Summary
Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.
Abstract
Neste protocolo, uma proteína de fusão de proteína (GFP) fluorescência verde e 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração são usados para controlar alterações de Localização subcellular da proteína; em particular, uma translocação nuclear sob um calor salientar a condição. As proteínas reagem sinais correspondentemente para interno e externos. Um mecanismo comum é mudar sua localização subcellular. Este artigo descreve um protocolo para rastrear a localização da proteína que não requer um anticorpo, etiquetar radioativo ou um microscópio confocal. Neste artigo, GFP é usado para marcar a proteína alvo EXL-1 em c. elegans, um membro da família cloreto intracelular canal proteínas (CLICs), incluindo mamíferos CLIC4. Uma linha de transgénicos integrado translacional exl-1::gfp (com um promotor e uma sequência genética completa) foi criada por transformação e γ-radiação e estàvel expressa o gene e gfp. Pesquisas recentes mostraram que em cima de stress de calor, estresse oxidativo não, EXL-1::GFP acumula-se no núcleo. Sobrepondo o sinal GFP com a estrutura de núcleos e o DAPI sinais confirma as alterações de Localização subcellular EXL-1 sob estresse. Este protocolo apresenta dois métodos de fixação diferentes para coloração de DAPI: fixação de etanol e fixação de acetona. O protocolo de coloração de DAPI apresentado neste artigo é rápido e eficiente e preserva tanto o sinal GFP e as mudanças de Localização subcellular da proteína. Este método requer apenas um microscópio de fluorescência com Nomarski, um filtro FITC e um filtro DAPI. É apropriado para um ajuste pequeno laboratório, pesquisa de estudante de graduação, pesquisa de estudantes de ensino médio e salas de aula de biotecnologia.
Introduction
Uma mudança de localização Subcellular da proteína é um mecanismo comum em resposta a sinais internos ou externos, tais como o stress de calor, fome, estresse oxidativo, apoptose, fosforilação de proteínas e outros. Por exemplo, stress de calor induz um membro FOXO DAF-16 translocação nuclear1,2e a proteína BCL-2 de pro-apoptotic que oferta translocates para a mitocôndria após recebimento morte sinalização3,4. Várias técnicas estão disponíveis para detectar essas alterações. Uma combinação de mancha ocidental e bioquimicamente isolando estruturas subcelulares (por exemplo, as mitocôndrias ou núcleos) bem poderia alcançar o objetivo3. No entanto, requer um anticorpo específico contra a proteína de interesse. Um anticorpo bem-estabelecida torna-se assim, a chave para o sucesso. Uma abordagem alternativa é para rotular diferentes estruturas subcelulares ou organelas com vários marcadores tais como proteínas fluorescência verde (GFP), proteína de fluorescência vermelha (RFP), proteína de fluorescência amarela (YFP) e mCherry e enquanto isso rotular a proteína de interesse com outros marcadores. Em seguida, observá-los sob um microscópio confocal para localizar os alvos5,6. Isótopos radioativos são uma escolha alternativa para rotular as proteínas alvo e então detectando sua localização subcellular7. No entanto, este método requer formação adequada e tratamento de resíduos radioactivos. Em circunstâncias como a falta de um anticorpo específico, a ausência de um marcador adequado ou a escassez de equipamentos, tais como um microscópio confocal, uma abordagem alternativa precisa ser considerado. Para identificar uma translocação nuclear da proteína, é atraente para rotular apenas as proteínas alvo com um marcador e manchar os núcleos com o reagente químico 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), desde que isto requer apenas um microscópio de fluorescência regular.
