Summary
Her præsenterer vi en protokol til at fabrikere en nyre cortex ekstracellulære matrix-afledte hydrogel for at bevare den indfødte nyre ekstracellulære matrix (ECM) strukturelle og biokemiske sammensætning. Fabrikationsproces og dens anvendelser er beskrevet. Endelig, et perspektiv på ved hjælp af denne hydrogel til støtte for nyre-specifikke cellulære og væv revitalisering og bioteknologi er diskuteret.
Abstract
Ekstracellulær matrix (ECM) giver vigtige biofysiske og biokemiske stikord for at opretholde væv homeostase. Nuværende syntetiske hydrogels tilbyder robuste mekanisk støtte for in vitro- celle kultur men mangler den nødvendige protein og ligand sammensætning for at fremkalde fysiologiske adfærd fra celler. Dette manuskript beskriver en fabrikation metode for en nyre cortex ECM-afledte hydrogel med ordentlig mekanisk robusthed og støttende biokemiske sammensætning. Hydrogel er fremstillet ved mekanisk homogenisering og solubilizing decellularized menneskeligt nyre cortex ECM. Matrixen bevarer indfødte nyre cortex ECM protein nøgletal samtidig også giver mulighed for gellation til fysiologiske mekaniske stiffnesses. Hydrogel fungerer som et substrat, ved hvilke nyre cortex-afledte celler kan opretholdes under fysiologiske forhold. Derudover kan hydrogel sammensætning manipuleres til at modellere en syge miljø, som gør det muligt for den kommende undersøgelse af nyresygdomme.
Introduction
Ekstracellulær matrix (ECM) giver vigtige biofysiske og biokemiske stikord for at opretholde væv homeostase. Den komplekse molekylære sammensætning regulerer både strukturelle og funktionelle egenskaber af væv. Strukturelle proteiner give celler med rumlige bevidsthed og mulighed for vedhæftning og migration1. Bundne ligander interagere med celle overfladen receptorer til at styre celle opførsel2. Nyre ECM indeholder et væld af molekyler, hvis sammensætning og struktur varierer alt efter anatomiske placering, udviklingsstadiet og sygdom tilstand3,4. Recapitulating kompleksiteten af ECM er et centralt aspekt i at studere nyre-afledte celler in vitro.
Tidligere forsøg på replikerende ECM microenvironments har fokuseret på decellularizing hele væv til at oprette stilladser i stand til at recellularization. Decellularization er udført med kemiske rengøringsmidler som sodium dodecyl sulfat (SDS) eller nonioniske detergenter, og det udnytter enten hele orgel perfusion eller fordybelse og agitation metoder5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Stilladser præsenteres her bevare de strukturelle og biokemiske stikord fundet i native væv ECM; Endvidere recellularization med donor-specifikke celler har klinisk relevans i rekonstruktionskirurgi14,15,16,17,18, 19. men disse stilladser mangler strukturel fleksibilitet og er derfor uforenelig med mange nuværende udstyr til in vitro- undersøgelser. For at overvinde denne begrænsning, har mange grupper videreforarbejdet decellularized ECM til hydrogels20,21,22,23,24. Disse hydrogels er kompatible med sprøjtestøbning og bioink og omgå mikrometer skala rumlige begrænsninger, der decellularized stilladser sted på celler. Derudover er molekylære sammensætning og nøgletal fundet i native ECM bevaret3,25. Her viser vi en metode til at fabrikere en hydrogel afledt af nyre cortex ECM (kECM).
Formålet med denne protokol er at producere en hydrogel, der replikerer mikromiljø i regionen nyre kortikale. Nyrevæv cortex er decellularized i en 1% SDS løsning under konstant omrøring til at fjerne cellulært materiale. SDS er almindeligt anvendt til at decellularize væv på grund af dens evne til hurtigt at fjerne immunologiske cellulære materiale6,7,9,26. KECM er derefter mekanisk homogenisering og ingot5,6,9,11,26. Oploesning i en stærk syre med pepsin resulterer i en endelig hydrogel stamopløsning20,27. Native kECM proteiner, der er vigtige for strukturel støtte og signal transduktion er bevaret3,25. Hydrogel kan også være geléagtig til inden for en størrelsesorden af indfødte menneskelige nyre cortex28,29,30. Denne matrix giver en fysiologisk miljø, der er blevet brugt til at opretholde ubevægelighed af nyre-specifikke celler i forhold til hydrogels fra andre matrix proteiner. Derudover matrix sammensætning kan manipuleres, eksempelvis gennem tilsætning af kollagen-I, at model sygdom miljøer for studiet af renal fibrose og andre nyre sygdomme31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige nyrerne blev isoleret ved LifeCenter nordvest efter etiske retningslinjer fastsat af foreningen af orgel indkøb organisationer. Denne protokol følger dyrs pleje og celle kultur retningslinjerne skitseret ved University of Washington.
