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Bioengineering

एक गुर्दा प्रांतस्था Extracellular मैट्रिक्स-व्युत्पंन Hydrogel

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58314
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Department of Bioengineering, Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington, 3Department of Medicine, Kidney Research Institute, University of Washington

Summary

यहां हम एक प्रांतस्था extracellular मैट्रिक्स-व्युत्पंन hydrogel के लिए देशी गुर्दे extracellular मैट्रिक्स (ECM) संरचनात्मक और जैव रासायनिक संरचना बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । निर्माण प्रक्रिया और उसके आवेदनों का वर्णन किया गया है । अंत में, इस hydrogel का उपयोग करने के लिए गुर्दे की विशिष्ट सेलुलर और ऊतक पुनर्जनन और इंजीनियरिंग का समर्थन करने पर एक परिप्रेक्ष्य पर चर्चा की है ।

Abstract

Extracellular मैट्रिक्स (ECM) ऊतक homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण जैव-रासायनिक cues प्रदान करता है । वर्तमान सिंथेटिक hydrogels में इन विट्रो सेल संस्कृति के लिए मजबूत यांत्रिक समर्थन की पेशकश लेकिन आवश्यक प्रोटीन और ligand रचना कोशिकाओं से शारीरिक व्यवहार को दूर करने के लिए कमी है । इस पांडुलिपि एक गुर्दा प्रांतस्था ECM के लिए एक निर्माण विधि का वर्णन-उचित यांत्रिक मजबूती और सहायक जैव रासायनिक संरचना के साथ hydrogel व्युत्पंन । hydrogel को यांत्रिक रूप से अनुमन्य तथा solubilizing की गई मानव किडनी प्रांतस्था ECM से निर्मित है । मैट्रिक्स देशी गुर्दे प्रांतस्था ECM प्रोटीन अनुपात को बरकरार रखता है, जबकि भी जमाना को सक्षम करने के लिए शारीरिक यांत्रिक stiffnesses. hydrogel एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, जिस पर गुर्दे प्रांतस्था-व्युत्पन्न कोशिकाओं को शारीरिक स्थितियों के तहत बनाए रखा जा सकता है । इसके अलावा, hydrogel संरचना एक रोगग्रस्त वातावरण है जो गुर्दे की बीमारियों के भविष्य के अध्ययन में सक्षम बनाता है मॉडल में हेरफेर किया जा सकता है ।

Introduction

Extracellular मैट्रिक्स (ECM) ऊतक homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण जैव-रासायनिक cues प्रदान करता है । जटिल आणविक संरचना ऊतक के दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों को नियंत्रित करता है । संरचनात्मक प्रोटीन स्थानिक जागरूकता के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते हैं और आसंजन और1प्रवास के लिए अनुमति देते हैं । बाउंड लाइगैंडों सेल व्यवहार2को नियंत्रित करने के लिए सेल की सतह रिसेप्टर्स के साथ बातचीत. गुर्दे ECM अणुओं जिनकी संरचना और संरचना संरचनात्मक स्थान, विकास के चरण पर निर्भर करता है की एक बहुतायत होता है, और रोग राज्य3,4। Recapitulating ECM की जटिलता इन विट्रो मेंगुर्दे व्युत्पंन कोशिकाओं का अध्ययन में एक महत्वपूर्ण पहलू है ।