Immunolabeling c. elegans com anticorpos é desafiadora devido a baixa permeabilidade da casca da ovo ou da cutícula colágenas em torno do animal. Entretanto, desde que o c. elegans proteínas são significativamente divergentes de suas orthologs de vertebrados, algumas empresas comerciais fornecem c. elegans com produtos específicos. É difícil para um pequeno laboratório gerar anticorpos c. elegans por si mesmos. Pesquisadores na Comunidade usam proteínas etiquetadas como marcadores para demonstrar uma expressão de localização ou do gene da proteína. Este artigo usa EXL-1::GFP como um exemplo, para controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor8. Uma translação integrado exl-1::gfp no genoma do animal é usado para expressar estàvel o gene com fusão de gfp . Pesquisas mostraram que exl-1 é expressa no intestino, músculo da parede do corpo e outras estruturas subcelulares8. Este protocolo demonstra como sincronizar vermes à fase larval quarta (L4), executar um calor stress experimento e conduta DAPI de coloração, etanol fixação, fixação de acetona e imagem de um microscópio de fluorescência regular.
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Protocol
1. soluções
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Placas NGM
- Em um Erlenmeyer de 2 L, adicione 3 g de NaCl, 17 g de ágar-ágar, 2,5 g de peptona e 975 mL de dH2tampa do O. a boca do balão com folha de alumínio. Autoclave o balão de 50 min. resfriá-lo por 20 a 30 min.
- Em seguida, adicionar soluções esterilizadas: 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO4e 25 mL de tampão de4 (pH 6,0) de KPO 1 M. Agite as soluções para misturá-los bem.
- Usando um líquido dispensador, dispense a solução NGM para placas de Petri de 60 mm. Enche as 2/3 placas de ágar-ágar. Armazená-los em um recipiente hermético a 4 ° C para uso futuro.
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Buffer de4 M 1 KPO (pH 6,0)
- Dissolver 10,83 g de KH2PO4 e 3,56 g de K2HPO4 em dH2O e, em seguida, ajustar o volume total de 100 mL. Autoclave a solução por 15 min.
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M9
- Dissolver 3 g de KH2PO4, 6G Na2HPO4, 5g de NaCl em dH2O, adicionar 1 mL de 1 M MgSO4e ajustar o volume total de 1 L.
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DAPI 10 µ g/mL
- Adicione 1 µ l de 10 mg/mL DAPI em 999 µ l de dH2O.
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álcool a 95% (v/v)
- Medir 95 mL de álcool a 100% e adicionar água destilada para ajustar o volume a 100 mL.
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acetona 30% (v/v)
- Adicionar 30 mL de acetona para dH2O e ajustar o volume total de 100 mL.
2. Stress de calor
- Gere uma matriz extracromossômico linha com uma construção translacional de alvo genes9,10. Como alternativa, obter tais linhas de Caenorhabditis genética Center (CGC), que é um recurso público para pesquisa de c. elegans , ou um laboratório de pesquisa publicados anteriormente.
- Integre as linhas extracromossômico o genoma, expondo worms para 3.800 Rad γ-radiação9. Em seguida, selecione as linhas estàvel expressas para que cada animal expressa uma proteína marcador como um rolo ou GFP.
- Para remover mutações geradas durante a radiação, outcross as linhas pelo menos 2 x. Usamos esta linha de transgênica para detectar alterações de padrão de expressão de proteínas sob estresse.
- Prepare-se placas de worm NGM conforme descrito no passo 1.1. Raia um clone OP50 e cultura de bactérias no líquido LB caldo durante a noite. Sementes, as placas NGM com líquido OP50 cultura e incubam as placas em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para crescer um gramado de bactérias como fonte de alimento para os vermes. Arrefecer as placas em temperatura ambiente pelo menos 30 min antes de usar.
- Cresce a linha transgénica a 20 ° C, sem fome pelo menos 2 gerações anteriores o ensaio de stress de calor.
- Pick 8 – 10 jovens adultos gravid (útero repleto de ovos) para uma nova placa de verme e, em seguida, deixá-los pôr ovos para cerca de 3 – 5 h e retire todos os adultos as chapas.
- Para sincronizar os vermes, deixe os ovos eclodem e crescem as larvas para cerca de 48 h, a quarta fase larval (L4). Examine sua estrutura de vulva (uma estrutura de meia-lua) para identificar a L4 de fase (Figura 1, seta)11.