1. forberedelse af menneskelige nyrevæv
- Forberedelse af decellularization løsning
- Sterilisere et 5000 mL baegerglas og 70 x 10 mm rør bar.
- Mix 1:1000 (vægt: volumen) sodium dodecyl sulfat (SDS) i autoklaveres deioniseret vand i bægerglasset. Forlade løsningen på en røre plade på ca 200 rpm i 24 timer eller indtil SDS er helt opløst.
Bemærk: Typisk, 2500 mL 1% SDS løsning er tilstrækkelig til at decellularize en enkelt menneskelige nyrerne. - Opløsningen overføres til en 500 mL sterilt vakuum filter og filtreres det i steriliseret forsegles containere.
- Behandling af nyrevæv
- Vask og autoklave et par pincet, to hemostat klemmer, et par generelle service grade saks, to skalpel kniv håndtag, en 1000 mL bægerglas dækket med aluminiumsfolie og 36 x 9 mm rør bar.
- Line en vævskultur hætte med underpad. Anbring bægerglasset, en steril vævskultur parabol (150 x 25 mm) og hele nyren orgel i hætten. Fyld bægerglasset med 500 mL af 1% SDS løsning.
Bemærk: Menneskelige nyrerne blev modtaget på is fra LifeCenter nordvest. - Placer nyren i sterile vævskultur parabol (figur 1A). Fjerne alle perirenal fedt ved let barbering omkring den renale kapsel med en skalpel (figur 1B).
- Gøre et lavvandet 8-10 cm snit med skalpel, bare dybt nok til at bryde åbne den renale kapsel uden at skade den underliggende cortex væv, på tværs af den overlegne ende af nyrerne. Fjerne den renale kapsel ved at skrælle det fra cortex væv med to hemostat klemmer (figur 1 c).
- Gennemskære nyre langs den koronale fly ved hjælp af skalpel langs den laterale side af nyre (fig. 1 d). Isolere cortex væv fra begge halvdele af udelader den medullære region med skalpel (figur 1E) og terninger cortex væv i 0,5 cm3 stykker (figur 1F). Fjern alle store synlige fartøjer.
- Isolering af ekstracellulære matrix
- En vævskultur hætte, Udfyld et 1000 mL bægerglas med 500 mL af 1% SDS løsning. Placer den hakkede cortex væv og rør bar i bægerglasset med SDS løsning. Bægerglasset dækkes med autoklaveres aluminiumsfolie og placere den på et rør plade på ca 400 rpm uden for vævskultur hætte.
- Efter cortex væv har været på røre pladen for 24 h, bringe bægerglasset i vævskultur hætte og tilføje en 40 µm sterile celle si lavet med nylon mesh. Udfylde en separat 1000 mL bægerglas med 200 mL af blegemiddel og placere den i vævskultur hætte.
- Afpipetteres ud SDS løsning gennem celle si i bægerglasset der indeholder blegemiddel. Der afpipetteres ud alle SDS løsning indtil kun decellularized væv og celler si forbliver i bægerglasset.
Bemærk: Celle si bør forhindre enhver væv fra bliver fjernet under løsning aspiration. - Forlade cellen sien i bægerglasset og fyld med 500 mL frisk SDS løsning. Bægerglasset dækkes med den samme aluminiumsfolie og sted på en røre pladen med samme hastighed som før.
- Gentag trin 1.3.1-1.3.3 hver 24 timer med frisk SDS løsning for fem dage i alt.
- Skyl decellularized væv med autoklaveres DI vand hver 24 timer til 3 dage i alt, efter den teknik beskrevet i trin 1.3.1-1.3.3.
- Skyl decellularized væv med celle kultur grade vand hver 24 timer til 2 dage i alt, efter den teknik beskrevet i trin 1.3.1-1.3.3.
- Gentag trin 1.3.1-1.3.2. Overføre det decellularized væv (benævnt kECM fra dette punkt på) i en 30 mL selvstændigt koniske rør og fyld den med celle kultur grade vand, indtil alle væv er neddykket.
