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Methodenartikel

Intravenöse und Intra-Fruchtwasser In der Gebärmutter Transplantation in den Mausmodell

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DOI:

10.3791/58047

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9. Oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of General, Thoracic, and Fetal Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia, 2Division of Plastic Reconstructive Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für eine Transplantation in Utero (IUT) durch intravenöse und Intra-Fruchtwasser Routen der Injektion in das Mausmodell ausführen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, Zellen, virale Vektoren und anderen Stoffen in die einzigartige immun-toleranten fetalen Umgebung einzuführen.

Zusammenfassung

In der Gebärmutter Transplantation (IUT) ist eine einzigartige und vielseitige Art der Therapie, die verwendet werden, um Stammzellen, virale Vektoren oder anderen Substanzen früh in der Schwangerschaft einzuführen. Das Grundprinzip hinter IUT zu therapeutischen Zwecken basiert auf die geringe Größe des Fötus, der fetalen immunologische unreife, die Zugänglichkeit und proliferative Natur der fetalen Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen und das Potenzial zur Behandlung einer Krankheit oder dem Auftreten von Symptomen vor der Geburt. Unter Ausnutzung dieser normalen Entwicklungsstörungen Eigenschaften des Fötus, die Lieferung der Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) über ein IUT hat das Potenzial zur Behandlung von angeborener hämatologischen Erkrankungen wie Sichelzellenanämie, ohne die erforderliche Bolusinjektion oder immunsuppressive Klimaanlage erforderlich für postnatale HSC-Transplantationen. In ähnlicher Weise erlaubt die Zugänglichkeit von Vorläuferzellen in mehreren Organen während der Entwicklung potenziell für eine effizientere Ausrichtung der Stamm/Progenitorzellen nach einem IUT von viralen Vektoren für die Gentherapie oder Genom-Bearbeitung. Darüber hinaus kann IUT zur Untersuchung von normalen Entwicklungsprozesse einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Entwicklung der immunologischen Toleranz. Das Mausmodell bietet eine wertvolle und erschwingliche Mittel zum Verständnis der Möglichkeiten und Grenzen der IUT vor großen Tieren vorklinik und eine mögliche klinische Anwendung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung eines IUT in murinen Fötus durch intravenöse und Intra-Fruchtwasser Routen. Dieses Protokoll wird erfolgreich eingesetzt, um die notwendigen Bedingungen und Mechanismen hinter in Utero hämatopoetische Stammzell-Transplantation und Toleranzinduktion in Utero Gentherapie zu erhellen.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in pränatale Screening und Diagnose haben die Möglichkeit der Behandlung von den Fötus für eine Reihe von angeborenen Störungen, die nicht über ausreichende postnatale Behandlungsmöglichkeiten und erheblicher Morbidität und Mortalität zur Folge Licht gebracht. Insbesondere haben in Utero Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (IUHCT) und Gen-Therapie/Genom-Bearbeitung das Potenzial, normale Entwicklungsstörungen Eigenschaften des Fötus zur Behandlung von angeborenen hämatologischen, Immun- und genetischen nutzen effizienter als postnatale HSC-Transplantation und Gen-Therapie/Genom-Bearbeitung1,2vermag Störungen. Insbesondere kann aufgrund der geringen Größe des Fötus, die Spender Zelle oder viralen Vektoren Dosis pro das Gewicht des Empfängers maximiert werden. Darüber hinaus ermöglicht die immunologische Unreife des Fötus, dass Spender HSCs injiziert werden, ohne die Bolusinjektion und immunsuppressive Konditionierung, die in den Protokollen der postnatalen Transplantation erforderlich ist. In ähnlicher Weise können virale Vektoren mit einem therapeutischen Transgen oder Genom-Bearbeitungs-Technologie ohne eine einschränkende Immunantwort auf das Transgen-Produkt oder die viralen Vektoren injiziert werden. Schließlich leisten die Zugänglichkeit und proliferative Natur des fetalen Stammzellen/Vorläuferzellen die Möglichkeit, eine effizientere Transduktion Ziel Vorläuferzellen sowie bestimmte Modi des Genoms bearbeiten (unter der Regie von Homologie Reparatur) erfordern Radfahren Zellen effizient auftreten. Das Mausmodell dient als eine aufschlussreiche und erschwingliche Mittel auf wichtige Fragen in Stammzellbiologie und Immunologie vor in präklinischen große Tiermodellen zu experimentieren und als solche diente als das primäre Modell in der IUHCT und in der Gebärmutter Gen-Therapie wurden erkundet1,2,3.