- Coloca as placas de verme com as larvas L4 em uma incubadora de 35 ° C por 2 – 5 h atingir o stress de calor. Coloque um termómetro na incubadora para medir com precisão a temperatura.
3. DAPI coloração
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Fixação de etanol
- Adicione 10 µ l de buffer M9 no centro de uma lâmina de vidro.
- Escolher os vermes de calor-choque da etapa 2.8 e colocá-los para o buffer de M9 sobre a lâmina de vidro.
- Alternativamente, lavar a placa com M9-centrifugar a 1.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. Adicione os vermes para a lâmina de vidro.
- Use um tecido macio para escorrer qualquer excesso de líquido. Cuidado com este passo, sob um microscópio de dissecação.
- Adicionar 10 µ l de álcool a 95% para os vermes e deixe-os secar ao ar. Observar o processo sob um microscópio de dissecação e não deixe que os animais ficam muito secas. Imediatamente após o etanol evaporou-se dos animais, prossiga para a próxima etapa.
Nota: O etanol evapora muito rapidamente. - Repita a etapa 3.1.4 duas vezes para que os vermes são fixos.
Nota: É normal que os animais se parece mais escuro e distorcido. - Adicionar 10 µ l de DAPI (10 µ g/mL) para os vermes. Imediatamente, cubra-os com uma lamela e selar o slide com gel verniz transparente.
- Ver os animais depois de cerca de 10 min em um microscópio de fluorescência.
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Fixação de acetona (uma abordagem alternativa)
- Lave a placa de calor-choque da etapa 2.8 com M9-centrifugar a 1.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. Lavar o sedimento com 1 mL de dH2O, recolher a pelota e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 400 µ l de acetona 30% por 15 min. centrifugar a 1.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. Use 500 µ l de dH2O para lavar os animais 2 x. Desprezar o sobrenadante.
- Adicionar 200 µ l de DAPI (10 µ g/mL), ou 4 vezes a quantidade do volume total dos vermes, no tubo durante 15 minutos.
- Centrifugar a 1.000 x g por 1 min e descartar o sobrenadante. Lave o pellet 2 x com 500 µ l de dH2O. Coloque as minhocas em lâminas de vidro, cobri-los com lamelas, selar o slide com gel transparente unha polonês e observar os animais sob um microscópio de fluorescência.
4. microscópica imagiologia
- Ligue a fonte de luz UV e um microscópio de fluorescência. Ligue o computador conectado ao microscópio.
- Carrega o slide sobre o microscópio de fluorescência. Use uma lente objetiva de baixa potência (10 X) para localizar os vermes, aumentar o poder de ampliação de 400x e concentrar a amostra.
- Abra o software fornecido com o microscópio. Clique em "Aquisição" no menu; clique em "Camera" e selecione a câmera conectada ao microscópio; Isso permite que a câmera selecionada para se comunicar com o software.
Nota: Diferentes microscópios podem variar em operação. - Sob a mesma "aquisição", clique em "Aquisição Multidimensional". Isso abre uma nova janela de navegação "Aquisição Multidimensional". Clique no botão "Multicanal", e aparecerão todos os canais disponíveis.
- Escolha o azul, verde e DIC (contraste de interferência diferencial) para observar a amostra. Na janela de navegação "Aquisição Multidimensional", deixar o "Blue-DAPI", "GFP-Green" e "Grey-DIC", "Nomarski" canais botão direito do mouse em outros canais, tais como "Vermelho-rodamina" e "campo branco-brilhante", para fechá-las.
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Em primeiro lugar, medir o tempo de exposição para cada canal:
- Clique no canal "Azul-DAPI" para selecioná-lo e depois clique em "Medida" para ter uma imagem ao vivo no canal de DAPI com o tempo de exposição automática. Aparecerá uma nova janela com uma imagem ao vivo.
- No lado esquerdo da janela de imagem ao vivo, ajuste manualmente o tempo de exposição se necessário para fazer a imagem conforme desejado.