2. fabrikation af Hydrogel Stock løsning
- Mekanisk bearbejdning af decellularized væv
- I en vævskultur hætte, mekanisk homogeniseres kECM inden for den koniske rør med en væv homogeniseringsapparat for 2 min.
Bemærk: Homogeniseret kECM skal ligne en uigennemsigtig løsning med ingen synlige stykker af ECM. - Nedsænkes den koniske rør indeholdende kECM i flydende kvælstof, indtil kogende omkring røret ikke længere eksisterer. Gemme kECM på-4 ˚C natten over.
- I en vævskultur hætte, mekanisk homogeniseres kECM inden for den koniske rør med en væv homogeniseringsapparat for 2 min.
- Ingot frosne decellularized væv
- Lidt løsne den koniske rør fælles landbrugspolitik for at give mulighed for gasudveksling og placere røret i en ingot maskine. Lyophilize kECM i tre dage eller indtil det ligner et fint hvidt pulver. Butik på-4 ˚C.
- Kemisk fordøjelse og oploesning af gel
- Autoklave en 20 mL scintillation hætteglas og cap, 15,9 x 7,9 mm rør bar og et par fine-spids pincet.
- Vejer den frysetørrede kECM og beregne volumen af HCl og massen af pepsin skulle solubilize kECM til en 3% (30 mg/mL) løsning ved hjælp af følgende ligninger, hvor mpepsin er massen af pepsin, mvæv er massen af frysetørret væv og VHCl er mængden af 0,01 N HCl:
- I vævskultur hætte, tilføje svin gastrisk pepsin, 0,01 N HCl og røre bar til scintillation hætteglasset, og lad det sidde en røre plade på ca 500 rpm, indtil alle pepsin er opløst. Overføre den frysetørrede kECM til scintillation hætteglas og overlade løsningen på en røre plade på ca 500 rpm i tre dage.
3. Hydrogel gellation
- Nyre ECM hydrogel forberedelse
- Gel hydrogel ved at blande kECM hydrogel stamopløsningen med 1 N NaOH, 10 x Media tillæg (M199), og celle kultur medier. Holde alle løsninger på is.
Bemærk: Endelige gel koncentrationer af 7,5 mg/mL blev brugt til cellekultur. 1 mL af kECM gel var tilstrækkelig for celle kultur eksperimenter præsenteret. - Bestemme mængden af brugbar kECM gel produceret og mængden af stock kECM hydrogel behov ved hjælp af følgende ligning, hvor Vendelige er mængden af gel lavet, Vstock kECM er mængden af stock kECM hydrogel behov, Cstock kECM er koncentrationen af stock kECM hydrogel, og Cendelige er koncentrationen af den endelige gel:
- Bestemme mængden af neutraliserende reagenser behov ved hjælp af følgende ligninger, hvor VNaOH er volumenet af 1 N NaOH, V10 X er mængden af M199 10 X media supplere og V1 X er den volumen af celle kultur medier:
- I en vævskultur hætte, der afpipetteres neutraliserende reagenserne (NaOH, M199 og celle Kulturmedier) i en steril 30 mL selvstændigt koniske rør. Bland den neutraliserende reagens løsning med en microspatula.
- Bruge en steril 1 mL sprøjte til at overføre den passende mængde af stock kECM hydrogel til neutraliserende reagens løsningen. Brug en microspatula til at forsigtigt blandes løsningen, indtil en ensartet i farve hydrogel løsning opnås.
Bemærk: Undgå at indføre luftbobler ved omrøring langsomt og forsigtigt. - For at indarbejde kECM hydrogel celler, skal du trække 10 µL af celle kultur medier (V1 X) fra de neutraliserende løsning volumen beregninger i trin 3.1.1.3.
- Suspendere celler i 10 µL af celle kultur medier. Bestemme antallet af celler, der suspenderes ved hjælp af følgende ligning, hvor #celler angiver antallet af celler til at suspendere og Vendelige er mængden af gel lavet:
Bemærk: 300.000 celler/mL er koncentrationen af celler, der bruges i kECM gel. - Der afpipetteres den 10 µL af celle suspenderet løsning i den endelige kECM gel efter kECM stamopløsningen er blevet blandet med neutralisere reagens løsning. Rør løsningen med en microspatula, indtil cellerne er jævnt fordelt.