नकल ECM microenvironments पर पिछले प्रयास decellularizing पूरे ऊतक पर ध्यान केंद्रित किया है पाड़ों recellularization में सक्षम बनाने के लिए । Decellularization ऐसे सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) या गैर ईओण डिटर्जेंट के रूप में रासायनिक डिटर्जेंट के साथ प्रदर्शन किया गया है, और यह या तो पूरे अंग छिड़काव या विसर्जन और आंदोलन तरीकों का इस्तेमाल5,6,7 ,8,9,10,11,12,13। पाड़ों यहां प्रस्तुत संरचनात्मक और जैव रासायनिक संकेत देशी ऊतक ECM में पाया संरक्षित; इसके अलावा, दाता के साथ recellularization-विशिष्ट कोशिकाओं को पुनर्निर्माण सर्जरी में नैदानिक प्रासंगिकता है14,15,16,17,18, 19. हालांकि, इन पाड़ों संरचनात्मक लचीलेपन की कमी है और इसलिए कई वर्तमान इन विट्रो अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के साथ असंगत हैं । इस सीमाको दूर करने के लिए, कई समूहों को आगे hydrogels20,21,22,23,24में ECM की कार्रवाई की है । इन hydrogels इंजेक्शन मोल्डिंग और bioink के साथ संगत कर रहे हैं और माइक्रोमीटर पैमाने स्थानिक बाधाओं कि कोशिकाओं पर विस्थापित पाड़ों जगह दरकिनार. इसके अलावा, आणविक संरचना और देशी ECM में पाया अनुपात3,25संरक्षित कर रहे हैं । यहां हम एक विधि का प्रदर्शन करने के लिए एक गुर्दा प्रांतस्था ECM (kECM) से व्युत्पंन hydrogel बनाना ।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक hydrogel है कि गुर्दे cortical क्षेत्र के microenvironment प्रतिकृति उत्पादन करने के लिए है । गुर्दे प्रांतस्था ऊतक सेलुलर मामले को दूर करने के लिए लगातार आंदोलन के तहत एक 1% एसडीएस समाधान में सेलुलर है । एसडीएस सामांयतः प्रतिरक्षा सेलुलर सामग्री6,7,9,26को जल्दी से दूर करने की क्षमता की वजह से decellularize ऊतक के लिए प्रयोग किया जाता है । kECM तो यांत्रिक homogenization और lyophilization5,6,9,11,26के अधीन है । एक मजबूत एसिड में Solubilization एक अंतिम hydrogel शेयर समाधान में पेप्सिन परिणाम के साथ20,27। संरचनात्मक समर्थन और संकेत transduction के लिए महत्वपूर्ण है कि देशी kECM प्रोटीन3,25संरक्षित कर रहे हैं । hydrogel भी देशी मानव गुर्दे प्रांतस्था28,29,30के परिमाण के एक आदेश के भीतर gelled जा सकता है । यह मैट्रिक्स एक शारीरिक वातावरण है कि अंय मैट्रिक्स प्रोटीन से hydrogels की तुलना में गुर्दे की विशिष्ट कोशिकाओं के quiescence बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रदान करता है । इसके अलावा, मैट्रिक्स संरचना चालाकी, उदाहरण के लिए, कोलेजन के अलावा के माध्यम से किया जा सकता है, मैं, गुर्दे फाइब्रोसिस और अंय गुर्दे की बीमारियों के अध्ययन के लिए मॉडल रोग वातावरण31,३२।

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Protocol

मानव गुर्दे LifeCenter नॉर्थवेस्ट द्वारा अलग नैतिक दिशानिर्देश अंग खरीद संगठनों के संघ द्वारा निर्धारित कर रहे थे । इस प्रोटोकॉल वॉशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा उल्लिखित पशु देखभाल और सेल संस्कृति के दिशा निर्देशों का पालन करता है ।