- Finalmente, clique em ' 'Okey "na janela de imagem ao vivo. Isso define o tempo de exposição sob o canal da DAPI.
- Repita a etapa 4.6 para os outros canais, "GFP-Green" e "Grey-DIC", "Nomarski", para configurar os tempos de exposição para esses canais.
- Na janela de navegação "Aquisição Multidimensional", clique em "Start" para coletar automaticamente 3 imagens sob os 3 canais diferentes em ordem (veja acima), com tempos de exposição específicas como conjunto.
- Para salvar o arquivo, vá para o menu principal, clique em "Arquivo" e depois em "Salvar como". Nome do arquivo de entrada e o nome da pasta. Salve o arquivo como o formato de arquivo padrão para preservar as informações detalhadas da imagem latente para referência futura.
-
Para exportar o arquivo em outros formatos:
- Vá ao menu "arquivo" e clique em "Exportar". Isto abrirá uma janela de configuração de exportação.
- Definir o nome do arquivo e pasta. Verifique a "Criar uma pasta de projeto" para melhor organiza os dados. O software também permite ao usuário especificar 4 outras opções: "Generate fundiu-se imagens", "Usar cor para imagens de canal", "Uso nomes de canal" e "Só para a imagem mesclada".
- Escolha um tipo de arquivo desejado no menu suspenso, como "TIF", "BMP", "PSD", ou "JPG" e outros tipos. Em seguida, clique em "Iniciar" para exportar.
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Representative Results
As proteínas intracelulares do canal de cloreto (CLIC) são proteínas multifunctional que são altamente conservadas em toda espécie de12. Muita pesquisa mostra que os CLICs regular stress celular, autofagia, apoptose, carcinogênese, angiogênese e a resposta imune inata do macrófago no sistema mamíferos13,14,15,16 ,17. Existem dois homologs CLIC em c. elegans: exl-1 e 4-exc. Nosso estudo recente mostrou que exl-1 regula animal stress gestão8. Estamos integrados a uma construção de translação exl-1::gfp um genoma animal e criou linhas transgénicas, que expressam estàvel gene exl-1 com um GFP como marcador (Figura 2A e 2B). Sob estresse de calor, EXL-1::GFP acumula no núcleo na região intestinal, desde que o sinal forte do GFP sobrepõe-se com a estrutura do núcleo (Figura 2 C -E). Para confirmar a Localização subcellular, DAPI coloração foi usada como uma abordagem para manchar os núcleos. Usando a fixação de etanol para os DAPI coloração mostra claros núcleos no corpo animal (Figura 3B). Fixação de acetona também alcança resultados semelhantes (Figura 3E). Os sinais GFP e DAPI sobrepostos confirmam que EXL-1::GFP com efeito acumulado nos núcleos na região intestinal (Figura 3, F).
Figura 1: Imagens de uma quarta larval (L4) fase c. elegans sob poderes de ampliação diferentes. (A) 63 X (B) 115 X, poder e (C) 400 X ampliação. As setas apontam para a vulva de uma minhoca de L4; Observe a estrutura de meia-lua. Barra de escala = 100 µm em todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: sob estresse de calor, EXL-1::GFP acumula-se nos núcleos do intestino. (A) Normaski a imagem de uma região intestinal antes de choque do calor. (B) um sinal forte de GFP foi observado na região instestinal antes de choque do calor. (C) Normaski imagem da região intestinal depois de choque do calor (ponto de flechas para os núcleos da região intestinal). (D) um forte sinal GFP acumula depois de choque do calor. (E) se sobrepõem imagem de GFP e Normaski. Todas as fotos são tiradas com poder de ampliação X 400. Barra de escala = 50 µm em todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: translocação nuclear EXL-1::GFP é confirmada pela coloração de DAPI. (A-C) Usando a fixação de etanol para coloração de DAPI. (D-F) Usando a fixação de acetona para coloração de DAPI. Em A e D, a cor verde mostra sinal de boas práticas agrícolas na região intestinal. Em B e E, a cor azul mostra núcleos manchando DAPI. C e F mostram imagens sobrepostas de GFP, DAPI e Normaski. Barra de escala = 50 µm em todas as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura complementar: Fixação acetona preserva o espécime e 60 dias após a fixação de acetona, sinais GFP e DAPI são ainda observáveis. (A) verde é para as boas práticas agrícolas. (B) azul é sinal de DAPI. (C) se sobrepõem imagem de GFP, DAPI e DIC. Todas as imagens são durassem abaixo dos 400 X ampliação. