אור-18 h לאחר הגדרת את ההקלטה.
הערה: זמני סינון, כגון אותות detrending עם נע בממוצע ו- Savitzky-Golay סינון, שימושיים עבור ויזואליזציה של צורות גל לשיא גילויים.
4. דינמי השולח-מקלט Assay ברמה תא בודד: בזמן אמת הדמיה של תא בודד תגובות תחת השליטה של ההפרעות Optogenetic
- צלחת 0.5 x 105 מקלט, 2.5 x 10 תאים השולח5 על 27 מ מקוטר-זכוכית-בסיס 35 מ מ קוטר מנות. להבטיח את יחס ערבוב ומספר בתא סכום (צפיפות תא) מותאמים בצורה נכונה.
- יום אחד לאחר ציפוי, להחליף בינוני עם 2 מ"ל של המדיום הקלטה (פנול אדום בינוני DMEM חופשית בתוספת 5% FBS, סטרפטומיצין פניצילין, luciferin 1 מ מ), ולהגדיר את צלחת זכוכית בסיס על המיקרוסקופ. במידת הצורך, לשטוף את הלכלוך של תאים מתים עם PBS (-).
הערה: עדיף לעשות צעד זה במצב כהה. - להגדיר במיקרוסקופ הפוכה מצויד עם חדר סביבתי-CO 37 ° C ו-5%2.
- הגדר את מצלמת CCD מקורר. ודא כי הטמפרטורה של חיישן מצלמות מקורר לערך היעד (בדרך כלל,-90 ° C).
-
להגדיר את הפרמטרים של "Multi-Dimensional Timelapse" חלון בתוכנה רכישה אוטומטית כדי ללכוד תמונות עם מרווחי 5 דקות ולא יותר 288 פעמים (הקלטה לילה אחד או יותר).
- תפתח חלון "Multi-Dimensional Timelapse", בחר ערוץ הפריה חוץ גופית ומצב read-out 50 קילוהרץ לאט מתוך התפריט הנפתח ולהגדיר 4 x 4 binning עם 4-מין חשיפה. ודא כי מצב read-out מוגדר למצב 50 קילוהרץ איטי, אשר חיוני להפחתת רעשים read-out לגילוי בחולשה פולטות אור זוהרים.
- תפתח חלון "Multi-Dimensional Timelapse", בחר ערוצי פלורסצנטיות, מצב read-out במהירות של 1 מגה-הרץ מתוך התפריט הנפתח ולהגדיר 2 x 2 binning עם 400 ms חשיפה. ודא כי מצב read-out מוגדר למצב 1 מגה-הרץ במהירות כדי להפחית את משך הזמן הנדרש עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
- להתחיל בצילום מואץ הקלטה על-ידי לחיצה על לחצן "רכוש".
- לחלץ תא בודד עקבות של הפריה חוץ גופית ערוצי סרטים בצילום מואץ על-ידי תוכנת ניתוח התמונה, כדלקמן. ראשית, להפוך תמונות בערימה הפריה חוץ גופית, זריחה על-ידי ייבוא נתוני התמונה לתוכנה ניתוח התמונה. לתמונות הפריה חוץ גופית, הסרת פיקסלים חם נגזר קרניים קוסמיות על-ידי השוואת עוצמות הפיקסלים בתמונות חנותם סמוכים, החלפת ערכי הפיקסלים לממוצע הטמפורלי של המסגרות הקודמים (מיושם על ידי "SpikeNoise מסנן"), להחיל תמונות מעובדים אלה מסנן החלקת במרחב, להחסיר רקע ערכי פיקסלים של out-field נופים מכל מסגרת. ואז להחליט "אזור בעל עניין" (ROI) עבור כל תא בתמונת פלורסנט בכל נקודה בזמן, להחיל את רועי לתמונות זורח, למדוד את עוצמת כל רועי מאיר עיניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שינינו את בכוכב מערכת11,12, המאפשרת ביטוי גנים צילום-induced בתאי יונקים, במחקר של מתנדים גנטי עם 2 - 3 h תקופתיות. מערכת זו מורכבת משני חלקים: את hGAVPO activator תעתיק צילום-inducible ואת קלטת UAS-יזם כדי לכונן שעתוק של גנים שרירותי של עניין. כדי להאיץ את קינטיקה פועמת צילום-induced גנים, רצף תיקים עשויים בקלטת UAS-יזם הוחלף על ידי מאתר Hes1 3' UTR, אשר מקצר את זמן מחצית החיים mRNA ל 20 דקות ב fibroblasts מאתר.