1. मानव गुर्दे के ऊतकों की तैयारी

  1. decellularization समाधान की तैयारी
    1. एक ५००० मिलीलीटर चोंच और एक ७० x 10 मिमी हलचल बार निष्फल ।
    2. मिश्रण 1:1000 (वजन: मात्रा) autoclaved में सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) चोंच में पानी के रूप में । एक हलचल थाली पर 24 घंटे के लिए लगभग २०० rpm पर समाधान छोड़ या जब तक एसडीएस पूरी तरह से भंग है ।
      नोट: सामान्यतया, २५०० मिलीलीटर का 1% एसडीएस समाधान एक एकल मानव गुर्दे decellularize करने के लिए पर्याप्त है ।
    3. एक ५०० मिलीलीटर बाँझ वैक्यूम फिल्टर करने के लिए समाधान स्थानांतरण और निष्फल सील कंटेनरों में यह फिल्टर ।
  2. गुर्दे के ऊतकों के प्रसंस्करण
    1. धो और आटोक्लेव संदंश की एक जोड़ी, दो hemostat clamps, सामांय सेवा ग्रेड कैंची की एक जोड़ी, दो स्केलपेल ब्लेड संभालती है, एक १००० मिलीलीटर एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर चोंच, और एक ३६ x 9 मिमी हलचल बार ।
    2. underpad के साथ एक ऊतक संस्कृति हूड लाइन । चोंच, एक बाँझ ऊतक संस्कृति पकवान (१५० x 25 मिमी), और डाकू में पूरे गुर्दे अंग प्लेस । यूरिन को 1% एसडीएस सॉल्यूशन के ५०० मिलीलीटर के साथ भरें ।
      नोट: मानव गुर्दे LifeCenter नॉर्थवेस्ट से बर्फ पर प्राप्त किया गया ।
    3. बाँझ ऊतक संस्कृति डिश (चित्रा 1a) में गुर्दे की जगह । हल्के से एक स्केलपेल (आंकड़ा 1b) के साथ गुर्दे कैप्सूल के आसपास शेविंग द्वारा सभी perirenal वसा निकालें ।
    4. स्केलपेल के साथ एक उथले 8-10 सेमी चीरा बनाओ, बस गहरी पर्याप्त गुर्दे की सुपीरियर एंड भर में अंतर्निहित प्रांतस्था ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना गुर्दे कैप्सूल खुला तोड़ने के लिए । यह दो hemostat clamps (चित्रा 1C) के साथ प्रांतस्था ऊतक से दूर छील द्वारा गुर्दे कैप्सूल निकालें ।
    5. Bisect गुर्दे (चित्रा 1 डी) के पार्श्व पक्ष के साथ स्केलपेल का उपयोग करके कोरोनरी विमान के साथ गुर्दा । दोनों हिस्सों से स्केलपेल (चित्रा 1E) के साथ medullar क्षेत्र बाहर नक्काशी और ०.५ सेमी3 टुकड़ों (चित्रा प्रांतस्था) में 1F ऊतक पासा द्वारा प्रांतस्था ऊतक अलग । किसी भी बड़े दिखाई जहाजों को निकालें ।
  3. extracellular मैट्रिक्स का अलगाव
    1. एक ऊतक संस्कृति हुड में, 1% एसडीएस समाधान की ५०० मिलीलीटर के साथ एक १००० मिलीलीटर चोंच भरें । पासा प्रांतस्था ऊतक प्लेस और एसडीएस समाधान युक्त चोंच में बार हलचल । कवर autoclaved एल्यूमीनियम पंनी के साथ चोंच और यह लगभग ४०० rpm पर एक हलचल प्लेट पर ऊतक संस्कृति हूड के बाहर जगह है ।
    2. प्रांतस्था ऊतक 24 घंटे के लिए हलचल प्लेट पर किया गया है के बाद, एक ऊतक संस्कृति हुड में चोंच लाने के लिए और एक ४० µm बाँझ सेल छलनी नायलॉन जाल के साथ बनाया जोड़ने. ब्लीच की २०० मिलीलीटर के साथ एक अलग १००० मिलीलीटर चोंच भरें और इसे टिशू कल्चर हुड में रखें ।
    3. सेल छलनी के माध्यम से एसडीएस सॉल्यूशन को पिपेट में ब्लीच युक्त चोंच में लगाइये । केवल सेलुलर ऊतक और कोशिका छलनी चोंच में रहने तक सभी एसडीएस समाधान बाहर पिपेट ।
      नोट: सेल छलनी समाधान आकांक्षा के दौरान हटाया जा रहा से किसी भी ऊतक को रोकने चाहिए ।
    4. सेल छलनी को यूरिन में छोड़ दें और ताजा एसडीएस सॉल्यूशन के ५०० मिलीलीटर के साथ भरें । एक ही गति से पहले के रूप में एक हलचल प्लेट पर एक ही एल्यूमीनियम पंनी और जगह के साथ चोंच कवर ।
    5. दोहराएं चरणों 1.3.1-1.3.3 हर 24 घंटे के लिए ताजा एसडीएस समाधान के साथ कुल पांच दिनों के लिए ।
    6. autoclaved DI पानी के साथ हर 24 घंटे के लिए 3 दिन कुल कुल्ला ऊतक, चरणों में उल्लिखित तकनीक के बाद 1.3.1-1.3.3 ।
    7. सेल संस्कृति ग्रेड पानी हर 24 घंटे के लिए कुल 2 दिन के लिए, चरणों में उल्लिखित तकनीक निंनलिखित 1.3.1-1.3.3 कुल्ला ऊतक ।
    8. दोहराएँ चरण 1.3.1-1.3.2. एक 30 मिलीलीटर स्वयं खड़े शंकु ट्यूब में (इस बिंदु से kECM के रूप में संदर्भित) सेलुलर ऊतक हस्तांतरण और सभी ऊतक जलमग्न है जब तक यह सेल संस्कृति ग्रेड पानी के साथ भरें ।

2. Hydrogel स्टॉक समाधान का निर्माण

  1. सेलुलर ऊतक के यांत्रिक प्रसंस्करण
    1. एक ऊतक संस्कृति हुड में, kECM homogenize 2 मिनट के लिए एक ऊतक homogenizer के साथ शंकु ट्यूब के भीतर यांत्रिक ।
      नोट: Homogenized kECM ECM के कोई दिखाई टुकड़े के साथ एक अपारदर्शी समाधान के समान होना चाहिए ।
    2. शंकु ट्यूब आसपास उबलते जब तक तरल नाइट्रोजन में kECM से युक्त है कि अब नहीं बनी रहती है जलमग्न । kECM पर-4 ˚ सी रात भर स्टोर ।
  2. जमे हुए सेलुलर ऊतक के Lyophilization
    1. थोड़ा शंकु ट्यूब टोपी को ढीला गैस विनिमय के लिए अनुमति देने के लिए और एक lyophilization मशीन में ट्यूब जगह है । Lyophilize तीन दिन के लिए kECM या जब तक यह एक ठीक सफेद पाउडर जैसा दिखता है । स्टोर पर-4 ˚ सी.
  3. रासायनिक पाचन और जेल के solubilization
    1. एक 20 मिलीलीटर आटोक्लेव शीशी और कैप, एक १५.९ x ७.९ mm हलचल बार, और ठीक-टिप संदंश के एक जोड़ी ।
    2. lyophilized kECM तौलना और एचसीएल और पेप्सिन के द्रव्यमान की मात्रा की गणना करने के लिए kECM एक 3% (30 मिलीग्राम/एमएल) समाधान निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग कर, जहां एमपेप्सिन पेप्सिन के द्रव्यमान है, एमऊतक के द्रव्यमान है lyophilized ऊतक, और वीएचसीएल ०.०१ एन एचसीएल की मात्रा है:
      Equation 1
      Equation 2
    3. एक ऊतक संस्कृति हुड में, सुअर का गैस्ट्रिक पेप्सिन, ०.०१ एन एचसीएल, और जुटाना शीशी को हलचल बार जोड़ें, और यह लगभग ५०० rpm पर एक हलचल प्लेट पर छोड़ जब तक सभी पेप्सिन भंग कर दिया है । lyophilized kECM को जुटाकर शीशी में स्थानांतरित करें और समाधान को एक हलचल प्लेट पर तीन दिनों के लिए लगभग ५०० rpm पर छोड़ दें ।