Obwohl viele Variablen eine wichtige Rolle für den Erfolg der IUHCT und in Utero Gen Therapie/Genom-Bearbeitung in murinen und große Tiermodellen spielen, ist eine wichtige Variable die Methode der Lieferung der HSCs oder viralen Vektoren. Die Lieferung von hohen Dosen von Hsz Spender mit einem First-Pass-Effekt in der fetalen Leber, das blutbildende Organ zum Zeitpunkt der IUHCT auftretenden nachweislich maßgeblich bei der Erreichung Macrochimeric Ebenen des Engraftment in Maus und große Tiermodellen4 ,5. Dies wurde erreicht durch eine Injektion von Spender Zellen über die dotterhäutchen Vene im Mausmodell und über eine Intra kardiale Injektion im eckzahn Modell. Die Route der Einspritzung spielt auch eine wesentliche Rolle bei der Ausrichtung der Vorläuferzellen der verschiedenen Organe während der Entwicklung. Zum Beispiel eine intravenöse Injektion über die dotterhäutchen Vene nachweislich effizient transduzieren Kardiomyozyten und Hepatozyten nach einem späten Schwangerschaft Injektion6,7. Alternativ kann eine Intra-Fruchtwasser Injektion von viralen Vektoren, die Ausrichtung der Organe, die physisch ausgesetzt sind, basierend auf der Faltung/Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Injektion8. Dies ist am besten veranschaulicht durch die Ausrichtung der respiratorischen Epithel über einer Intra-Fruchtwasser Injektion spät in der Schwangerschaft normal "atmen" Kindsbewegungen, nutzen die Macht der Atemwege zu den viralen Vektoren in der Fruchtblase Fluid-9. Diese beiden Modi der IUT intravenös über die Vene dotterhäutchen und Intra-Fruchtwasser, wurden die Grundlage für mehrere abgeschlossene und laufende Experimente in unserem Labor. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methoden zum Ausführen von intravenösen und Intra-Fruchtwasser IUT in das Mausmodell.

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Protokoll

Die experimentelle Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee bei The Children Hospital of Philadelphia genehmigt.

1. Erstellung der Injektion Pipetten

  1. Mit einem vertikalen Mikropipette Abzieher, ziehen Sie einer 100 µL Microcapillary Pipette (Abbildung 1A - 1 C). Die Mikropipette Abzieher zu kalibrieren, so dass das spitz zulaufende Ende > 1 cm lang ist.
    Hinweis: Zunächst sollten die Einstellungen der Abzieher für eine optimale Länge angepasst werden. Eine höhere Leistungsstufe wird die Spitze länger, und eine höhere Einstellung ziehen machen den Durchmesser der Spitze schmaler.
  2. Schneiden Sie das spitz zulaufende Ende, so dass es ≥ 1 cm lang ist. Stellen Sie sicher, dass der innere Durchmesser an der Spitze der Nadel zwischen 70 µm und 100 µm ist, es umgekehrt proportional zur Länge der das spitz zulaufende Ende ist.
    Hinweis: Der innere Durchmesser hängt auch von der Kalibrierung der Mikropipette Abzieher. Sehen Sie die Anweisungen des Herstellers des vertikalen Mikropipette Abzieher oder andere bevorzugte Mikropipette Puller.
  3. Erstellen Sie nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Nadel die richtigen Innendurchmesser hat die Abschrägung von 15-20 Grad durch schärfen die Spitze mit einer Mikropipette schweißkantenformer mit einem Diamanten Schleifen Rad (Abbildung 2A - 2 C). Achten Sie darauf, die Spitze vorsichtig auf das Rad ohne zu viel Druck, um Chancen zu brechen oder reißen die Spitze zu verringern ruhen.
    Hinweis: Ein Pinsel kann jeglichen Schmutz abwischen, die aufbaut auf der Spitze der Nadel verwendet werden.
  4. Bewerten Sie die Spitze unter dem Mikroskop zu und sicherzustellen Sie, dass die Spitze Runde ohne Chips oder Risse. Den Innendurchmesser, um sicherzustellen, dass es zwischen 70 µm und 100 µm (Abb. 2D - 2 H) ist neu zu bewerten.
  5. Zeichnen von Linien auf den Rest der Nadel, 5 µL Volumen zwischen ihnen zu benennen (z. B.Nadeln mit einem Innendurchmesser von 1,3 mm hätte Linien bei 3,77 mm-Schritten).
  6. Autoklaven die Nadeln vor der Verwendung in der Chirurgie und behandeln sie mit sterilen Handschuhen.