- Suspendere celler i 10 µL af celle kultur medier. Bestemme antallet af celler, der suspenderes ved hjælp af følgende ligning, hvor #celler angiver antallet af celler til at suspendere og Vendelige er mængden af gel lavet:
- Gel hydrogel ved at blande kECM hydrogel stamopløsningen med 1 N NaOH, 10 x Media tillæg (M199), og celle kultur medier. Holde alle løsninger på is.
- Bruge en 1 mL sprøjte til at fylde en ønskede celle kultur enhed med kECM hydrogel.
- Tillad gel til at sætte på 37 ˚C til 1 time før overførsel eller plating celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KECM hydrogel giver en matrix for nyre cellekultur med samme kemiske sammensætning som de indfødte nyre mikromiljø. For at fremstille hydrogel, er cortex nyrevæv mekanisk isoleret fra en hel nyre orgel og hakkede (figur 1). Decellularization med en kemisk rengøringsmiddel (figur 2A.1-A.3) efterfulgt af skylninger med vand for at fjerne vaskemiddel partikler (figur 2A.4-A.6) udbytter isolerede nyre cortex ECM. Histologisk vurdering bekræfter typisk basal laminar proteiner såsom kollagen-IV og laminin og strukturelle proteiner såsom kollagen-jeg er bevaret, med vitronectin som den eneste bemærkes undtagelse (figur 2B). Endvidere er protein sammensætning, herunder bevarelse af isoformer, i ECM fortsat overensstemmelse med observerede værdier i native nyre ECM (figur 3). ECM (figur 4A) er mekanisk homogeniseret og frysetørrede (figur 4B) derefter solubilized til at producere den endelige kECM hydrogel (figur 4 c). KECM hydrogel syntes uigennemsigtig med små mængder af synlige væv og ikke var så tyktflydende som traditionelle kollagen-jeg hydrogel. Rheologiske målinger af geléagtig kECM i en koncentration på 15 mg/mL afslørede en kompleks modulus (dynamisk elasticitetsmodul) på omkring 800 Pa over det lineære område af stamme værdier, betydeligt større end 7,5 mg/mL kollagen-jeg (p = 1.602E-14). Menneskelige nyre peritubular mikrovaskulære endotelceller (HKMECs) kulturperler på kollagen-jeg, kECM og en 1:1 blanding gel viste forskelle i fænotype, specielt i CD31 udtryk omkring celle overflader og vejkryds (figur 5). HKMECs kulturperler på kollagen-jeg vises ensartet CD31 udtryk, mens HKMECs kulturperler på de to geler indeholdende kECM vises reduceret CD31 udtryk i ujævn distributioner. Matrix type syntes ikke at påvirke den høje PV1 og lav VWF udtryk i HKMECs.
Figur 1: isolering af cortex nyrevæv. Mekanisk bearbejdning af en hel nyre orgel at isolere cortex væv som base materiale til kECM hydrogel. Mekanisk isolation begynder med (A) fjernelse af fedtvæv perirenal. Store stykker af fedtvæv kan blive revet væk fra nyrerne med hemostat klemmer. Resterende stykker af fedtvæv kan fjernes ved at køre en skalpel mod den renale kapsel i en vinkel. (B) Den renale kapsel fjernes bedst ved at gøre en lavvandet indsnit langs den overlegne ende af nyre og (C) peeling renal kapslen fra det underliggende væv med hemostat klemmer. (D) bisecting nyre langs den koronale akse giver mulighed for visualisering af regionerne cortex og medulla. (E) isolation af cortex væv gøres bedst af udskærings ud stykker af medulla væv med en skalpel. Farven på den kortikale region er mærkbart mørkere end den medullære region og kan bruges differentiere de to anatomisk adskilte væv. Endelige behandling af cortex væv indebærer (F) terninger vævet i 0,5 cm3 stykker til støtte i efterfølgende decellularization. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Decellularization af cortex væv. Visuelle og histologiske karakterisering af decellularized væv. (A.1) Submerging hakkede cortex væv i 1% SDS løsning forårsager lysing af celler og fjernelse af cellulære materiale. Efter (A.2) 1 h og (A.3) 24 h, væv begynder at miste farve, der angiver cellulære sagen er at blive fjernet. Af (A.4) 120 h væv er blancheret og kun ECM forbliver. Skylninger med vand på (A.5) 24 h og (A.6) 120 h Vis ingen synlige ændringer til væv. B immunofluorescens farvning af ubehandlet og decellularized cortex væv afslører nær fuldstændig fjernelse af cellulære sagen og bevarelse af