Method Article

Synthese, Charakterisierung und Anwendung von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanosonden zur Erkennung von extrapulmonaler Tuberkulose

DOI:

10.3791/58227

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February 16th, 2020

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, 2Department of Research and Department of Dentistry, Taipei Medical University / Shuang-Ho Hospital, 3Department of Pathology, Taipei Medical University, 4Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 5McLean Imaging Center, McLean Hospital/Harvard Medical School, 6Department of Physical Medicine and Rehabilitation, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Department of Medicine, Mackay Medical College, 8Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, 9Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

In This Article

Summary

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Um serologische diagnostische Tests für Mycobacterium tuberculosis Antigene zu verbessern, haben wir superparamagnetische Eisenoxid-Nanosonden entwickelt, um extrapulmonale Tuberkulose zu erkennen.

Abstract

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Eine molekulare bildgebende Sonde mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (SPIO) und Mycobacterium tuberculosis-Oberflächenantikörper (MtbsAb) wurde synthetisiert, um die bildgebende Empfindlichkeit für extrapulmonale Tuberkulose (ETB) zu verbessern. Eine SPIO-Nanosonde wurde synthetisiert und mit MtbsAb konjugiert. Die gereinigte SPIO-MtbsAb Nanosonde wurde mit TEM und NMR charakterisiert. Um die Targeting-Fähigkeit der Sonde zu bestimmen, wurden SPIO-MtbsAb-Nanosonden mit Mtb für In-vitro-Bildgebungstests inkubiert und in Mtb-inokierte Mäuse zur In-vivo-Untersuchung mit Magnetresonanz (MR) injiziert. Die Kontrastverstärkungsreduktion bei der Magnetresonanztomographie (MRT) von Mtb- und THP1-Zellen zeigte proportional zur SPIO-MtbsAb-Nanosondenkonzentration. Nach 30 min intravenöser SPIO-MtbsAb-Nanosondeninjektion in Mtb-infizierte Mäuse wurde die Signalintensität der granulomatösen Stelle in den T2-gewichteten MR-Bildern um das 14-fache erhöht, verglichen mit der von Mäusen, die eine PBS-Injektion erhielten. Die MtbsAb-Nanosonden können als neuartige Modalität für die ETB-Erkennung verwendet werden.

Introduction

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Weltweit stellt die extrapulmonale Tuberkulose (ETB) einen erheblichen Anteil der Tuberkulose-Fälle (TB) dar. Dennoch wird die ETB-Diagnose aufgrund ihrer heimtückischen klinischen Darstellung und der schlechten Leistung bei diagnostischen Tests oft übersehen oder verzögert; Falsche Ergebnisse sind Sputumabstriche negativ für säureschnelle Bacilli, Mangel an granulomatösem Gewebe auf Histopathologie, oder Versagen der Kultur Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Im Vergleich zu typischen Fällen tritt ETB seltener auf und beinhaltet wenig Befreiung der Mtb-Bazillen. Darüber hinaus ist es in der Regel an schwer zugänglichen Stellen lokalisiert, wie Lymphknoten, Pleura, und osteoarticularBereiche1. Daher sind invasive Verfahren zur Gewinnung geeigneter klinischer Proben, die eine bakteriologische Bestätigung riskant und schwierig machen, wesentlich2,3,4.

Kommerziell erhältliche Antikörpernachweistests für ETB sind aufgrund ihrer großen Empfindlichkeitsspanne (0,00-1,00) und Spezifität (0,59-1,00) für alle außerpulmonalen Standorte zusammen5für den klinischen Nachweis unzuverlässig. Enzymgebundene Immunospot-Assays (ELISPOT) für Interferon-, Kulturfiltratprotein (CFP) und frühes sekretorees antigenes Ziel (ESAT) wurden zur Diagnose latenter und aktiver TB verwendet. Die Ergebnisse variieren jedoch zwischen den verschiedenen Krankheitsstellen für die Diagnose von ETB6,7,8. Darüber hinaus lieferten Haut-PPD (gereinigtes Proteinderivat) und QuantiFERON-TB häufig falsch negative Ergebnisse9. QuantiFERON-TB-2G ist ein Vollblut-Immunreaktivitätstest, der keine Probe aus dem betroffenen Organ erfordert und dies kann ein alternatives diagnostisches Werkzeugsein 6,10,11. Andere diagnostische Methoden, die typischerweise für TB-Meningitis verwendet werden, wie polymerase Kettenreaktion, sind immer noch zu unempfindlich, um die klinische Diagnose12,13sicher auszuschließen. Diese konventionellen Tests zeigen unzureichende diagnostische Informationen, um die extrapulmonale Infektionsstelle zu entdecken. Daher sind neue diagnostische Modalitäten klinisch erforderlich.

