Summary
Здесь мы представляем протокол для изготовления почечной коры внеклеточной матрицы производный гидрогеля сохранить родной почек внеклеточного матрикса (ECM) структурные и биохимический состав. Процесс изготовления и ее приложения описаны. Наконец обсуждаются перспективы использования этот Гидрогель для поддержки почек конкретной клеточной и тканевой регенерации и биоинженерии.
Abstract
Внеклеточная матрица (ECM) предоставляет важные биофизических и биохимических подсказки для поддержания гомеостаза ткани. Текущий синтетических гидрогели предлагают надежное механическое крепление в vitro клеточные культуры, но не хватает необходимых белков и лигандом состав вызывают физиологической поведение клеток. Эта рукопись описывает метод изготовления для почечной коры ECM-производные гидрогеля с правильной механической надежности и поддержки биохимического состава. Гидрогель изготовлен механической гомогенизации и растворяющие decellularized человеческая почка коры ECM. Матрица сохраняет соотношение белка родной почек корка ECM позволяя при этом гелеобразования в физиологических механическая жесткость. Гидрогель служит субстрата, на котором почек клетки коры производные может быть сохранен в физиологических условиях. Кроме того состав гидрогеля можно манипулировать для моделирования больной среде, которая позволяет будущего исследования заболеваний почек.
Introduction
Внеклеточная матрица (ECM) предоставляет важные биофизических и биохимических подсказки для поддержания гомеостаза ткани. Состав комплекса молекулярной регулирует структурные и функциональные свойства ткани. Структурные белки обеспечивают клетки с пространственной осведомленности и позволяют для адгезии и миграции1. Связанные лиганды взаимодействуют с поверхности рецепторы клеток контролировать поведение ячейки2. Почки ECM содержит множество молекул, состав и структура которого варьируется в зависимости от анатомического расположения, стадии развития и болезни состояние3,4. Изложив сложности ECM является ключевым аспектом в изучении клеток почек, полученных в пробирке.
Предыдущие попытки репликации ECM микросреды сосредоточились на decellularizing всей ткани для создания леса способны recellularization. Decellularization выступал с химическими чистящими средствами, например додецилового сульфата натрия (SDS) или неионных моющих средств, и он использует либо весь орган перфузии или погружения и агитации методы5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Подмости, представленные здесь сохранения структурных и биохимические сигналы в родной ткани ECM; Кроме того, recellularization с донорами конкретных клеток имеет клиническое значение в реконструктивной хирургии14,,1516,,1718, 19. Однако, эти леса не хватает структурной гибкости и поэтому несовместимы с многих текущих устройств, используемых для исследований в пробирке . Чтобы преодолеть это ограничение, многие группы далее перерабатывается decellularized ECM гидрогели20,21,,2223,24. Эти гидрогели совместимы с литья и bioink и обойти микрометра масштаба пространственные ограничения, которые decellularized место подмостей на клетки. Кроме того,3,25сохранились молекулярный состав и соотношение в родной ECM. Здесь мы демонстрируем способ изготовления гидрогеля, производный от почечной коры ECM (kECM).
Цель настоящего Протокола заключается в производить гидрогеля, который реплицирует микроокружения регионе кортикального слоя почек. Почечной ткани коры decellularized в 1% растворе SDS под постоянным агитации для удаления клеточной материи. SDS обычно используется для decellularize ткани из-за его способность быстро удалить иммунологические клеточного материала6,7,9,26. KECM затем подлежит механической гомогенизации и лиофилизации5,6,9,11,26. Солюбилизация в сильной кислоты с пепсин приводит к окончательной гидрогеля Стоковый раствор20,27. Родной kECM белки, которые важны для структурной поддержки и сигнала трансдукции сохранились3,25. Гидрогель можно также загущенное в в течение одного порядка величины родного человека почечной коры28,29,30. Эта матрица обеспечивает физиологические среду, которая была использована для сохранения покоя почек специфических клеток, по сравнению с гидрогели от других белков матрицы. Кроме того, состав матрицы можно манипулировать, например, путем добавления коллагена-I, чтобы модель болезни сред для исследования почек фиброз и других заболеваний почек31,32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческие почки были изолированы LifeCenter северо-запада после этические принципы, установленные Ассоциацией орган закупок организаций. Этот протокол руководящими животных ухода и клетки культуры изложенные в университете штата Вашингтон.
1. Подготовка человека почечной ткани
- Приготовление раствора decellularization
- Стерилизуйте 5000 мл стакан и бар stir 70 x 10 мм.
