Summary
该协议演示了如何在热应激下跟踪蛋白质核易位, 方法是使用绿色荧光蛋白 (GFP) 融合蛋白作为标记, 4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色。DAPI 染色协议快速, 保留了 GFP 和蛋白质亚细胞定位信号。
Abstract
本协议采用绿色荧光蛋白 (GFP) 融合蛋白和 4 '、6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色法跟踪蛋白质亚细胞定位变化;特别是在热应力条件下的核易位。蛋白质的反应与外部和内部信号相应。一种常见的机制是改变其亚细胞定位。本文介绍了一种跟踪蛋白质定位的协议, 不需要抗体, 放射性标签, 或共焦显微镜。在这篇文章中, GFP 是用来标记的目标蛋白 EXL-1 在C. 线虫, 一个成员的氯离子胞内通道蛋白 (CLICs) 家族, 包括哺乳动物 CLIC4。采用转化与γ辐射相结合的法, 建立了一种集成的转化exl-1::gfp转基因线 (具有启动子和全基因序列), 并稳定地表达了该基因和gfp。最近的研究表明, 在热应力, 而不是氧化应激, EXL-1::GFP 积累在细胞核。将 GFP 信号与细胞核结构和 DAPI 信号重叠, 证实了 EXL-1 亚细胞在应力作用下的定位变化。本协议提出两种不同的固定方法 DAPI 染色: 乙醇固定和丙酮固定。本文提出的 DAPI 染色协议具有快速、高效的功效, 同时保留了 GFP 信号和蛋白质亚细胞定位的变化。此方法只需要使用 Nomarski、FITC 过滤器和 DAPI 过滤器的荧光显微镜。适用于小型实验室设置、本科生研究、高中学生研究、生物技术教室。
Introduction
蛋白质亚细胞定位的变化是反应热应激、饥饿、氧化应激、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等内部或外部信号的一种常见机制。例如, 热应力诱导一个 foxo 蛋白成员 DAF-16 核易位1,2和亲凋亡 BCL-2 蛋白出价 translocates 的线粒体后, 接受死亡信号3,4。可以使用各种技术来检测这些更改。西方印迹和生化分离亚细胞结构 (如线粒体或细胞核) 的组合可以很好地实现目标3。然而, 它需要一个特定的抗体对抗蛋白质的兴趣。因此, 一个完善的抗体成为成功的关键。另一种方法是标签不同的亚细胞结构或细胞器与各种标记, 如绿色荧光蛋白 (GFP), 红色荧光蛋白 (RFP), 黄色荧光蛋白 (YFP), 和 mCherry, 同时标签的蛋白质与其他标记的兴趣。然后, 观察他们在共聚焦显微镜下, 以本地化目标5,6。放射性同位素是标记靶蛋白, 然后检测其亚细胞定位7的替代选择。但是, 这种方法需要对放射性废料进行适当的训练和处理。在诸如缺乏特定抗体、缺少适当的标记或 scarceness 等设备的情况下, 需要考虑一种替代方法。为了确定蛋白质核易位, 它是有吸引力的仅标记目标蛋白质与标记和染色核与化学试剂 4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI), 因为这只需要常规荧光显微镜。
Immunolabeling线虫具有抗体是挑战, 由于低渗透性的蛋壳或胶原角质层周围的动物。同时, 由于线虫蛋白与脊椎动物的 orthologs 有明显的差异, 一些商业公司提供特定产品的c. 线虫。小实验室很难为自己生成线虫抗体。社区的研究人员经常使用标记蛋白作为标记来显示蛋白质定位或基因表达。本文以 EXL-1::GFP 为例, 在热应力作用下跟踪蛋白质核易位8。将一个集成的平移exl-1::gfp到动物基因组中, 用于稳定地表达gfp融合的基因。研究表明, exl-1在肠道、体壁肌和其他亚细胞结构中表达8。该协议演示如何将蠕虫同步到第四幼虫 (L4) 阶段, 进行热应激实验, 并在常规荧光显微镜下进行 DAPI 染色、乙醇固定、丙酮固定和成像。
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Protocol
1. 解决方案
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NGM 板
- 在2升锥形烧瓶中, 加入3克氯化钠、17克琼脂、2.5 克蛋白胨和975毫升的 dH2o 盖上铝箔的烧瓶口。将烧瓶蒸压50分钟, 冷却20–30分钟。
- 然后添加灭菌的解决方案: 1 毫升的1米 CaCl2, 1 毫升5毫克/毫升胆固醇在乙醇, 1 毫升1米 MgSO4, 25 毫升1米 KPO4 (pH 6.0) 缓冲。漩涡的解决方案, 以混合良好。