3. Hydrogel जमाना

  1. किडनी ECM hydrogel तयारी
    1. 1 N NaOH, 10x मीडिया अनुपूरक (M199), और सेल संस्कृति मीडिया के साथ kECM hydrogel शेयर समाधान मिश्रण द्वारा hydrogel जेल । बर्फ पर सभी समाधान रखें ।
      नोट: ७.५ मिलीग्राम/एमएल के अंतिम जेल सांद्रता सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया । kECM जेल के 1 मिलीलीटर सेल संस्कृति प्रयोगों प्रस्तुत करने के लिए पर्याप्त था ।
    2. व्यावहारिक kECM जेल की मात्रा का उत्पादन और स्टॉक kECM hydrogel की मात्रा का निर्धारण निंनलिखित समीकरण, जहां वीअंतिम जेल बनाया की मात्रा है का उपयोग करके की जरूरत है, वीस्टॉक kECM स्टॉक kECM hydrogel की मात्रा की जरूरत है, सीस्टॉक kECM स्टॉक kECM hydrogel की एकाग्रता है, और सीअंतिम अंतिम जेल की एकाग्रता है:
      Equation 3
    3. निम्न समीकरणों का उपयोग करके आवश्यक एजेंट को निष्क्रिय करने की मात्रा निर्धारित करें, जहाँ vNaOH 1 N NaOH की मात्रा है, v10x M199 10x मीडिया अनुपूरक की मात्रा है, और v1x है सेल संस्कृति मीडिया की मात्रा:
      Equation 4
      Equation 5
      Equation 6
    4. एक ऊतक संस्कृति हुड में, पिपेट बेअसर एजेंट (NaOH, M199, और सेल संस्कृति मीडिया) एक बाँझ में 30 एमएल स्वयं खड़े शंकु ट्यूब. एक microspatula के साथ बेअसर एजेंट समाधान मिक्स ।
    5. एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए उचित kECM hydrogel स्टॉक के उपयुक्त मात्रा में स्थानांतरित करने के लिए बेअसर एजेंट समाधान. एक microspatula का प्रयोग करें धीरे समाधान मिश्रण जब तक एक सजातीय रंग hydrogel समाधान में प्राप्त की है ।
      नोट: धीमे और धीरे उभार से हवा के बुलबुले शुरू करने से बचें ।
    6. kECM hydrogel में कक्षों को शामिल करने के लिए, चरण 3.1.1.3 में बेअसर समाधान वॉल्यूम परिकलनों से सेल कल्चर मीडिया (V1x) के 10 µ l को घटाना ।
      1. सेल संस्कृति मीडिया के 10 µ एल में कोशिकाओं को निलंबित । निंन समीकरण का उपयोग करके निलंबित करने के लिए कक्षों की संख्या निर्धारित करें, जहां #कक्षों को निलंबित करने के लिए कक्षों की संख्या का तात्पर्य है और Vfinal को बनाया गया जेल की मात्रा है:
        Equation 7
        नोट: ३००,००० कक्ष/एमएल kECM जेल में इस्तेमाल किया कोशिकाओं की एकाग्रता है ।
      2. पिपेट kECM स्टॉक समाधान बेअसर reagent समाधान के साथ मिलाया गया है के बाद सेल निलंबित समाधान के अंतिम kECM जेल में 10 µ एल की है । एक microspatula के साथ समाधान हलचल जब तक कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे हैं ।
  2. kECM hydrogel के साथ एक वांछित सेल संस्कृति उपकरण को भरने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें ।
  3. स्थानांतरण या कोशिकाओं को चढ़ाना पहले 1 ज के लिए ३७ ˚ सी पर सेट करने के लिए जेल की अनुमति दें ।