2. in Utero Injektionen

  1. Bereiten Sie die notwendigen Instrumente durch Autoklavieren sie vor der Zeit. Wesentliche Instrumente wie Microinjector Nadelhalter, eine chirurgische Nadel-Fahrer, ein paar Adson Pinzette, ein paar gebogene regelmäßige Gewebe Schere, eine 1 mL Spritze mit Insulin, ein paar Wattestäbchen Applikatoren, eine transferpipette, eine 50 mL konische Rohr, und eine Packung mit 4: 0 Polyglactin 910 Nähte.
  2. Mit einer sterilen Technik, legen Sie die Nadel auf den Nadelhalter und stecken Sie es in die Microinjector.
    Hinweis: Die Einstellungen des komprimierten Stickstoffs verwendet sind, wie folgt: 4-6 Psi zu injizieren, balance 0 Psi. Je nachdem, was insbesondere die Viskosität der Injectate, sowie die Größe der Mikropipette injiziert, werden die einspritzzeiten variieren zwischen 0,3 - 1,5 s.
  3. Reinigen Sie die Nadelspitze von möglichen Fremdkörpern 5-10 µL von sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und dann ausräumen. Wiederholen Sie diese 2-3 X.
  4. Operation bereiten Sie Schwangere 2 bis 6 Monate alten weibliche Mäusen durch das rasieren ihre Bäuche mit einer Haarschneidemaschine vor. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Brustwarzen zu beschädigen. Verwalten Sie orale Schmerzmittel (z.B. 100 µL 1,5 mg/mL Suspension zum Meloxicam per Mausklick).
  5. Starten Sie die Nadel mit dem gewünschten Material (Zellen/Vektor/Medikament) in der gewünschten Lautstärke zu füllen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Nadelspitze zu brechen, beim Ausfüllen der Nadelöhrs.
    Hinweis: Das Volumen der Injektion pro Fötus variiert je nach der spezifischen experimentellen Design. 20 µL eignet sich gut für Injektion eine große Anzahl von Zellen (d. h.bis zu 107 Zellen in die dotterhäutchen Vene. Wir liefern zum Beispiel 1 x 107 ganze Knochenmarkzellen isoliert von C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 grün fluoreszierenden Proteins (GFP)"] Mäuse über die dotterhäutchen Vene in Schwangerschafts Tag-14 Balb/c Föten. Eine einmalige Injektion von 10 µL einer 1:1 verdünnt Vektors mit PBS viralen Vektoren Injektionen funktioniert gut.
  6. Um die Einspritzzeit zu kalibrieren, die folgenden Schritte.
    1. Drücken Sie die Mode Taste 3 X auf der Microinjector kommt man zu der Injektion Kalibrierungsbildschirm. Passen Sie die einspritzdauer durch Zugabe von Abständen von 10 oder 100 ms und drücken Sie die Modus -Taste 2 X.
    2. Drücken Sie die Schaltfläche " Balance " und drücken Sie den Fußschalter einmal. Nun drücken Sie das Pedal wieder und beurteilen Sie, wie viel Volumen aus der Nadel pro Stoß entleert wird. Wenn die gewünschte Lautstärke von 5-20 µL pro Pedal Push nicht kalibriert ist, wiederholen Sie die Schritte 2.6.1 und 2.6.2.
      Hinweis: In der Regel empfiehlt es sich, jede Push-to-die Hälfte die gesamten Ziel Lautstärke zu einem Zeitpunkt liefern zu kalibrieren. Es ist, zwar möglich, mehr als 30 µL oder sogar 40 µL des Gesamtvolumens zu injizieren gehen wir in der Regel nicht über 20 µL pro Fötus, intravenöse oder Intra-Fruchtwasser.
  7. Füllen Sie die Nadel bis zur gewünschten Höhe.
  8. Starten Sie liefern Anästhesie an der Maus durch Anpassung der Sauerstoff-Durchflussmesser auf 1 L/min und der Verdampfer Isoflurane auf 3 %.
  9. Bestätigen Sie, ob die Maus betäubt wird, indem auf das Fehlen der Reflex-Pedal. Übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen in Rückenlage.
