Summary
このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP とタンパク質の細胞内局在化信号を保持されます。
Abstract
このプロトコル、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 融合タンパク質と 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) タンパク質細胞内局在変化の追跡に使用される汚損特に、熱下核転座応力状態です。タンパク質には、それに対応する外部および内部信号が反応します。共通のメカニズムは、その内局を変更することです。この記事では、抗体や放射化ラベリング、共焦点顕微鏡を必要としない蛋白質のローカリゼーションを追跡するプロトコルについて説明します。この記事で、GFP タグの哺乳類の CLIC4 を含む塩化物の細胞内チャネル蛋白質 (クリックス) 家族の線虫メンバーのターゲット蛋白質 EXL 1 されます。(プロモーターによる遺伝子の塩基配列と) 統合された並進exl 1::gfpトランスジェニック ラインによって作成された変換と γ 放射線と遺伝子とgfpを安定して表現。最近の研究では、熱応力、ない酸化ストレス、EXL 1::GFP が核で蓄積を示した。核構造と、DAPI GFP 信号を重複信号は、ストレスの下で EXL 1 細胞内局在変化を確認します。このプロトコルは、DAPI 染色 2 つの異なる固定方法を提示: エタノールの固定とアセトンの固定。この記事で紹介した DAPI 染色プロトコル、高速かつ効率的であり、GFP シグナルと蛋白質の細胞内局在変化の両方を保持します。このメソッドはのみ、ノマルスキー、FITC フィルター DAPI フィルターと蛍光顕微鏡を必要があります。小さな実験室設定、学部学生の研究、高校生研究およびバイオ テクノロジー教室に適しています。
Introduction
蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーションの変更は、熱ストレス、飢餓、酸化ストレス、アポトーシス、タンパク質リン酸化、その他などの内部または外部のシグナルに応答の一般的なメカニズムです。たとえば、熱応力は、FOXO メンバー DAF 16 核移行1,2, と入札が3,4の信号受信の死亡時にミトコンドリアに移行 pro アポトーシス bcl-2 蛋白を誘導します。これらの変更を検出する様々 なテクニックがあります。西部にしみが付くことおよび生化学的細胞レベル下の構造 (例えばミトコンドリアや核) を分離することの組み合わせは、目標3を達成できるも。ただし、興味の蛋白質に対して抗体が必要です。したがって、確立された抗体の成功の鍵となります。代替的アプローチは、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、赤の蛍光タンパク質 (RFP)、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を mCherry など様々 なマーカーとさまざまな細胞内構造や細胞内小器官をラベルし、一方のタンパク質をラベル他のマーカーに興味。その後、ターゲット5,6をローカライズする共焦点顕微鏡で観察します。放射性同位元素は、標的タンパク質をラベル付けおよび、その内局7を検出するための代替選択肢です。ただし、このメソッドには、適切な訓練と放射性廃棄物の処理が必要です。特定の抗体の欠如は、適切なマーカーの不在や共焦点顕微鏡などの機器の scarceness などの状況下で代替的アプローチを考慮する必要があります。タンパク質の核移行を識別するためにだけマーカーを持つ標的タンパク質をラベルし、化学試薬 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) のみ通常蛍光顕微鏡が必要ですので核を染色する魅力的です。
反応線虫抗体とは卵の殻や動物を取り巻く膠原線維のキューティクルの低透磁率のために挑戦。一方、線虫のタンパク質は、脊椎動物の嗅覚から著しく発散なので、いくつかの民間企業は特定の製品で線虫を提供します。自分自身の線虫抗体を生成する小さな研究室は困難です。コミュニティの研究者は、頻繁ローカリゼーションまたは遺伝子発現を示すマーカーとして付けられた蛋白質を使用します。この資料では、例として EXL 1::GFP を使用して熱応力8の下で蛋白質の核移行を追跡します。動物のゲノムに統合された並進exl 1::gfp安定、 gfp融合遺伝子を表現する使用されます。研究を示したexl 1腸、体壁筋および他の細胞内構造8で表されます。このプロトコルは、(L4) 4 幼虫にワームを同期すると、熱応力実験、および行為 DAPI 染色、エタノール固定、アセトンの固定、および通常蛍光顕微鏡イメージングを実行する方法を示します。
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Protocol
1. ソリューション
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NGM プレート
- 2 L の三角フラスコで塩化ナトリウム 3 g、寒天の 17 g、2.5 g ペプトン、dH2O. カバー アルミ箔でフラスコの口の 975 mL を追加します。オートクレーブ 50 分のフラスコは、20-30 分間それを冷やします。