כדי ליצור שורות תאים יציב, וקטורים tri-cistronic מבוסס על מערכת transposase ' Tol2 ' היה בשימוש13 (איור 1 א'). הווקטור ביטוי Tol2 חיוני לשיפור היעילות של אינטגרציה כרומוזומלית פלסמיד קלטות14. וקטורים אלה נושאים לא רק הקלטות ביטוי של גנים אור-inducible מונע על ידי UAS-יזם, אלא גם הקלטות ביטוי של חלבונים צילום רגיש hGAVPO, פלורסנט החלבונים (iRFP71315 או mCherry). עיצוב זה אפשר לנו לטהר אוכלוסיה של תאים ביעילות משולב של פלסמידים לתוך הגנום המארח.
הקמנו צילום רגיש השולח תאים המייצרים חלבונים ליגנד Dll1 על תאורה אור כחול (איור 2 א). למטרה זו, נעשה שימוש Tol2 על בסיס מערכת ה-bi-cistronic וקטור (pAI218). כדי לבדוק אינדוקציה של ליגנד Dll1 על תאורה אור, תאים היו תרבותי ב וייצג מצויד מתוכנת מקורות אור כחול של LED, המוצגת איור 1B וג 1. נציג תוצאות של צילום-induced Dll1 חלבון ביטוי דינמיקה זוהה על ידי ניתוח סופג המערבי מוצגים באיור 2B ו- 2 C.
כדי ליצור תאים מגיבים חריץ איתות תשומות, השתמשנו Tol2 על בסיס מערכת ה-bi-cistronic וקטור (pAI177) נושא הכתב לוציפראז גרם אולי לפגיעה ביציבות תחת השליטה של האמרגן של הגן אפקטור דרגה Hes1 , את phosphoglycerate קינאז (PGK) מונחה יזם מקומי-גרעינים אדום פלורסנט כתב ויזת עבודה H2B-mCherry. במקרה זה, הכתב פלורסנט שימושית עבור טיהור והן החד-תאיים מעקב במיקרוסקופ זמן לשגות.
לאחר צילום-inducible השולח תאים ותאים מקלט נוצרים בהצלחה, הגיע מוכן לבצע assay השולח דינמי-מקלט על-ידי שיתוף culturing תאים אלה (איור 2 א). זה assay, התאים צילום רגיש השולח המבטאים החלבון ליגנד חריץ Dll1 על תאורה אור כחול היו בתרבית במשותף עם תאי צילום-רגישות מקלט שנושאים את מתנד Hes1 אנדוגני, ביולומינסנציה Hes1 כתב ( pHes1-dLuc) (איור דו-ממדי). התאים מקלט אקספרס endogenously הקולטן חריץ, וזו מגיבים Dll1 שהוצגו על ידי התאים הסמוכים.
נציג התוצאות של מבחני השולח דינמי-מקלט מוצגים באיור 2E ו- 2F. כדי לזהות את התגובות דינמי של מקלט תאים עם ביולומינסנציה הקלטה, השתמשנו לראשונה מערכת ניטור לחיות תאים מצויד צינור גבוהה רגיש צילום-מכפיל (PMT) עבור ספירת פוטון, מקור אור כחול LED לגירוי אור ( איור 1D). מערכת זו מאפשרת הקלטה בזמן אמת של אותות ביולומינסנציה ברמת האוכלוסייה עם תאורה אור מתוזמנת. כאשר אלו שני סוגים של תאים היו משותף תרבותי, נחשפים תאורה אור שחוזר על עצמו (30 s משך, מרווחי 2.5 h), תגובות מחזורית של תאים מקלט היו לזיהוי בתנאים שונים של ערבוב יחס (2E איור). בדוגמה זו, אנו להחיל סינון (מסדר 4 , חלון נקודת נתונים 13) כדי לרכך את אותות רועש את Savitzky-Golay. מיקרוסקופ בצילום מואץ עם תאורה אור שחוזר על עצמו (משך 2 דקות, מרווחי 2.75 h) התגלה גם את התגובות מסונכרן של תאים מקלט ברמת תא בודד (אפור קווים ב 2F איור) וברמת האוכלוסייה (הקו האדום ב איור 2F). נתונים אלו מראים כי הביטוי מחזורית Dll1 החלבון בתאים השולח מספיקה לסנכרן את תנודות Hes1 שכנות מקלט תאים.