  10. Tragen Sie Schmiermittel Augengel um Hornhaut Austrocknung zu vermeiden. Die Maus im Ort durch Abkleben der oberen und unteren Gliedmaßen, das Pad zu sichern.
  11. Vorbereitung der Bauch mit Chlorhexidin Peeling gefolgt von Alkohol und ein Lokalanästhetikum (z.B. 100 µL 0.25 % Bupivacain) subkutan zu injizieren(Abbildung 3).
  12. Machen Sie mit Schere einen 1-2 cm Hautschnitt, so dass die Untergrenze nicht näher als 1 cm an den Introitus ist; die Faszie unter ist sehr dünn und lichtdurchlässig.
  13. Die Mittellinie der Faszie ist transparenter als das umliegende Gebiet zu identifizieren. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die epigastrischen Gefäße zu verletzen, die auf beiden Seiten der Mittellinie liegen. Sollte die epigastrischen Gefäße verletzt, Nachdruck mit Wattestäbchen Applikatoren, die Blutung zu stoppen.
  14. Mit Adson Pinzette, Kneifen Sie die Faszie ohne greifen eines zugrunde liegenden Organe wie Darm, Blase oder Föten. Öffnen Sie die Faszie mit Schere, ohne dabei Schäden der Organe. Einmal sicher in den Bauch den Faszien Schnitt verlängern. Machen Sie es nicht mehr als den Hautschnitt.
  15. Verwenden Sie Wattetupfer Applikatoren um den Darm in den oberen Teil des Bauches, damit aussetzen der trächtigen Gebärmutter bewegen. Liefern Sie die Gebärmutter aus der Schnitt sorgfältig identifizieren die rechten und linken Eierstöcke um sicherzustellen, dass alle Föten (Abbildung 3B) gezählt werden.
  16. Legen Sie den linken Uterus zurück in die Bauchhöhle, so dass nur die richtigen Gebärmutter ausgesetzt ist; Dies verhindert die Austrocknung der Gebärmutter und wärmt die Föten nicht injiziert.
  17. Halten Sie die meisten seitliche Fötus/Fruchtblase zwischen Daumen und Zeigefinger der nichtdominanten Hand des Bedieners (Abb. 3C). Seien Sie immer sanft, keinen Schaden auf die Föten.
  18. Positionieren Sie die Dissektion Mikroskop (ideal ist eine 10-fache Vergrößerung) und stellen Sie den Fokus, so dass der Fötus in Sicht ist. Passen Sie die Beleuchtung für eine bessere Visualisierung.
  19. Das Teil, der injiziert wird zu identifizieren (dotterhäutchen Ader, Amnion). Visualisieren Sie für intravenöse Injektionen die dotterhäutchen Venen und ihre Anastomose zunächst. Richten Sie für Intra-Fruchtwasser-Injektionen den Fötus mit der rechten Seite im Blick.
  20. Erreichen des Ziel-Raumes mit der Nadel wie unten beschrieben.
    1. Gehen Sie eine intravenöse Injektionwie folgt vor.
      1. Drehen Sie die Gebärmutter, so dass die dotterhäutchen Ader, die eingespritzt wird parallel zu der Spitze der Nadel ist; Denken Sie daran, die die Injektionen gegen die Anastomose der zwei Venen vorgenommen werden müssen.
      2. Legen Sie die Nadel auf die Gebärmutter in einem Winkel von 5° und durchstoßen Sie die Gebärmutterwand. Nun, da die Spitze zwischen die Gebärmutterwand und die Fruchtblase ist, setzen Sie die Spitze direkt auf die dotterhäutchen Vene.
      3. Gleiten Sie in einem Winkel von fast tangential die Nadel über die Vene, bis die Abschrägung durchbohrt und in den Behälter rückt; Dies ist offensichtlich von einem Blitz des Blutes in der Spitze der Nadel (Abbildung 3D) gesehen.
        Hinweis: Den Zugriff auf die Vene kann ein paar Versuche dauern, da die Nadel nicht die Vene mit der ersten gleiten über die Vene durchstechen kann.
    2. Gehen Sie für eine Intra-Fruchtwasser Injektionwie folgt vor.