store strukturelle proteiner (kollagen-IV = Col-IV laminin = LAM, fibronektin = FN; heparin sulfat proteoglycaner = HSPG; og vitronectin = VN). Skala = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: massespektroskopi decellularized væv. Analyse af decellularized cortex væv ved massespektrometri til at bestemme ECM protein sammensætning. Alle nøgletal er målt som masse procent. (A) strukturfondene og andre proteiner, der er forbundet med basal lamina var til stede med kollagen-IV og -jeg er mest stærkt repræsenteret. (B.1) kollagen-IV A1 og A2 kæder, allestedsnærværende i alle kælderen membraner, blev bevaret. Kollagen-IV A3 og A5 kæder, findes kun i kælderen membraner af glomerulus, blev også fundet. (B.2) fælles isoformer af laminins og (B.3) kollagen-jeg blev også opdaget. Dette tal blev gengivet med tilladelse12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fabrikation af kECM hydrogel. Mekanisk og kemisk bearbejdning af decellularized cortex væv giver en brugbar kECM hydrogel med tilstrækkelig mekaniske egenskaber efter gellation med neutralisere reagenser. (A) decellularized cortex væv er mekanisk homogeniseret med et væv homogeniseringsapparat indtil ingen synlige stykker af ECM tilbage. (B) et groft pulver blev givet efter 3 dage under ingot. (C) oploesning i HCl og kemisk fordøjelse med pepsin i en scintillation hætteglas resulterede i en brugbar kECM hydrogel. Hydrogel var uigennemsigtig og en lav viskositet. D fysisk karakterisering af kECM hydrogel efter gellation med neutralisere reagenser. Rheologiske eksperimenter blev udført med en 30 mm diameter parallelle pladesystem. Prøven kanterne var beskyttet med mineralsk olie og lastning platform blev sat på 37 ˚C. KECM hydrogel fik lov at gel til 1 time før prøvningen. Viskoelastiske egenskaber af gelen blev målt med en stamme feje mellem 0,01 til 20%. Tre prøver af både kECM og kollagen-jeg blev testet (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: celle vækst karakterisering. Karakterisering af morfologiske forskelle i HKMECs dyrkes på forskellige matricer. Hydrogels blev blandet med neutralisere reagenser og indstillet på 37 ˚C til 45 min i Smørrebrød Polydimethylsiloxan forme. HKMECs var seedet på overfladen af gels og holdt i kultur i 72 timer før at være fast og farves. Immunfluorescent billeder af HKMECs kulturperler i (A og D) 7,5 mg/mL kollagen-jeg gel; (B og E) 7,5 mg/mL kECM gel; og (C og F) 7,5 mg/mL 1:1 blanding gel. (A-C): rød = CD31; grøn = VWF; blå = kerner; skalalinjen = 50 µm. (D-F): rød = F-actin; grøn = PV1; blå = kerner; skalalinjen = 50 µm. Dette tal blev gengivet med tilladelse12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matricer giver vigtige mekaniske og kemiske signaler, der styrer celle adfærd. Syntetiske hydrogels er i stand til at understøtte komplekse 3-dimensionelle mønstre men undlader at give de forskellige ekstracellulære stikord fundet i fysiologiske matrix microenvironments. Hydrogels stammer fra native ECM er ideelle materialer for både i vivo og in vitro- undersøgelser. Tidligere undersøgelser har brugt decellularized ECM hydrogels til pels syntetiske biomaterialer for at forhindre vært immunologiske reaktioner33,34, for at differentiere stamceller35,36,37 , 38, som substrat for 2D og bløde litografi celle kultur39,40,41,42, og forberedelse af bioinks til 3-dimensionelle udskrivning43, 44 , 45 , 46. ECM hydrogels give celler med ordentlig signalerer til indlede friktion og styre yderligere spredning og differentiering2,47.
Nøgletal og sammensætning af de vigtigste bestanddele af ECM, såsom collagens, laminins, elastin, fibronektin, og glycosaminoglycans, er stærkt afhængige af anatomiske placering og funktionalitet af væv48,49, 50. Det er godt etableret, at ved hjælp af uspecifik eller nonnative ECM-afledte hydrogels vil fremkalde forkert svar fra celler21,51,52,53,54. I nyrerne varierer ECM sammensætning meget mellem anatomiske steder1,2. Det er derfor vigtigt at skelne mellem regioner som cortex, medulla eller papilla før opdigte hydrogels for eksperimenterende brug.