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este artigo apresenta um método rápido e eficiente para verificar as alterações Subcellular da proteína do citoplasma para o núcleo. A expressão da proteína foi mostrada por uma fusão de GFP, enquanto a estrutura do núcleo foi verificada por DAPI coloração (Figura 3). Desde que immunostaining proteínas de c. elegans é um desafio, a maioria das localizações da proteína c. elegans subcellular caracterizam-se por marcá-los com proteínas marcador como GFP, Laz, mCherry e outros18,19 , 20 , 21. neste artigo, gfp foi usado para marcar o alvo gene exl-1 para demonstrar sua localização celular da proteína. Para confirmar a localização nuclear, DAPI coloração foi usada. Apresentaram-se dois métodos alternativos para a coloração de DAPI. Ambos com eficiência mostraram fortes núcleos em vermes dentro de um frame de tempo de trabalho decente (menos de 1 h). A fixação de etanol é adequada para uma coleção pequena amostra como uma observação de qualidade (coleta de menos de 50 vermes). Impedindo que os vermes secagem completamente é a chave. Uma vez que o álcool 95% evapora do vermes, imediatamente para a próxima etapa. A fixação de acetona é adequada para uma coleta de amostra em grande escala como uma análise quantitativa (coletando mais de 50 animais). No entanto, devido as várias etapas de lavagem da amostra, algumas amostras serão perdidas. Assim, é altamente recomendável cuidadosamente, remover o sobrenadante e reter tantos vermes quanto possível. Uma vez que elas são lacradas, slides resultantes da fixação de acetona podem ser armazenadas por uma semana a 4 ° C.
Este protocolo pode ser ajustado para outras proteínas de interesse para controlar as alterações de Localização subcellular. Além do stress de calor aqui apresentado, outros ensaios de stress puderam ser avaliados, tais como o estresse oxidativo, stress de heavy metal, restrições alimentares e outros. Mudança de Localização subcellular da proteína também poderia ser analisada, alterando a base genética da proteína de interesse. Por exemplo, a linha transgênica pode ser atravessada em plano de fundo do mutante diferente, para que o romance interação genética pode ser identificada. RNA de interferência (RNAi) também pode ser aplicado para derrubar genes específicos e investigar a mudança de Localização subcellular da proteína resultante. Esses aplicativos são de grande interesse para identificar novos componentes regulatórios. Para uma proteína desconhecida, várias condições experimentais devem ser testadas, tais como as concentrações de reagente teste, a duração do tempo de stress e fase de desenvolvimento específico dos vermes. Em nosso estudo, tentamos diferentes durações, de 30 min a 5h e temperaturas de stress de calor diferentes. Um choque de calor a 35 ° C por 3 h demonstra claramente uma translocação nuclear da proteína.
Aplicações adicionais de DAPI coloração incluem o exame do processo de meiose e mitose em worms, especialmente na linha germinativa células22,23,24,25e uma contagem do número de núcleos em um fundo20,26,27. do mutante
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Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
As cepas de c. elegans utilizadas neste estudo foram obtidas a partir do centro de genética Caenorhabditis, que é apoiado pelo National Institutes of Health - escritório da infra-estrutura de programas de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi financiado pelo NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang e PSC-CUNY 66184-00 44 e 45 67248-00 a Jun Liang. Agradecemos Cathy Savage-Dunn gentilmente partilha o seu espaço de laboratório. Todas as imagens de fluorescência foram coletadas no Queens College Core Facility. Agradecemos a William J. Rice por seus comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
References
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