      1. Drehen Sie die Fruchtblase und suchen nach einem Ort frei von Schiffen zu durchbohren.
      2. Zeigen Sie die Nadel senkrecht zu der Gebärmutterwand und durchbohren Sie der Gebärmutter, der Dottersack und dann die Fruchtblase. Achten Sie darauf, dass Sie keine fötalen Gewebe durchdringen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel zwischen den Schenkeln bestanden hat, wie dies bestätigt, dass die Nadel in die Fruchtblase. Fahren Sie dann mit der Injektion.
  21. Injizieren Sie das entsprechende Volumen des Materials gewünscht (in der Regel 10-20 µL) durch Betätigen des Fußpedals.
    Hinweis: Da der Injektor die Visualisierung der Nadelspitze durch beibehalten muss muss das Mikroskop bei aller Zeiten, eine zweite Person lesen Sie die Markierungen auf der Nadel zu quantifizieren die eingespritzte Menge und den Injektor zu informieren, wie viel Volumen noch um zu injizieren. Eine Diskussion vor der Injektion zwischen Injektor und Assistenten ist wichtig, Verwirrung und Verzögerung zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig für intravenöse Injektionen, da eine verspätete Entfernung der Nadel einen Rückfluss des venösen Blutes in die Nadel und das Ergebnis in eine ungenaue Dosierung ermöglichen wird.
  22. Zurückzuziehen Sie die Nadel aus der Injektionsstelle, sobald die gewünschte Lautstärke geliefert wird. Da möglicherweise einige Blutungen aus das Schiff Punktion mit intravenöse Injektionen, Nachdruck mit der Seite der Nadel für 10-15 s, um die Blutung zu stoppen.
  23. Fahren Sie mit der nächsten Fötus. Fortgesetzt, bis alle Föten des Rechts uterine Horns injiziert wurde.
  24. Entfernen Sie die linken Uterus Horn aus dem Bauch und ersetzen Sie das Recht uterine Horn wieder in die Bauchhöhle.
    Hinweis: Gelegentlich, die Nadel mit dem eindüsungsluft nachgefüllt werden muss.
  25. Sobald alle Feten injiziert wurde, ersetzen Sie die Gebärmutter in die Bauchhöhle (Abbildung 3E). Achten Sie darauf, eine Gebärmutter oder Darm Volvulus zu vermeiden.
  26. Legen Sie mit einer Einweg-transferpipette etwa 2 mL 1 X PBS in die Bauchhöhle, unempfänglich Verluste zu ersetzen.
  27. Schließen Sie Faszien und Bauch in einer kontinuierlichen Schicht nicht zu verletzen, die zugrunde liegenden Organe während der Schließung (Abbildung 3F - 3 G) mit 4: 0 Polyglactin 910 Nähte.
  28. Entfernen Sie das Klebeband und übertragen Sie die Maus zu einem Käfig unter einer Wärmelampe. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Wärmelampe zu nah an der Maus platzieren. Stellen Sie sicher, dass der Käfig Einstreu, Nahrung und Wasser hat.
    Hinweis: Eine thermostatisch gesteuerte warme Kammer kann auch verwendet werden. Die Maus ist wach, wenn es aufrecht und zu Fuß ist.
  29. Die Maus täglich beobachten und nach Bedarf Schmerzmittel zu geben.
    Hinweis: Wir geben routinemäßig Meloxicam an postoperativen Tagen 1 und 2, und manchmal am Tag 3 die Maus zeigt Anzeichen von Schmerzen.
  30. Wenn eine Batch-Operation mit dem gleichen Injektionsmaterial, reinigen Sie die Injektionsnadel mit sterilen PBS. Wenn mit einem anderen Material einspritzen, entsorgen Sie die Nadel in eine Scharfbehälter und verwenden Sie eine neue Nadel.
    Hinweis: Wir empfehlen die Welpen mit Surrogat Dämme unmittelbar nach der Geburt zu fördern, für den Fall, dass der Damm eine Immunantwort gegen die eindüsungsluft und Transfers Antikörper die Welpen über die Muttermilch Reittiere.