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Representative Results

kECM hydrogel देशी गुर्दे microenvironment के रूप में समान रासायनिक संरचना के साथ गुर्दा कोशिका संस्कृति के लिए एक मैट्रिक्स प्रदान करता है । hydrogel बनाना, गुर्दे प्रांतस्था ऊतक यांत्रिक एक पूरी गुर्दे अंग से अलग है और (चित्रा 1) पासा । एक रासायनिक डिटर्जेंट के साथ Decellularization (चित्रा 2a.1-a. 3) पानी के साथ कुल्ला के बाद डिटर्जेंट कणों को दूर करने के लिए (चित्रा 2a.4-ए .6) पैदावार अलग गुर्दे प्रांतस्था ECM । ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन इस तरह के रूप में विशिष्ट बेसल लामिना प्रोटीन की पुष्टि कोलेजन चतुर्थ और laminin और ऐसे कोलेजन के रूप में संरचनात्मक प्रोटीन-मैं संरक्षित कर रहे हैं, vitronectin के साथ ही उल्लेख किया अपवाद (आंकड़ा बी4) । इसके अलावा, प्रोटीन संरचना, isoforms के संरक्षण सहित, ECM में देशी गुर्दे ECM (चित्रा 3) में मनाया मूल्यों के अनुरूप रहता है । ECM (फिगर 4a) यांत्रिक है homogenized और lyophilized (चित्रा 4B) तो solubilized उत्पादन करने के लिए अंतिम kECM hydrogel (चित्रा 4c). kECM hydrogel दिखाई ऊतक की छोटी मात्रा के साथ अपारदर्शी दिखाई दिया और के रूप में नहीं था चिपचिपा के रूप में पारंपरिक कोलेजन-मैं hydrogel । 15 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर gelled kECM के Rheological माप तनाव मूल्यों के रैखिक सीमा पर लगभग ८०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी के एक जटिल मापांक (गतिशील लोचदार मापांक) से पता चला, काफी ७.५ मिलीग्राम/एमएल कोलेजन-I (पी = 1.602 ई-14) की तुलना में अधिक है । मानव गुर्दे peritubular microvascular endothelial कोशिकाओं (HKMECs) कोलेजन पर संस्कृति, मैं, kECM, और एक 1:1 मिश्रण जेल phenotype में अंतर दिखाया, विशेष रूप से सेल सतहों और जंक्शनों के आसपास CD31 अभिव्यक्ति में (चित्रा 5) । HKMECs पर कल्चरित कोलेजन-मैं वर्दी CD31 अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हुए HKMECs kECM युक्त दो जैल पर संस्कृतिया असमान वितरण में कम CD31 अभिव्यक्ति प्रदर्शित । मैट्रिक्स प्रकार उच्च PV1 और कम VWF अभिव्यक्ति HKMECs में प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं हुआ ।