Die molekulare Bildgebung zielt darauf ab, neuartige Werkzeuge zu entwickeln, die spezifische molekulare Ziele von Krankheitsprozessen in vivo14,15direkt abschirmen können. Superparamagnetisches Eisenoxid (SPIO), ein T2-gewichtetes NMR-Kontrastmittel, kann die Spezifität und Empfindlichkeit der Magnetresonanzbildgebung (MRT)16,17deutlich verbessern. Diese neue funktionelle bildgebende Modalität kann Gewebeveränderungen auf molekularer Ebene durch Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen präzise skizzieren. In dieser Studie wurde eine neue molekulare Bildsonde, bestehend aus SPIO-Nanopartikeln, synthetisiert, um mit Mtb-Oberflächenantikörpern (MtbsAb) für die ETB-Diagnose zu konjugieren. SPIO-Nanosonden sind minimal invasiv für Gewebe und Körper, die untersucht werden18,19. Darüber hinaus können diese Nanosonden aufgrund ihrer paramagnetischen Eigenschaften präzise MR-Bilder bei geringen Konzentrationen nachweisen. Darüber hinaus scheinen SPIO-Nanosonden am wenigsten allergische Reaktionen auszulösen, da das Vorhandensein von Eisenionen Teil der normalen Physiologie ist. Hier bei Zell- und Tiermodellen wurden die Empfindlichkeit und Spezifität der SPIO-MtbsAb-Nanosonden auf ETB untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nanosonden als ultraempfindliche Bildgebungsmittel für die ETB-Diagnose anwendbar waren.

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Protocol

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Alle Protokolle über Tierversuche entsprechen den Standardverfahren für die Labortierzucht gemäß den National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage, 2011) und sind von der institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss.

1. SPIO Nanopartikelsynthese

  1. Bereiten Sie dextranbeschichtete Eisenoxid-Magnet-Nanopartikel vor, indem Sie eine Mischung aus Dextran T-40 (5 ml; 50% w/w) und wässrigen FeCl 3-6H2 O(0,45 g; 2,77 mmol) und FeCl2x 4H2 O(0,32 g; 2,52 mmol) Bei Raumtemperatur kräftig rühren.
  2. NH4OH (10 ml; 7,5% v/v) schnell hinzufügen.
  3. Rühren Sie die schwarze Aufhängung für 1 h weiter; anschließend zentrifugieren Sie 10 min bei 17.300 x g und entfernen Sie dann die Aggregate.
  4. Trennen Sie die endgültigen SPIO-Produkte von ungebundenem Dextran T-40 durch Gelfiltrationschromatographie20.
  5. Das Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen = 5 ml) in eine 2,5 cm x 33 cm große Säule und mit einer Pufferlösung mit 0,1 M Naacetat und 0,15 M NaCl bei pH 7,0 zu belasten.
  6. Sammeln Sie die gereinigten dextranbeschichteten Eisenoxid-Magnet-Nanopartikel im Hohlraumvolumen und untersuchen Sie die Säuleneluate für Eisen und Dextran bei 330 bzw. 490 nm mit Salzsäure und den Phenol/Schwefelsäure-Methoden20.