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Ergebnisse

Überleben und Engraftment sind wichtige Maßnahmen für den Erfolg IUHCT Experimente. Je nach der bestimmten Endgeräten eines Experiments können Föten, die eine IUHCT erhalten durch einen Kaiserschnitt oder postnatal pränatal analysiert werden. Im Durchschnitt reichen die Überlebensraten nach intravenöse Injektionen von 75-100 %. Die Überlebensraten nach Intra-Fruchtwasser-Injektionen sind in der Regel besser als intravenöse Injektionen bei etwa 85-100 % fair.

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Diskussion

In der Gebärmutter Transplantation ist eine mögliche Therapie für viele angeborene Erkrankungen, die früh in der Schwangerschaft diagnostiziert werden können. Mausmodell für IUT erlaubt Forschern, die fetale Umgebung zu erkunden oder zum Experimentieren mit verschiedenen Therapien. Je nachdem was eingespritzt wird und was richtet kann intravenöse oder Intra-Fruchtwasser in der Gebärmutter Transplantation eine zuverlässige Lieferung von einer eindüsungsluft in den gewünschten Raum bieten.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HandschuheCardinal Health2D73DP65
Adson Pinzette mitZähnen Fine Science Tools11027-12
Adson Pinzette ohne ZähneFine Science Tools11006-12
Gebogene SchereFine Science Tools14075-11
Schwere SchereFine Science Tools14002-13
NadeltreiberFine Science Tools12005-15
Vicryl 2.0EthiconJB945
TransferpipetteMedlineGSI135010
Applikatoren mit WattespitzeMedlineMDS202000
50 mL Konisches RöhrchenFischer Scientific14-432-22
Tape3M1527-1
Gleitmittel für die AugenMajor LubriFresh0904-6488
HeizkissenK& H3060
StereomikroskopLeicaMZ16
InjektorNarishigeHI01PK01
Glas KapillarröhrchenKimble71900-100
Vertikaler MikropipettenabzieherSutter InstrumentsP-30
Mikroelektrode AnfaserSutter InstrumentsBV-10
IM-300 Pneumatischer MikroinjektorNarishigeIM-300
Insulinspritze BD 
FilterGenesee Scientific25-244
Compac5 AnästhesiegerätVetEquip Compac5901812 
IsofluranPiramal IntensivmedizinNDC 66794-017-25
N2-GasAirgasNI 125
O2-GasAirgasOX 125
Ad-GFP viraler VektorPenn Vector CoreH5'.040.CMV.eGFP
305935

Referenzen

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