איור 1: אסטרטגיה לנתח הסלולר תגובות על לפליטת optogenetic. תיאור סכמטי של וקטורים פלסמיד נציג המשמש עבור פרוטוקול זה (א) . פלסמידים אלה הינם זמינים על פי בקשה. (B) תמונה של חממה2 CO מצויד עם מכשיר LED כחול מתחת צלחת התרבות תאים 6-. טוב. (ג) תרשים סכמטי של מעגל חשמלי לכוח השליטה לספק עבור מקור אור LED על ידי מיקרו-מחשב ניתן לתיכנות. העברת solid-state (הסובייטית) הוגדר ממסר/ביטול הברית של PIN-out דיגיטלית של המיקרו-למחשב/ביטול הברית של מקור אור LED. (ד) צילום ו סכמטית ביולומינסנציה לחיות תאים מערכת ניטור. שימו לב כי הבמה ממונע יכול לעבור unidirectionally מתוך עמדה הקלטה בראש הגלאי PMT עמדה תאורה בחלק העליון מקור האור LED. כמו כן, שימו לב: גלאי PMT ניתן להעביר טוב עד טוב לעקוב אחר אותות מבארות בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמאות לניסויים ההפרעות optogenetic. בדוגמאות אלה, שימשו מאתר שורות תאים myoblast C2C12. תיאור סכמטי של וזמינותו השולח דינמי-מקלט (א) . (B, C) התוצאות נציג של אור-induced ביטוי Dll1 נותחו על ידי ניתוח סופג המערבי. חלבונים Dll1 היו המושרה על ידי תאורה אור תקופתי עם תקופה 2.5 h, משך 2 דקות, האינטנסיביות של W/m 24.72. (ד) זריחה תמונה של תרבות משותפת מערכת של תאים לשולח ולמקבל. (E, F) התוצאות נציג של השולח דינמי-מקלט וזמינותו. דפוסי תגובות המקלט נרשם על ידי מערכת ניטור לחיות תאים המצוידים PMT. זמני (E) המספר בתא סכום היה קבוע של 1.5 x 105 תאים, אך היחס בין השולחים את הקולטים חולקו בין 5:1 1:2. (נ) בתא יחיד הדמיה חשפה מידע מתנדנדות, אשר היה המושרה על ידי תאורה אור תקופתי (משך 2 דקות, מרווחי 2.75 h), הועבר משולח לתאים מקלט. 1.5 x 105 תאים עם השולח-כדי-מקלט יחס של 5:1 שימשו. חיבור מקורי הפניה למעורר 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הראנו שיטה לשליטה dynamics ביטוי גנים עם תקופתיות של 2-3 h... סרגל הזמן הזה הוא הרבה יותר קצר מאשר אלה במערכות אחרות המקובלת, כולל מערכת ט'-על מערכת בכוכב המקורי. פרמטרים מרכזיים כדי להגיע בזמן ultradian-המאזניים הם מחצית החיים של צילום-induced מוצרים מולקולרית, mRNAs חלבונים. פרמטרים אלה קינטי עשוי תלויים תא סוגים ומינים. עבור כוונון של קינטיקה, החלפת Hes1 3' UTR רצפים עם אחרים הוא ישר קדימה דרך, כי זה אינו משנה את רצפי והפונקציות של חלבונים היעד. מחפשים אחר אחרים 3' UTRs להשיג נחשק פועמת תבניות בפרט תאים עניין, לחיות תאים ניטור של dLuc על ידי אור אינדוקציה הוא נקודת התחלה טובה ומשמשת עבור סינון ואימות.
אחת השאלות הנפוצות ביותר היא על הטיפול היומי של תאים רגישים לאור. במקרה של השולח דינמי-מקלט וזמינותו של חריץ באיתות, הצלחנו לעשות מעברים תא תחת האורות בחדר, מדי יום כי המערכות שלנו (inducible-צילום dLuc או Dll1 תאים ותאים מקלט) לא לשנות את התפשטות תאים ולחזור במהירות נח הברית בתוך 6 שעות לאחר התאים מועברים למצב כהה. אם הגנים של עניין גורמים הגורל-נחישות, ביטוי דולפים יכולים זירוז התמיינות או למנוע הרחבות של התאים, לכן חיוני כדי להגדיר סביבת האורות האדומים כדי להימנע optogenetic לא רצויים ההפרעות במהלך תא טיפול.