2. SPIO-MtbsAb-Synthese

  1. Synthesize SPIO-konjugierte EDBE mit zuvor gemeldeten Methoden21,22.
  2. Synthesize SPIO-EDBE-succinic anhydrid (SA).
    1. Eine alkalische Lösung (5 M NaOH; 10 ml)) von SPIO-EDBE und SA (1 g; 10 mol) bei Raumtemperatur für 24 h rühren.
    2. Dialysieren Sie die Lösung mit 20 Veränderungen von 2 L destilliertem Wasser mit molekularporösen Membranschläuchen (12.000-14.000 MW Cutoff). 6 h für jede Änderung.
  3. Schließlich möchte ich, SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml Fe) zu 400 l 4,5 mg/ml MtbsAb hinzufügen, um SPIO-MtbsAb unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol und (Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphat als Katalysator zu synthetisieren und die Lösung bei Raumtemperatur für 24 h zu rühren.
  4. Trennen Sie schließlich die Lösungen vom ungebundenen Antikörper durch Gelfiltrationschromatographie.
  5. Das Reaktionsgemisch (5 ml) auf eine Säule von 2,5 cm x 33 cm laden und mit einem PBS-Puffer löschen. Bestätigen Sie den Ab-Nanopartikel-Komplex (d. h. Nanoprobe) mit einem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit23.

3. Partikelmorphologie Beobachtung und Entspannungstiermessung

  1. Untersuchen Sie die durchschnittliche Partikelgröße, Morphologie und Größenverteilung mithilfe des Transmissionselektronenmikroskops bei einer Spannung von 100 kV.
    1. Die Zusammengesetzte Dispersion auf ein 200-Maschen-Kupfergitter werfen und bei Raumtemperatur lufttrocken machen, bevor sie auf das Mikroskop geladen wird.
  2. Messen Sie die Entspannungszeitwerte (T1 und T2) der Nanosonden mit dem NMR Relaxometer bei 20 MHz und 37,0 °C bei 0,1 °C.
    1. Kalibrieren Sie das Relaxometer vor jeder Messung.
    2. Zeichnen Sie die r1- undr2-Werte aus den acht Datenpunkten auf, die durch Inversions-Recovery erzeugt werden, und der Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulssequenz, um r1 und r2 Relaxivitäten20zu bestimmen.

4. Zellbildgebung

  1. Kultivieren Sie menschliche Monozyten THP-1 in RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum, 50 g/ml Gentamycinsulfat, 100 Einheiten/ml Penicillin G-Natrium, 100 g Streptomycinsulfat und 0,25 g/ml-Pilzzone in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C.
  2. Inkubieren SPIO-MtbsAb-Nanosonden (2 mM) mit 106 koloniebildenden Einheiten (CFU) von Mycobacterium bovis BCG vorbrütet mit 1 x 107 aktivierten Monozyten in Mikrozentrifugenröhren (1 mL) in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C für 1 h.
  3. Zentrifugenrohre bei 200 x g und entsorgen den Überstand. Pellets im Medium (200 l) wieder auflösen.
  4. Scannen Sie die Proben mit einer schnellen Gradienten-Echopulssequenz (Wiederholungszeit (TR) = 500; Echozeit(TE) = 20; Drehwinkel = 10°) durch 3,0-T MRT zur Bestimmung der Spezifität und Empfindlichkeit der Nanosonde21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) Impfung

  1. Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Impfstoff oder bakteriellen Vorrat in Sautons Medium und verdünnen Sie den Bestand dann mit Salin, bis er ordnungsgemäß dispergiert ist, wie zuvor beschrieben24.
  2. Impfen Sie einen lebenden abgeschwächten Stamm von M. bovis BCG, der aus ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught-Stamm; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) mit einem Volumen von 0,1 ml/Maus (d.h. 107 KBE) intradermally in die linke oder rechte dorsale skapulierfarbene Haut von Mäusen, wie zuvorbeschrieben 23. Injizieren Sie Saline in Mäuse als negative Kontrolle. Überwachen Sie Tiere täglich nach BCG-Impfung.
  3. Opfern Sie Tiere 1 Monat nach der Inokulation von Bakterien mit Kohlendioxid-Euthanasie. Ernten Sie das Gewebe von der intradermalen Impfstelle. Fixieren Sie das Gewebe in 10% Formalin und betten Sie es in Paraffin für serielle Abschnitte bei 5-10 m ein. Fleckengewebeabschnitte mit den Hämatoxylin/Eosin- und Ziehl-Neelsen-Färbungen für säurebefaste Bakterien24 und mit Berlin blau fürEiseneisen 25.