- 滅菌ソリューションを追加: 1 M CaCl2の 1 mL、1 mL のエタノールで 5 mg/mL コレステロール、1 M MgSO4の 1 mL、25 mL の 1 M KPO4 (pH 6.0) バッファー。それらを混ぜるための解決策を旋回します。
- 液体ディスペンサーを使用して、60 mm ペトリ プレートに NGM ソリューションを調剤します。寒天プレート 2/3 完全な塗りつぶし。将来の使用のための 4 ° C で気密容器に保存します。
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1 M KPO4バッファー (pH 6.0)
- KH2PO4 10.83 g と dH2O、K2HPO4 3.56 g を溶解し、100 mL に容量を調整します。オートクレーブ 15 分のためのソリューション。
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M9
- KH2PO4、 6 g の Na2HPO の 3 g を溶解4、および dH2O、塩化ナトリウム 5 g 1 M MgSO4、1 mL を加えるし、1 l 容量を調整
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10 μ G/ml DAPI
- DH2O. 999 μ L に DAPI を 10 mg/mL の 1 μ L を追加します。
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アルコール 95% (v/v)
- 100% アルコールの 95 mL を測定し、蒸留水 100 mL にボリュームを調整するを追加します。
-
アセトン 30% (v/v)
- DH2O にアセトン 30 mL を追加し、100 mL に容量を調整します。
2. 熱応力
- ターゲット遺伝子9,10の並進コンストラクト染色体外配列ラインを生成します。また、線虫研究の公共のリソースは、線虫の遺伝学センター (CGC) からまたは以前に発行された研究室からこのような行を取得します。
- 染色ラインを 3,800 γ 放射線9にワームを公開することによってゲノムに統合します。各動物は、GFP やローラーなどのマーカー蛋白質を表現できるように安定的表現の行を選択します。
- 放射線中に生成された突然変異を削除するには、少なくとも 2 行 outcross x。トランスジェニック行を使用して、ストレスの下で蛋白質発現パターンの変化を検出します。
- 手順 1.1 NGM ワーム プレートを準備します。OP50 クローンを連勝し、一晩流体培養基 LB 液体中の細菌を培養します。みみずのための食糧源として細菌の芝生の成長に一晩で種子液体 OP50 NGM 板文化し、37 ° C の定温器の版を孵化させなさい。使用する前に、少なくとも 30 分間室温でプレートを冷やします。
- 熱応力測定の前に、少なくとも 2 世代のための飢えのない 20 の ° C で形質転換線を成長します。
- 新しいワーム プレートし約 3-5 時間のため卵を産む彼ら let 8-10 の若い大人妊娠 (子宮の卵でいっぱい) を選択し、板からすべての大人を削除します。
- ワームを同期させると、卵が孵化して 4 令幼虫 (L4) に約 48 時間の幼虫を成長をさせます。その外陰部の構造 (半月形の構造) L4 段階 (図 1の矢印)11を識別するを調べます。
- 熱ストレスを達成するために 2-5 h の 35 ° C の定温器で L4 幼虫ワーム プレートを配置します。温度を正確に測定するインキュベーターで温度計を配置します。
3. DAPI 染色
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エタノールの固定
- スライド ガラスの中央に M9 バッファーの 10 μ L を追加します。
- ステップ 2.8 から熱ショックによるワームを選ぶし、スライド ガラスに M9 バッファーに入れます。
- また、M9 とプレートを洗浄、1,000 × g室温で 1 分間の遠心分離機、上澄みを廃棄します。ワームをガラス スライドに追加します。
- 軟部組織を使用して、余分な液体を排出します。足元に解剖顕微鏡の下で。
- ワームに 95% アルコールの 10 μ L を追加し、乾燥する空気。解剖顕微鏡の下でプロセスを見るし、あまりにもドライを得る動物を聞かせていません。動物からエタノールが蒸発した直後には、次の手順に進みます。
注: エタノールは非常に迅速に蒸発します。 - 手順 3.1.4 二度、そのワームを修正します。
メモ: それは暗くなり、歪んで見える動物の正常です。 - DAPI の 10 μ L を追加 (10 μ G/ml) ワーム。すぐに、coverslip でそれらをカバーし、透明なマニキュアのゲルを使用してスライドをシールします。
- 蛍光顕微鏡で約 10 分後に、動物を表示します。
-
アセトン固定 (別の方法)
- M9 とステップ 2.8 から熱ショックによるプレートを洗浄、1,000 × g室温で 1 分間の遠心分離機、上澄みを廃棄します。DH2O の ml の 1 ペレット、ペレットを収集し、上澄みを廃棄します。
- 部屋の温度で 1 分間 1,000 x gで 15 分遠心分離機の 30% アセトンの 400 μ L を追加し、上澄みを廃棄します。2 動物を洗う 500 μ L の dH2O を使用して x。上清を捨てます。