Figure 1
चित्रा 1: गुर्दे प्रांतस्था ऊतक के अलगाव । एक पूरे गुर्दे अंग के यांत्रिक प्रसंस्करण kECM hydrogel के लिए एक आधार सामग्री के रूप में प्रांतस्था ऊतक को अलग करने के लिए । यांत्रिक अलगाव (क) perirenal वसा ऊतक को हटाने के साथ शुरू होता है । वसा ऊतक के बड़े टुकड़े hemostat clamps के साथ गुर्दे से दूर फटे जा सकता है । वसा ऊतक के शेष टुकड़े एक कोण पर गुर्दे कैप्सूल के खिलाफ एक स्केलपेल चलाकर हटाया जा सकता है । (ख) गुर्दे कैप्सूल सबसे अच्छा गुर्दे की बेहतर अंत के साथ एक उथले चीरा बनाने के द्वारा हटाया जाता है और (ग) hemostat clamps के साथ अंतर्निहित ऊतक से दूर गुर्दे कैप्सूल छीलने. (घ) Bisecting कोरोनरी धुरी के साथ गुर्दे प्रांतस्था और मज्जा क्षेत्रों के दृश्य के लिए अनुमति देता है । (ङ) प्रांतस्था ऊतक के अलगाव सबसे अच्छा एक स्केलपेल के साथ मज्जा ऊतक के टुकड़े नक्काशी द्वारा किया जाता है । cortical क्षेत्र के रंग medullar क्षेत्र की तुलना में स्पष्ट रूप से गहरा है और इस्तेमाल किया जा सकता है दो anatomically अलग ऊतकों अंतर । प्रांतस्था ऊतक के अंतिम प्रसंस्करण शामिल है (च) ०.५ सेमी3 टुकड़ों में ऊतक dicing बाद में decellularization में सहायता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रांतस्था ऊतक के Decellularization । सेलुलर ऊतक के दृश्य और ऊतकवैज्ञानिक लक्षण वर्णन । (A .1) 1% एसडीएस समाधान में प्रांतस्था ऊतक उपविलयन कोशिकाओं के lysing और सेलुलर सामग्री को हटाने का कारण बनता है । (a .2) 1 ज और (a .3) 24 ज के बाद, ऊतक रंग खोने के लिए शुरू होता है, सेलुलर बात का संकेत है हटाया जा रहा है । के द्वारा (क. ४) १२० ज के ऊतक को उबालकर और केवल ECM रहता है. (ए .5) 24 एच और (ए .6) १२० एच में पानी के साथ कुल्ला ऊतक के लिए कोई दृश्य परिवर्तन दिखाई देते हैं । (ख) अनुपचारित और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रांतस्था ऊतक के दाग सेलुलर बात और प्रमुख संरचनात्मक प्रोटीन के संरक्षण के पास पूरा हटाने से पता चलता है (कोलेजन-iv = कर्नल चतुर्थ; laminin = लाम; fibronectin = एफ एन; हेपरिन सल्फेट proteoglycans = HSPG; और vitronectin = VN) । स्केल = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर ऊतक के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी । ECM प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विप्रांतस्था ऊतक का विश्लेषण । सभी अनुपात जन प्रतिशत के रूप में मापा जाता है । (क) संरचनात्मक और अंय बेसल लेमिना के साथ जुड़े प्रोटीन कोलेजन चतुर्थ के साथ मौजूद थे और मैं सबसे उच्च प्रतिनिधित्व किया जा रहा है । (ख .1) कोलेजन-IV A1 और A2 जंजीरों, सभी तहखाने झिल्ली में सर्वव्यापी, संरक्षित किया गया । कोलेजन-IV A3 और A5 जंजीरों, केवल glomerulus के तहखाने झिल्ली में मौजूद, यह भी पता लगाया गया । (ख .2) laminins के आम isoforms और (बी .3) कोलेजन-मैं भी पाया गया । 12अनुमति के साथ यह आंकड़ा reproduced था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: kECM hydrogel का निर्माण । यांत्रिक और रासायनिक प्रसंस्करण के लिए विप्रांतस्था ऊतक पर्याप्त यांत्रिक गुणों के साथ एक व्यावहारिक kECM hydrogel पैदावार जमाना के साथ निंनलिखित निष्क्रिय एजेंट । (क) प्रांतस्था ऊतक यांत्रिक रूप से एक ऊतक homogenizer के साथ homogenized है जब तक ECM के कोई दिखाई टुकड़े रह रहे हैं । (ख) lyophilization के तहत 3 दिन के बाद एक मोटे चूर्ण की पैदावार हुई । (ग) एचसीएल में Solubilization और रासायनिक पाचन में पेप्सिन के साथ एक जुटाई शीशी में एक व्यावहारिक kECM hydrogel के परिणामस्वरूप । hydrogel अपारदर्शी और एक कम चिपचिपापन की थी । (घ) kECM hydrogel के शारीरिक लक्षण वर्णन के साथ जमाना के बाद बेअसर । Rheological प्रयोगों 30 मिमी व्यास समानांतर प्लेट प्रणाली के साथ प्रदर्शन किया गया । नमूना किनारों खनिज तेल के साथ संरक्षित किया गया और लोडिंग मंच ३७ ˚ C पर स्थापित किया गया था । kECM hydrogel को परीक्षण के लिए 1 ज से पहले जेल की अनुमति दी गई थी । जेल के Viscoelastic गुण ०.०१ से 20% के बीच एक तनाव झाडू के साथ मापा गया । दोनों kECM और कोलेजन के तीन नमूने-मैं परीक्षण किया गया (n = 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सेल वृद्धि लक्षण वर्णन । विभिंन मैट्रिक्स पर हो HKMECs में रूपात्मक मतभेदों का लक्षण वर्णन । Hydrogels बेअसर रिएजेंट और खुले में ४५ मिनट के लिए ३७ ˚ सी पर सेट के साथ मिश्रित थे polydimethylsiloxane molds का सामना करना पड़ा । HKMECs जैल की सतह पर बीज और तय किया जा रहा है और दाग से पहले ७२ ज के लिए संस्कृति में रखा गया था । Immunofluorescent में HKMECs के चित्र (ए और डी) ७.५ मिलीग्राम/एमएल कोलेजन-मैं जेल; (बी और ई) ७.५ मिलीग्राम/एमएल kECM जेल; और (सी और एफ) ७.५ मिलीग्राम/एमएल 1:1 मिक्सचर जेल । (A-C): red = CD31; हरा = VWF; नीला = नाभिक; स्केल बार = ५० µm. (D-f): red = f-actin; हरा = PV1; नीला = नाभिक; स्केल बार = ५० µm । 12अनुमति के साथ यह आंकड़ा reproduced था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