6. In-vivo-MRT

  1. Injizieren Sie Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12 mg/kg Körpergewicht) subkutan in Mäuse zur Tieranästhesie.
  2. Injizieren Sie SPIO-TbsAb-Sonden (2 nmol/200 l) in Schwanzvenen von Mäusen. MR-Bildmäuse vor und unmittelbar nach der Sondeninjektion und dann alle 5 min für 30 min, um T2-gewichtete schnelle Spin-Echo-Bilder zu erfassen (TR = 3000; TE = 90; Sichtfeld = 8).
  3. Quantitative Analyse aller MR-Bilder mit Hilfe der Signalintensität (SI), einer Messung definierter Interessensgebiete an vergleichbaren Standorten eines Mtb-Granulomzentrums und des Rückenmuskels neben einem granulomatösen Bereich.
  4. Berechnen Sie relative Signalverstärkungen mit der SI-Messung vor (SIpre; Steuerung) und 0-3 h nach (SIpost) Injektion der Kontrastmittel mit der Formel

    [(SIpost - SIpre)/SIpre]

    wobei SIpre die SI der Läsion auf dem vorverstärkten Scan und SIpost ist die SI der Läsion auf dem post-verbesserten Scan21,22.

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Results

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SPIO-MtbsAb Nanosondensynthese und Charakterisierung
SPIO-Nanopartikel wurden entwickelt, um mit MtbsAb zu konjugieren. Der auf der Oberfläche von SPIO-Nanopartikeln stabilisierte Dextran wurde durch Epichlorhydrin vernetzt. SPIO-Nanopartikel wurden anschließend mit EDBE aufgenommen, um primäre Aminfunktionsgruppen an den Dextranenden zu aktivieren. SA wurde dann zur SPIO-EDBE-SA konjugiert. SPIO-MtbsAb Nanosonden entstanden im letzten Schritt durch die Konjugation von MtbsAb mit SPIO-EDBE-SA in Gegen...

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Discussion

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Ähnlich wie in einschlägigen Studien zeigten unsere Ergebnisse zu SPIO-MtbsAb-Nanosonden eine signifikante Spezifität für Mtb27,28. Das subkutane Mtb-Granulom wurde 1 Monat nach der TB-Injektion in den Mausmodellen gefunden. Die typischen Ergebnisse der physikalischen Histologie des TB umfassten Lymphozyteninfiltration, Das Vorhandensein epithelioider Makrophagen und Neovaskularisation. Säureschnelle Bacilli wurden in den TB-Läsionen verstreut, was die MtbsAb-Imm...

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Disclosures

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Keiner der Autoren hat ein proprietäres Interesse an den in dieser Studie untersuchten Materialien.

Acknowledgements

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Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch das Ministerium für Wirtschaft Taiwan (Zuschüsse NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-007, MOST 105-2622-B-038-004) für diese Forschungsarbeit durchzuführen. Dieses Manuskript wurde von Wallace Academic Editing herausgegeben.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(Benzotriazol-1-yloxy) TripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphatSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazolSigma-Aldrich
Dextran (T-40)GE Healthcare Biosciences AB
Epichlorhydrin, 2,2'-(ethylendioxy)bis(ethylamin)Sigma-Aldrich
EisenchloridhexahydratFluka
Eisenchlorid-Tetrahydrat,Fluka
Humanmonozytär THP-1
M. bovis BCGPasteur Mé rieuxConnaught Stamm; ImmuCyst Aventis
MRTGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR-RelaxometerBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molekulare poröse Membranschläuche, 12.000 -14.000 MW abgeschnittenSpectrum Laboratories Inc
TB Oberflächenantikörper - Polyklonaler Antikörper gegen MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
TransmissionselektronenmikroskopJEOLJEM-2000 EX II

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