- DAPI を 200 μ l 添加 (10 μ G/ml) または 4 x 15 分間管内全体ヴォルムスのボリュームの量。
- 1 分の 1,000 × gで遠心分離し、上澄みを廃棄します。ペレット 2 dH2O を 500 μ L の x スライド ガラスにワームを配置、coverslips とそれらをカバー、透明なマニキュアのゲルを使用してスライドをシール、蛍光顕微鏡下で動物を観察します。
4. 顕微鏡イメージング
- UV 光源と蛍光顕微鏡を入れます。顕微鏡に接続するコンピューターをオンに。
- 蛍光顕微鏡のスライドをロードします。低消費電力対物レンズ (10 X) を使用してワームを見つけ、400 X、倍率を増やす、供試体に焦点を当てます。
- 顕微鏡に付属するソフトウェアを開きます。メニューの「取得」をクリック「カメラ」をクリックし、顕微鏡に接続されているカメラを選択これにより、ソフトウェアと通信する選択したカメラです。
注: 別の顕微鏡の操作で異なる場合があります。 - 同じ「取得」の下で「多次元取得」をクリックしてします。新しい「多次元買収」ナビゲーション ウィンドウをが開きます。「マルチ チャンネル」ボタンをクリックして、すべての使用可能なチャンネルが表示されます。
- 青、緑、および試料を観察する DIC (微分干渉コントラスト) を選択します。「多次元獲得」ナビゲーション ウィンドウ"青 DAPI"、「グリーン GFP」、と「グレー DIC」、;「ノマルスキー」チャンネルに残しておく「赤ローダミン"や"白い明るいフィールド"、などの他のチャネルを右クリックして終了います。
-
まず、各チャンネル用の露光時間を測定します。
- それを選択し、「測定」の自動露光時間と DAPI チャネルの下でライブ画像を撮影するためにクリックする"青 DAPI"チャネルを左クリックします。ライブ イメージで新しいウィンドウが表示されます。
- ライブ イメージ ウィンドウの左側にある、必要に応じてイメージを作るために必要な場合手動で露光時間を調整します。
- 最後に、 "[ok] をクリックして"ライブ画像ウィンドウで。これは DAPI チャネルの下で露出時間を設定します。
- 他のチャンネル、「緑色 GFP」、「グレー-DIC」、「ノマルスキー"、これらのチャネルのための露光時間を設定するのステップ 4.6 を繰り返します。
- 「多次元取得」のナビゲーション ウィンドウで自動的セットとして特定の露光時間の順序 (上記参照) で 3 つの異なるチャネルの下で 3 つ画像を収集する「スタート」をクリックします。
- ファイルを保存すると、メイン メニューに移動、「として保存」し、「ファイル」をクリックします。ファイル名とフォルダー名を入力します。今後の参考のため詳細な画像情報を保存する既定のファイル形式としてファイルを保存します。
-
他の形式でファイルをエクスポート: する
- 「ファイル」に移動し、「エクスポート」をクリックします。これは、エクスポートの設定ウィンドウを開くでしょう。
- ファイル名とフォルダーを設定します。データを整理するより「プロジェクト フォルダーを作成する」をチェックします。ソフトウェアはまた 4 の他のオプションを指定できます:「マージの生成画像」、「チャンネルの画像に色を使用」「使用チャネル名」と「結合イメージのみ」.
- "TIF"、"BMP"、「PSD」、または「JPG」、他の種類など、ドロップ ダウン メニューから、目的のファイルの種類を選択します。エクスポートする「スタート」をクリックします。
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Representative Results
塩化物チャネルの細胞内蛋白質 (CLIC) は、種12間で高度に保存されている多機能タンパク質です。多くの研究は示します、クリックス細胞ストレス、オートファジー、アポトーシス、発癌、血管新生、および哺乳類系13,14,15,16 マクロファージ生得の免疫反応を調節します。 ,17。線虫の 2 つの CLIC の同族体がある: exl 1とexc-4。私たちの最近の研究は示したexl 1動物のストレス管理8を調節します。動物のゲノムに並進exl 1::gfp構築を統合し、(図 2 aおよび2 b) マーカーとしてに、GFP 遺伝子exl 1を安定して表現形質転換線を作成します。熱ストレス下で強力な GFP 信号 (図 2 C ・E) 核構造と重なるので、腸地域の核に EXL 1::GFP が蓄積されます。細胞内の局在を確認するには、DAPI 染色を用いてアプローチとして核を染色します。DAPI 染色ショー明確な核 (図 3 b) の動物の体内でのエタノールの固定を使用してください。アセトンの固定も同様の結果 (図 3E) を実現します。GFP および DAPI シグナルと重なった EXL 1::GFP は確かに腸地域 (図 3, F) の核蓄積を確認します。