मैट्रिक्स महत्वपूर्ण यांत्रिक और रासायनिक cues कि सेल व्यवहार को नियंत्रित प्रदान करते हैं । सिंथेटिक hydrogels जटिल 3 आयामी पैटर्न का समर्थन करने में सक्षम हैं, लेकिन विविध extracellular शारीरिक मैट्रिक्स microenvironments में पाया cues प्रदान करने के लिए असफल । Hydrogels देशी ECM से व्युत्पंन दोनों vivo में और इन विट्रो अध्ययन के लिए आदर्श सामग्री हैं । पिछले अध्ययनों का इस्तेमाल किया है ECM hydrogels कोट सिंथेटिक के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए,३४, स्टेम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए३५,३६,३७ , ३८, 2d और नरम लिथोग्राफी सेल संस्कृति३९,४०,४१,४२के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में, और 3 के लिए स्याही की तैयारी में-आयामी मुद्रण४३, ४४ , ४५ , ४६. ECM hydrogels आसंजन शुरू करने और आगे प्रसार और भेदभाव2,४७को नियंत्रित करने के लिए उचित संकेतन के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते हैं ।

अनुपात और ECM के प्रमुख घटकों की संरचना, जैसे कोलेजन, laminins, elastin, fibronectin, और glycosaminoglycans, अत्यधिक संरचनात्मक स्थान और ऊतक४८,४९की कार्यक्षमता पर निर्भर हैं, ५०. यह अच्छी तरह से स्थापित है कि गैर विशिष्ट या देशी ECM-व्युत्पंन hydrogels का उपयोग कर21,५१,५२,५३,५४कोशिकाओं से अनुचित प्रतिक्रियाओं में लाना होगा । गुर्दे में, ECM संरचना संरचनात्मक स्थानों के बीच व्यापक रूप से भिन्न होता है1,2. इसलिए प्रयोगात्मक उपयोग के लिए hydrogels निर्मित करने से पहले प्रांतस्था, मज्जा, या papilla जैसे क्षेत्रों के बीच अंतर करना महत्वपूर्ण है ।

kECM मैट्रिक्स यहां गढ़े देशी गुर्दे प्रांतस्था ECM प्रोटीन अनुपात decellularization निंनलिखित को बरकरार रखता है, जबकि यह भी एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक कठोरता3,25,28के लिए जमाना को सक्षम करने, २९,३०. सीरम एल्ब्युमिन, एक रक्त प्लाज्मा प्रोटीन, सेलुलर प्रांतस्था ऊतक के भीतर मात्रा का पता लगाने में पता लगाया गया था, संभवतः हेपरिन कि बच decellularization और५५,५६धोने के लिए बाध्यकारी के कारण । हालांकि पेप्सिन, एक गैर गुर्दे प्रांतस्था ECM के लिए देशी रासायनिक, स्टॉक kECM समाधान में मौजूद है, यह केवल २.५% के लिए खातों (डब्ल्यू/वी) अंतिम gelled उत्पाद के । इसके अलावा, पेप्सिन बेअसर एजेंट समाधान५७के अतिरिक्त के साथ निष्क्रिय हो जाता है ।

kECM hydrogel एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है, जिस पर गुर्दे प्रांतस्था-विशिष्ट कोशिकाओं को शारीरिक स्थितियों के तहत बनाए रखा जा सकता है । हम प्रदर्शन किया है कि इस मैट्रिक्स एक planar सतह पर HKMEC विकास का समर्थन कर सकते हैं । इन HKMECs एक quiescent शारीरिक राज्य के रूप में कार्यात्मक परख, phenotypic अभिव्यक्ति, और आनुवंशिक अभिव्यक्ति५८के माध्यम से निर्धारित बनाए रखा । इसके विपरीत, इन कोशिकाओं को सक्रिय हो गया जब कोलेजन, मैं, एक मैट्रिक्स गुर्दा फाइब्रोसिस से संबंधित घटक, एक 1:1 अनुपात५९पर kECM hydrogel में जोड़ा गया था । तुलना करके, जब मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं कोलेजन पर संस्कृति थे, मैं, वे quiescent थे, और जब kECM के साथ मिश्रित वे12सक्रिय हो गया । तदनुसार, कोलेजन-मैं गर्भनाल के भीतर तहखाने झिल्ली संरचना का एक अभिंन घटक हो जाना जाता है और preeclampsia३८,६०जैसे रोग राज्यों में कम है । इन परिणामों quiescence बनाए रखने के लिए ऊतक विशेष cues के साथ कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के महत्व पर प्रकाश डाला और यह भी कैसे ECM वातावरण के हेरफेर homeostasis को प्रभावित कर सकते हैं ।