- 使用液体分配器, 将 NGM 溶液分配给60毫米的培养板。把2/3 装满琼脂的盘子填满。将它们存放在4摄氏度的气密容器中, 供将来使用。
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1 M KPO4缓冲 (pH 6.0)
- 在 dH2O 中溶解10.83 克的2PO4和3.56 克的 K4HPO2 , 然后将总容积调整为100毫升。蒸压釜解决方案为15分钟。
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M9
- 溶解3克的2PO4, 6 克的 Na2HPO4, 和 5 g 的氯化钠在 dH2O, 添加1毫升1米 MgSO4, 并调整总容积为1升。
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10µg/毫升 DAPI
- 添加1µL 10 毫克/毫升 DAPI 到999µL 的 dH2O。
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95% 酒精 (v/v)
- 测量95毫升100% 酒精和增加蒸馏水调整容量到100毫升。
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30% 丙酮 (v/v)
- 将30毫升丙酮添加到 dH2O, 并将总容积调整为100毫升。
2. 热应力
- 用目标基因9,10的平移结构生成染色体外阵列线。或者, 从秀丽遗传学中心 (CGC) 获得这样的线, 这是一个公共资源的线虫研究, 或从以前发表的研究实验室。
- 通过将蠕虫暴露到 3800 Rad γ辐射9, 将染色体外线整合到基因组中。然后, 选择稳定表达的线条, 使每个动物表达一个标记蛋白, 如 GFP 或滚筒。
- 为了消除辐射过程中产生的突变, outcross 至少2x。利用这一转基因线检测在压力下蛋白质表达模式的变化。
- 如步骤1.1 所述, 准备 NGM 蠕虫板材。OP50 克隆和培养的细菌在液体 LB 汤过夜。用液体 OP50 培养种子 NGM 板, 在一夜之间孵化37摄氏度孵化皿中的盘子, 种植细菌草坪作为蠕虫的食物来源。在使用前, 在室温下冷却30分钟以上的板材。
- 在热应激试验前至少2代, 在20摄氏度不挨饿的情况下种植转基因线。
- 选择8–10年轻的妊娠成人 (子宫充满鸡蛋) 到一个新的蠕虫板块, 然后让他们产卵约 3–5 h 和删除所有的成年人从盘子里。
- 为了同步蠕虫, 让卵孵化和生长幼虫大约48小时到第四幼虫 (L4) 阶段。检查他们的外阴结构 (半月结构), 以确定 L4 阶段 (图 1, 箭头)11。
- 将蠕虫板块与 L4 幼虫放在一个35摄氏度孵化箱中, 2–5 h 以达到热应力。将温度计放在孵化器中, 准确测量温度。
3. DAPI 染色
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乙醇固定
- 在玻璃滑梯的中心添加10µL 的 M9 缓冲器。
- 从步骤2.8 中选取热休克的蠕虫, 并将它们放入玻璃滑梯上的 M9 缓冲区中。
- 或者, 用 M9 把盘子洗掉, 在室温下将其离心 1000 x克1 分钟, 然后丢弃上清。将蠕虫添加到玻璃幻灯片中。
- 用软组织排出多余的液体。在解剖显微镜下观察这一步。
- 在蠕虫上添加10µL 95% 的酒精, 让它们风干。观察解剖显微镜下的过程, 不要让动物变得太干燥。乙醇从动物体内蒸发后立即进行下一步。
注: 乙醇蒸发很快。 - 重复步骤3.1.4 两次, 以便修复蠕虫。
注意: 这是正常的动物看起来更暗和扭曲。 - 添加10µL 的 DAPI (10 µg/毫升) 的蠕虫。立即用盖玻片盖上, 用透明指甲油凝胶封住幻灯片。
- 在荧光显微镜下观察10分钟左右的动物。
-
丙酮固定 (另一种方法)
- 用 M9 从步骤2.8 中冲洗热震板, 在室温下将其离心 1000 x克, 并丢弃上清液。用1毫升 dH2O 清洗颗粒, 收集颗粒, 并丢弃上清液。
- 在室温下添加400µL 30% 丙酮, 15 分钟离心机, 常温下1分钟, 并丢弃上清液。使用500µL 的 dH2O 洗涤动物2x。放弃上清。
- 添加200µL 的 DAPI (10 µg/毫升), 或4x 的总量蠕虫的体积, 在管15分钟。
- 离心机在 1000 x g 1 分钟, 并丢弃上清。用500µL 洗净颗粒 2x2o 将蠕虫放在玻璃滑梯上, 用盖玻片覆盖, 用透明指甲油凝胶封住幻灯片, 并在荧光显微镜下观察动物。
4. 显微成像
- 打开紫外线光源和荧光显微镜。打开连接到显微镜的计算机。