- Смешать 1: 1000 (Вес: объем) лаурилсульфат натрия (SDS) в газобетона деионизированную воду в стакане. Оставьте раствор на плите переполох в приблизительно 200 rpm за 24 ч или до тех пор, пока полностью не растворится ИКБ.
Примечание: Как правило, 2500 мл 1% раствора SDS достаточна для decellularize одного человека почку. - Передача решения в 500 мл стерильной вакуумной фильтр и фильтр в стерилизованные герметичные контейнеры.
- Обработка ткани почки
- Вымойте и автоклав пару щипцов, два кровоостанавливающий зажимы, общего обслуживания класса ножницами, две ручки лезвие скальпеля, 1000 мл стакан, покрытые алюминиевой фольги и бар stir 36 x 9 мм.
- Линия культуры ткани капюшон с underpad. Поместите стакан, стерильные тканевой культуры блюдо (150 x 25 мм) и весь почка органа в капот. Заполните стакан с 500 мл 1% раствора SDS.
Примечание: Человеческие почки были получены на льду с северо-запада LifeCenter. - Место почки в стерильных тканевой культуры блюдо (рис. 1A). Удалите весь околопочечный жир, слегка бритья вокруг почек капсула с помощью скальпеля (рис. 1B).
- Сделайте разрез мелкой 8-10 см с скальпель, достаточно глубоко, чтобы взломать почечной капсула без повреждения основной ткани коры, через Улучшенный конце почки. Удалите почечной капсула, пилинг от ткани коры с двумя зажимами зажим (рис. 1 c).
- Пополам почек в корональных плоскости с помощью скальпеля вдоль боковой стороны почек (рис. 1 d). Изолировать ткани коры от обеих половин, вырезая мозговое региона с скальпель (Рисунок 1E) и кости ткани коры в 0,5 см3 шт (Рисунок 1F). Удалите любые большие видимые суда.
- Изоляция внеклеточная матрица
- В культуре ткани капюшоном заполните стакан 1000 мл с 500 мл 1% раствора SDS. Поместите панели ткани и перемешать нарезанные коры в стакан, содержащие SDS решение. Обложка стакан газобетона алюминиевой фольгой и поместите его на движение плиты на примерно 400 об/мин за пределами культуры ткани капот.
- После ткани коры на пластину перемешать за 24 ч, принести стакан в культуре ткани капюшоном и добавьте 40 мкм стерильным клеток ситечко с нейлоновой сетки. Заполнить отдельный 1000 мл стакан 200 мл отбеливателя и поместите его в культуре ткани капот.
- Пипетка, SDS решение через стрейнер клеток в стакан, содержащие отбеливатель. Пипетка все SDS решения до тех пор, пока только decellularized тканей и клеток ситечко остаются в стакан.
Примечание: Ячейки фильтра должно препятствовать любой ткани удаляется во время решения аспирации. - Оставьте ячейку ситечко в стакан и заполнить с 500 мл свежего раствора SDS. Обложка стакан же алюминиевой фольгой и поместите на плиту перемешать с той же скоростью, как и раньше.
- Повторите шаги 1.3.1-1.3.3 каждые 24 часа с свежий раствор SDS для в общей сложности пять дней.
- Промывайте decellularized ткани с газобетона ди водой каждые 24 ч для всего 3 дня, после техники, изложенные в 1.3.1-1.3.3 шаги.
- Промывайте decellularized ткани клетки культуры класс водой каждые 24 ч для всего 2 дня, после техники, изложенные в 1.3.1-1.3.3 шаги.
- Повторите шаги 1.3.1-1.3.2. Передача decellularized ткани (именуемый kECM с этого момента на) в 30 мл напольный Конические трубки и заполнить его водой класса культуры клеток, до тех пор, пока все ткани погружен.
2. Изготовление раствора гидрогеля фондовой
- Механическая обработка decellularized ткани
- В культуре ткани капюшоном механически гомогенизировать kECM в конической трубки с ткани гомогенизатор на 2 мин.
Примечание: Гомогенизированные kECM должно напоминать непрозрачные решения с без видимых частей ECM. - Опускайте конические трубка, содержащая kECM в жидком азоте до кипения, вокруг трубки больше не сохраняется. Магазин kECM в-4 ° c на ночь.
- В культуре ткани капюшоном механически гомогенизировать kECM в конической трубки с ткани гомогенизатор на 2 мин.