図 1: 第 4 幼虫 (L4) の画像倍率の異なる力の下でc. の elegansをステージします。(A) 63 (C) 、 (B) 115 X、X 400 X 倍率。矢印をポイント L4 ワーム; の外陰部半月形の構造に注意してください。スケール バーすべての画像で 100 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 熱応力、EXL 1::GFP 腸の核蓄積されます。(A)熱ショック前に腸地域の Normaski 画像。(B)強い GFP シグナルは、ヒート ショックの前に、の instestinal 地域で観察されました。(C)熱衝撃 (腸地域の核にポイント矢印) 後腸地域の Normaski 画像。(D)熱ショック後に強力な GFP 信号が蓄積されます。(E)には、GFP と Normaski のイメージが重なっています。すべての写真は、400 倍の倍率で撮影されます。スケール バーすべてのイメージの 50 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: EXL 1::GFP 核移行を確認した DAPI 染色。(A ~ C)DAPI 染色のためのエタノールの固定を使用してください。(D-F)DAPI 染色のアセトン固定を使用します。AとDは、緑の色は腸地域の GFP 信号を示しています。BとEは、青の色は DAPI 染色で核を示しています。CとFは、Normaski、DAPI、GFP の重複する画像を表示します。スケール バーすべてのイメージの 50 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図:アセトン固定試料を保持し、アセトン固定後 60 日 GFP および DAPI の信号は、まだ観測可能なオブジェクト。(A)グリーンは、GFP。(B)青は、DAPI 信号です。(C)には、GFP、DAPI、DIC のイメージが重なっています。すべての画像は、下 400 X 倍率が取得されます。スケールバー = 50 μ m。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
この記事は核に細胞質からタンパク質細胞内の変更を検証する高速かつ効率的な方法を提示しました。蛋白質の表現は、(図 3) を汚す DAPI によって核構造を検証した中、GFP 融合によって示されました。ほとんど線虫タンパク質細胞内局在化は GFP、ラズ、mCherry などのマーカー蛋白質とそれらをタグ付けによって特徴付けられる染色線虫蛋白質は挑戦的な18,19,20,21. この記事でgfpタグのターゲット遺伝子exl 1にタンパク質局在を示すために使用されました。核局在化を確認するために使用された DAPI 染色します。2 つの代替方法が提示された DAPI 染色。両方は効率的にまともな作業時間枠内 (1 h 未満) でワームの強い核を示した。エタノールの固定は、小さなサンプル コレクション (収集未満 50 ワーム) 品質観測などに適しています。ワームが完全に乾燥するを防ぐの重要です。ワームから 95% のアルコールが蒸発する、すぐに次のステップに進みます。アセトンの固定は、大規模サンプル コレクション (50 以上の動物を収集) 定量分析などに適しています。ただし、サンプルを洗濯の複数のステップのため、いくつかの標本は失われます。したがって、慎重に上澄みを除去し、可能な限りとして多くのワームを保持することを強くお勧めします。4 ° C で 1 週間のアセトンの固定から生じるスライドを保存ことができます密封されて、一度
このプロトコルは細胞内局在の変化を追跡する興味の他の蛋白質を調整できます。ここで提示する熱ストレス、に加えて他のストレスの試金評価できる、酸化ストレス、重金属ストレス、食事制限など。タンパク質細胞内局在変化は興味の蛋白質の遺伝の背景の変更によっても検査できます。例えば、新規遺伝的相互作用を識別することができるように形質転換線を異なる突然変異体の背景に交差することができます。RNA 干渉 (RNAi) は、特定の遺伝子をノックダウンし、結果のタンパク質細胞内局在変化の調査にも適用でした。これらのアプリケーションは、小説規制コンポーネントを識別するために高金利です。未知の蛋白質の様々 な実験条件を試される、試験試薬濃度などのストレス時間とワームの特定の発達段階。本研究では、5 h と異なる熱応力の温度に 30 分間から、期間が異なるを試みた。3 h 35 ° C で熱ショックは明らかにタンパク質核移行を示します。
DAPI 染色の追加アプリケーションは、減数分裂と有糸分裂のプロセスの検討みみずの生殖細胞22,23,24,25では、特に、核の数、遺伝的変異の背景20,26,27。
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Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
本研究で用いた線虫株は健康の国民の協会 - 研究基盤プログラムのオフィス (P40 OD010440) によってサポートされている線虫の遺伝学センターから得られました。この作品は、NIH によって支えられた: 1R03AG048578-01 6 月亮、淳亮と PSC に CUNY CCRG 1501-CUNY 66184 00 44、6 月梁に 67248 00 45。キャシーの野蛮人-ダンにありがとう親切に彼女の研究室スペースを共有します。クイーンズ大学中核施設ですべての蛍光画像を集めました。ウィリアム ・ j ・ ライスに原稿の彼のコメントありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
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