- 在荧光显微镜上加载幻灯片。使用低功耗物镜 (10X) 定位蠕虫, 增加放大功率到 400X, 并专注于标本。
- 打开显微镜提供的软件。点击菜单中的 "获取";点击 "相机", 选择相机连接到显微镜;这允许选定的照相机与软件通信。
注: 不同的显微镜在操作上可能有所不同。 - 在相同的 "获取" 下, 单击 "多维获取"。这将打开一个新的 "多维获取" 导航窗口。单击 "多声道" 按钮, 所有可用的频道都会出现。
- 选择蓝色、绿色和 DIC (差异干扰对比度) 观察标本。在 "多维采集" 导航窗口中, 留下 "蓝 DAPI"、"绿 GFP"、"灰 DIC"、"Nomarski" 频道;右键单击其他通道, 如 "红色罗丹明" 和 "白光场", 以关闭它们。
-
首先, 测量每个通道的曝光时间:
- 左键点击 "蓝 DAPI" 频道选择它, 然后点击 "测量", 以采取在 DAPI 通道下的实时图像与自动曝光时间。将出现一个具有实时图像的新窗口。
- 在 "实时图像" 窗口的左侧, 如果需要, 手动调整曝光时间以使图像达到预期效果。
- 最后, 在 "实时图像" 窗口中单击"确定"。这将设置 DAPI 通道下的曝光时间。
- 重复步骤 4.6, 为其他渠道, "绿色 GFP" 和 "灰色 DIC", "Nomarski", 设置的曝光时间, 这些渠道。
- 在 "多维采集" 导航窗口中, 单击 "开始" 以根据设定的特定曝光时间自动收集3不同通道下的3幅图像 (见上文)。
- 要保存文件, 请转到主菜单, 单击 "文件" 然后在 "另存为"。输入文件名和文件夹名称。将文件保存为默认文件格式, 以保留详细的图像信息以供将来参考。
-
以其他格式导出文件:
- 转到 "文件", 然后单击 "导出"。这将打开 "导出设置" 窗口。
- 设置文件名和文件夹。检查 "创建项目文件夹" 以更好地组织数据。该软件还允许用户指定其他4选项: "生成合并图像"、"使用通道图像的颜色"、"使用通道名称" 和 "仅合并图像"。
- 从下拉菜单中选择所需的文件类型, 如 "TIF"、"BMP"、"PSD" 或 "JPG" 等类型。然后单击 "开始" 导出。
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Representative Results
氯离子胞内通道蛋白 (点击) 是一种在12种高度保守的多功能蛋白质。许多研究表明, CLICs 调节细胞的压力, 自噬, 凋亡, 癌变, 血管生成和巨噬细胞先天免疫反应在哺乳动物系统13,14,15,16 ,17。线虫中有两个点击同系物: exl-1和exc-4。我们最近的研究表明, exl-1调控动物的压力管理8。我们将一个平移exl-1::gfp结构整合成一个动物基因组, 并创建了转基因线, 它以 gfp 作为标记稳定地表达基因exl-1 (图 2A和2B)。在热应激下, EXL-1::GFP 在肠道内的细胞核积聚, 因为强烈的 GFP 信号与细胞核结构重叠 (图 2C-E)。为了确认亚细胞定位, DAPI 染色作为一种染色细胞核的方法。用乙醇固定 DAPI 染色显示动物体内有清晰的细胞核 (图 3B)。丙酮固定也达到类似的结果 (图 3E)。重叠的 GFP 和 DAPI 信号证实 EXL-1::GFP 确实在肠道内的细胞核中积聚 (图 3C, F)。
图 1: 在不同的放大功率下, 第四幼虫 (L4) 级线虫的图像。(A) 63X、 (B) 115X 和(C) 400X 放大功率。箭指向 L4 蠕虫的外阴;注意半月结构。缩放栏 = 所有图像中的100µm。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在热应力下, EXL-1::GFP 积聚在肠道的细胞核中.(A)热休克前肠道区域的 Normaski 图像。(B)在热休克之前, instestinal 地区发现了强烈的 GFP 信号。(C)热休克后肠道区域的 Normaski 图像 (箭头指向肠道区域的细胞核)。(D)热休克后, 强烈的 GFP 信号积聚。(E) GFP 和 Normaski 的重叠图像。所有图片都采用400X 放大功率。缩放栏 = 所有图像中的50µm。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: DAPI 染色证实了 EXL-1::GFP 核易位.(丙)用乙醇固定法 DAPI 染色。(D F)用丙酮固定法 DAPI 染色。在A和D, 绿色颜色显示 GFP 信号在肠道区域。在B和E中, 蓝颜色通过 DAPI 染色显示细胞核。C和F显示了 GFP、DAPI 和 Normaski 的重叠图像。缩放栏 = 所有图像中的50µm。请单击此处查看此图的较大版本.