जबकि उल्लिखित प्रक्रिया में सभी कदम महत्वपूर्ण हैं, कई कदम गढ़े hydrogel की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण हैं । सेलुलर प्रांतस्था ऊतक के homogenization की डिग्री तकनीक या इस्तेमाल किया उपकरणों के आधार पर भिंन होगा । यह एक तकनीक है कि सबसे अच्छा ऊतक homogenize होगा खोजने के लिए महत्वपूर्ण है । solubilization के दौरान, पेप्सिन सक्रिय है यह सुनिश्चित करने के लिए पीएच 3-4 पर रखा जाना चाहिए । निष्क्रिय एजेंट के साथ hydrogel मिश्रण करते हैं, जेल अच्छी तरह से और हवा के बुलबुले की शुरूआत के बिना मिलाया जाना चाहिए । एक समान मिश्रण को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, तो यह तटस्थ है यह सुनिश्चित करने के लिए जेल समाधान के पीएच की जाँच करें ।

इस विधि में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है कि कैसे एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मैट्रिक्स गुर्दे की कोशिकाओं के इन विट्रो में अध्ययन के लिए प्राप्त किया जा सकता है । सेलुलर गुर्दे प्रांतस्था ECM एक आदर्श आधार सामग्री प्रदान करता है के रूप में ECM प्रोटीन अनुपात अंतिम hydrogel उत्पाद3,25में संरक्षित कर रहे है गुर्दे व्युत्पंन कोशिका वृद्धि का समर्थन । gelled उत्पाद भी शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक गुणों को प्राप्त कर सकते हैं28,29,30. kECM hydrogel उचित सेल मैट्रिक्स बातचीत के लिए अनुमति देता है और के लिए कोलेजन से गुर्दे की कोशिकाओं से अधिक शारीरिक व्यवहार में लाना दिखाया गया है-मैं जब एक planar सतह पर संस्कृति । इसके अलावा, hydrogel गुर्दे के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है विशिष्ट कोशिकाओं को जमाना से पहले एक और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 आयामी वातावरण मॉडल । kECM hydrogel की संरचना को भी आसानी से हेर-फेर किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, कोलेजन की मात्रा बदलती के साथ hydrogel मिश्रण-मैं जमाना से पहले मैट्रिक्स कि गुर्दे की फाइब्रोसिस के प्रगतिशील राज्यों की नकल का उत्पादन सकता है31,३२। इस ECM के tunability-व्युत्पन्न hydrogel ज्ञात रोगग्रस्त ECM रचनाओं की नकल करने के लिए वारंट आगे की जांच और गुर्दे की बीमारियों के भविष्य के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक स्टेम सेल और अपक्षयी चिकित्सा और LifeCenter नॉर्थवेस्ट के लिए संस्थान में लिन और माइक Garvey इमेजिंग प्रयोगशाला स्वीकार करना चाहते हैं । उंहोंने यह भी स्वास्थ्य अनुदान, UH2/UH3 TR000504 (J.H. के लिए) और DP2DK102258 (Y.Z.), NIH T32 प्रशिक्षण अनुदान DK0007467 (R.J.N.), और पश्चिमोत्तर गुर्दे केंद्रों से एक अप्रतिबंधित उपहार के राष्ट्रीय संस्थानों के वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते है गुर्दा अनुसंधान संस्थान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker Sigma-Aldrich Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 436143
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm) Fisher Science 14-512-128
500 mL Vacuum Filter VWR 97066-202
Stir Plate Sigma-Aldrich CLS6795420D
1000 mL Beaker Sigma-Aldrich CLS10031L
Forceps Sigma-Aldrich F4642 Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp Sigma-Aldrich Z168866
Dissecting Scissors Sigma-Aldrich Z265977
Scalpel Handle, No. 4 VWR 25859-000 Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20 VWR 25860-020 Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) Fisher Science 14-513-52
Absorbent Underpad VWR 82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm) Corning 430597
Autoclavable Biohazard Bag VWR 14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um) Fisher Science 22-363-547
Cell Culture Grade Water HyClone SH30529.03
30 mL Freestanding Tube VWR 89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine Polytron PCU-20110
Freeze Dryer Labconco 7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap Sigma-Aldrich V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm) Fisher Science 14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P7012
0.01 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530
15 mL Conical Tube ThermoFisher 339651
Cell Culture Media ThermoFisher 11330.032 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X Life Technologies 15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X Life Technologies 51300-044
1 mL Syringe Sigma-Aldrich Z192325
Microspatula Sigma-Aldrich Z193208

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इंजीनियरिंग अंक १४० अभियांत्रिकी ऊतक इंजीनियरिंग extracellular मैट्रिक्स hydrogel गुर्दे endothelial कोशिकाओं
एक गुर्दा प्रांतस्था Extracellular मैट्रिक्स-व्युत्पंन Hydrogel
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Hiraki, H. L., Nagao, R. J.,… More

Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).

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