ב פרוטוקול זה, הצגנו הליכים כדי ליצור שורות תאים יציב עם ג'ין צילום-inducible ביטוי קלטות. זהו שלב קריטי להשגת תוצאות אמינות ב וזמינותו השולח דינמי-מקלט. ניתן לחשוב תקנים חולף על ההיכרות של מודולים optogenetic לתוך התאים, אך זה לא עובד טוב בידיים שלנו עבור מדידות כמותיים של פולסים ultradian. . מצאנו את תרביות תאים ארעית של פלסמידים נושאת UAS-יזם מוביל קלטות לביטוי דולפים ברמות גבוהות יחסית אפילו בתנאי כהה. ביטוי זה דולף גורם רקע גבוה ללא כל גירוי קל, הסלים מדידה אמין כמובן-זמן. שיטה חלופית להקמת תאי יציבה היא מערכת lentivirus, אשר הוא שימושי עבור סוגי תאים שאינם מתאימים עבור תקנים12. שורות תאים המשובטים להציג תגובות הומוגניות יותר מאשר שורות תאים הטרוגנית, אך אפילו בקרב אוכלוסיה המשובטים, תגובות תא אינם תמיד אחידים: כמה תאים אינם מגיבים אור גירוי ולהציג ולכן רמות מבוזרת של אור-induced ביטוי חלבון. ייתכן שהדבר נובע רמות ביטוי משתנה של hGAVPO חלבון ו/או משתנה אנדוגני שפע פלווין, כרומופור הדרושות חישת אור hGAVPO.
פרוטוקול המובאת כאן מספק כלי רב עוצמה לניתוח של דינמיקה ביטוי גנים, אך ישנן כמה מגבלות. חסרון אחד הוא כי כמה ערוצים פלורסצנטיות עבור לחיות תאים במיקרוסקופ אינם תואמים גירוי אור כחול. אור כחול תאורה מפעיל לא רק את הכחול-אור-רגיש חלבונים אלא גם חלבונים פלורסנט, כולל ירוק וצהוב פלורסנט חלבונים (GFPs ו- YFPs), אשר רגישים הלבנת-צילום. להפך, ויזואליזציה של GFP דורש עירור אור כחול זה עשוי לעורר הפעלה לא רצויה של תאים רגישים צילום במהלך לכידת תמונות פלורסנט. ברייט-שדה (שלב-חדות) הדמיה על ידי מקור האור הסביבתי גם עולה בקנה אחד עם אור כחול optogenetic ניסויים, אך אחד, ניתן לעקוף את הבעיה באמצעות מקורות אור ירוק או יותר-אורך הגל עבור ההדמיה.
וזמינותו השולח דינמי-המקלט יהיה שימושי עבור חוקרים אחרים איתות המסלולים. אפשרות אחת היא ליישום מפריש איתות מערכות. בשביל ניתוח כזה, החלת ליגנדים מטוהרים במיקרו-פלואידים היא דרך חלופית כדי לעורר תאים מקלט מדויק באופן זמני16,17. עם זאת, גישות אלה נגישים תהליכי הייצור דינמי של מולקולות ליגנד בתאים השולח. העסקת וזמינותו השולח דינמי-מקלט יחד עם ביטוי ליגנד צילום-inducible תאפשר בהמשך דיסקציה של שידור האות משולח לתאים מקלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך על ידי JST, פרסטו (מלאכותית), ליבת המחקר אבולוציונית למדע וטכנולוגיה (JPMJCR12W2 (ר. ק)) מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן 26119708 (אינטליגנציה מלאכותית) ו- 16 H 06480 (ר. ק)), מדעי מחקר (א) (יפן החברה לקידום המדע (JSPS) 24240049 (ר. ק)), מדענים צעירים (א) (JSPS H 15 05326 (אינטליגנציה מלאכותית)), ואת מענק של הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים "זריחה חי הדמיה"של MEXT, יפן, פלטפורמה עבור גישות דינאמיות למערכת חיים מ MEXT, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