补充数字:丙酮固定保存标本和60天后, 丙酮固定, GFP 和 DAPI 信号仍然可见。绿色是用于 GFP 的。(B)蓝色用于 DAPI 信号。(C) GFP、DAPI 和 DIC 的重叠图像。所有图像都是在400X 放大功率下拍摄的。刻度条 = 50 微米。请单击此处下载此文件.
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Discussion
本文提出了一种快速有效的方法来验证蛋白质亚细胞变化从细胞质到细胞核。蛋白表达由 GFP 融合显示, 而核结构由 DAPI 染色验证 (图 3)。由于染色线虫蛋白具有挑战性, 大多数C. 线虫蛋白亚细胞定位的特点是标记它们与标记蛋白, 如 GFP, 拉扎, mCherry, 和其他18,19,20,21. 在本文中, gfp被用来标记目标基因exl-1 , 以显示其蛋白质细胞定位。为确定核定位, 采用了 DAPI 染色法。提出了两种不同的 DAPI 染色方法。两者都有效地显示了在一个体面的工作时间框架 (少于1小时) 蠕虫的强核。乙醇固定适用于小样本收集, 如质量观察 (收集少于50蠕虫)。防止蠕虫完全干燥是关键。一旦95% 酒精从蠕虫中蒸发, 立即进行下一步。丙酮固定适合大规模的样本收集, 如定量分析 (收集超过50动物)。然而, 由于洗涤样品的多个步骤, 一些标本将丢失。因此, 强烈建议仔细清除上清, 并保留尽可能多的蠕虫。一旦密封, 由丙酮固定产生的幻灯片可以储存一个星期在4摄氏度。
该协议可以调整到其他感兴趣的蛋白质跟踪亚细胞定位变化。除了这里提出的热应力外, 还可以评估其他的应力检测方法, 如氧化应激、重金属胁迫、饮食限制等。蛋白质亚细胞定位的变化也可以通过改变兴趣蛋白的遗传背景来检验。例如, 转基因线可以交叉成一个不同的突变体的背景, 从而可以确定新的基因相互作用。rna 干扰也可以应用于特定基因的敲除, 并研究产生的蛋白质亚细胞定位变化。这些应用程序对识别新的管理组件非常感兴趣。对于未知的蛋白质, 应测试各种实验条件, 如检测试剂浓度、应力时间的长短以及蠕虫的特定发育阶段。在我们的研究中, 我们尝试了不同的工期, 从30分钟到5小时, 以及不同的热应力温度。热休克在35°c 为 3 h 清楚地显示蛋白质核易位。
DAPI 染色的其他应用包括检查蠕虫的减数分裂和有丝分裂过程, 特别是在生殖细胞22、23、24、25和一个计数的核基因突变体的背景20,26,27。
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Disclosures
作者没有什么要申报的。
Acknowledgments
本研究使用的C. 线虫菌株取自秀丽遗传学中心, 由国立卫生研究院 (P40 OD010440) 提供支持。这项工作得到了 NIH 的支持: 1R03AG048578-01, 纽约市立大学-CCRG 1501 至俊良, 和 PSC-纽约市立大学 66184-00 44 和 67248-00 45 至俊良。我们感谢凯西野蛮-邓恩亲切地分享她的实验室空间。所有荧光图像都收集在皇后学院的核心设施。我们感谢威廉 j. 赖斯对手稿的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
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