Matrixen kECM fabrikeret her bevarer indfødte nyre cortex ECM protein nøgletal efter decellularization samtidig også giver mulighed for gellation til en fysiologisk relevante mekaniske stivhed3,25,28, 29,30. Serum albumin, en blodplasma protein, blev fundet i spormængder i decellularized cortex væv, muligvis på grund af binding til heparin, der undslap decellularization og skylning55,56. Selvom pepsin, en ikke-hjemmehørende kemiske til nyre cortex ECM, er til stede i opløsningen stock kECM, tegner det kun sig for 2,5% (w/v) af geléagtig slutproduktet. Derudover bliver pepsin deaktiveret med tilføjelse af de neutraliserende reagens løsning57.
KECM hydrogel fungerer som et substrat, som nyre cortex-specifikke celler kan opretholdes under fysiologiske forhold. Vi viste, at denne matrix kan støtte HKMEC vækst på et plant underlag. Disse HKMECs opretholdt en inaktiv fysiologiske tilstand som fastsat gennem funktionelle assays, fænotypiske udtryk og genetiske udtryk58. Derimod disse celler blev aktiveret når kollagen-jeg, en matrix komponent korreleret med nyre fibrose, blev føjet til kECM hydrogel på en 1:1 ratio59. Til sammenligning, når menneskers umbilical vene endotelceller var kulturperler på kollagen-jeg, de var inaktiv, og når det blandes med kECM blev de aktiveret12. Således kollagen-jeg er kendt for at være en integreret del af basalmembranen sammensætning i navlestrengen og er faldet under patologiske stater som preeclampsia38,60. Disse resultater understreger betydningen af celler med væv-specifikke stikord at opretholde ubevægelighed, og også hvordan manipulation af ECM milieu kan påvirke homøostase.
Alle trin i den skitserede fremgangsmåde er vigtige, er flere trin afgørende for at sikre levedygtigheden af de fabrikerede hydrogel. Graden af homogenisering af decellularized cortex væv vil variere baseret på teknik eller udstyr, der anvendes. Det er vigtigt at finde en teknik, der bedst vil homogenisere væv. Under oploesning, skal pH-værdien holdes på 3-4 for at sikre pepsinet er aktiv. Når du blander hydrogel med neutralisere reagenser, skal gel blandes grundigt og uden indførelse af luftbobler. Hvis en ensartet blanding er vanskelig at opnå, kontrollere pH af gelopløsning til at sikre, at det er neutralt.
Repræsentative resultaterne præsenteres i denne metode viser, hvordan en fysiologisk relevante matrix for in vitro- undersøgelse af nyreceller kan opnås. Decellularized nyre cortex ECM giver en ideel base materiale til at understøtte nyre-afledte cellevækst som ECM protein nøgletal er bevaret i den endelige hydrogel produkt3,25. Geléagtig produktet kan også opnå fysiologisk relevante mekaniske egenskaber28,29,30. KECM hydrogel giver mulighed for korrekt celle-matrix interaktioner og har vist sig at fremkalde større fysiologiske adfærd fra nyreceller end kollagen-jeg når kulturperler på et plant underlag. Derudover kan hydrogel forhåndsudfyldes med nyre-specifikke celler før gellation model en mere fysiologisk relevante 3-dimensionelle miljø. Sammensætningen af kECM hydrogel kan også nemt manipuleres. For eksempel, blande hydrogel med varierende mængder af kollagen-jeg før gellation kunne producere matricer, der efterligner progressive stater af renal fibrose31,32. Tunability af denne ECM-afledte hydrogel til at efterligne kendte syge ECM kompositioner berettiger yderligere undersøgelse og vil gøre det muligt for den kommende undersøgelse af nyresygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Lynn og Mike Garvey Imaging laboratorium ved Institut for stamceller og regenerativ medicin og LifeCenter nordvest. De vil også gerne anerkende økonomisk støtte fra National Institutes of Health tilskud, UH2/UH3 TR000504 (til J.H.) og DP2DK102258 (til Y.Z.), NIH T32 uddannelse grant DK0007467 (til R.J.N.) og en ubegrænset gave fra nordvest nyre centre til den Nyre Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
- Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
- Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
- Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
- Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
- Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
- Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
- Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
- O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
- Streitberger, K. -J., et al.
- Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
- Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
- Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
- Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
- Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
- Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
- Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
- Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
- Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
- Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
- Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
- Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
- Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
- Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
- Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
- Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
- Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).