- Лиофилизации замороженных decellularized ткани
- Слегка ослабьте крышку Конические трубки для газообмена и поместить трубку в лиофилизации машину. Lyophilize kECM в течение трех дней или до тех пор, пока он напоминает мелкий белый порошок. Магазин на-4 градусов.
- Химическое разложение и солюбилизация геля
- Автоклав сцинтилляционные флакон 20 мл и Кап, Бар перемешать 15,9 x 7,9 мм и одна пара изящных наконечник щипцов.
- Весят лиофилизированные kECM и вычислить объем HCl и массы пепсин, необходимых чтобы солюбилизировать последнего kECM до 3% (30 мг/мл) раствора с помощью следующих уравнений, где mпепсин — масса пепсин, мткани -масса Лиофилизированные ткани и VHCl является объем 0.01 N HCl:
- В культуре ткани капюшоном добавьте свиного желудка пепсин, 0.01 N HCl и перемешать бар сцинтилляционные флакон и оставить его на перемешать пластины на приблизительно 500 об/мин до тех пор, пока все пепсин распалась. Передать сцинтилляционные флакон лиофилизированных kECM и оставьте раствор на плите переполох в приблизительно 500 об/мин в течение трех дней.
3. гидрогеля гелеобразования
- Подготовка гидрогеля почек ECM
- Гель гидрогеля, смешивая Стоковый раствор kECM гидрогеля с 1 N NaOH, 10 x СМИ дополнение (M199) и клеточной культуры средств массовой информации. Держите все решения на льду.
Примечание: Для клеточной культуры использовались окончательный гель концентрации 7,5 мг/мл. 1 мл геля kECM было достаточно для клеток экспериментов культуры представил. - Определить объем реальных kECM гель производства и объем запасов kECM гидрогеля, необходимо с помощью следующее уравнение, где Vокончательный объем гель создан, Vфондовых kECM является объем запасов kECM гидрогеля необходимы, Cакции kECM концентрация запасов kECM гидрогеля, и Cокончательный концентрация окончательного геля:
- Определить объем нейтрализации реагентов, необходимых с помощью следующих уравнений, где VNaOH объем 1 N NaOH, V10 X является объем M199 дополнение 10 X СМИ, и V 1 X Объём клетки культуры средств массовой информации:
- В культуре ткани капюшоном Пипетка нейтрализации реагентов (NaOH, M199 и СМИ культуры клеток) в стерильных 30 мл напольный Конические трубки. Mix решение нейтрализующего реагента с microspatula.
- Используйте шприц 1 мл стерильного раствора для передачи соответствующий объем запасов kECM гидрогеля на нейтрализации раствора реагента. Используйте microspatula осторожно смешать решения до получения однородной в цветной Гидрогель решения.
Примечание: Избегайте, представляя пузырьки воздуха, помешивая, медленно и осторожно. - Чтобы включить клетки в kECM гидрогеля, вычтите из нейтрализовать решение объем вычислений в шаге 3.1.1.3 10 мкл СМИ культуры клеток (V1 X).
- Приостановите клетки в 10 мкл клетки культуры средств массовой информации. Определите количество клеток приостановлено, используя следующее уравнение, где #клетки подразумевает количество клеток приостановить и Vокончательный объем гель создан:
Примечание: 300 000 клеток/мл – концентрация клеток, используемых в kECM гель. - Пипетка 10 мкл раствора клеток приостановлено в окончательном kECM гель после Стоковый раствор kECM были смешаны с нейтрализации раствора реагента. Перемешайте раствор с microspatula, до тех пор, пока клетки равномерно распределены.
- Приостановите клетки в 10 мкл клетки культуры средств массовой информации. Определите количество клеток приостановлено, используя следующее уравнение, где #клетки подразумевает количество клеток приостановить и Vокончательный объем гель создан:
- Гель гидрогеля, смешивая Стоковый раствор kECM гидрогеля с 1 N NaOH, 10 x СМИ дополнение (M199) и клеточной культуры средств массовой информации. Держите все решения на льду.
- Для заполнения устройство культуры нужной ячейки с kECM Гидрогель используйте шприц 1 мл.
- Разрешить гель в 37 градусов за 1 ч до передачи или гальванических клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гидрогель kECM обеспечивает матрицу для культуры клеток почек с аналогичными химический состав как родной почек микроокружения. Для изготовления гидрогеля, почечной ткани коры механически изолированы от всей почек органа и нарезанные кубиками (рис. 1). Decellularization с химическим моющим средством (Рисунок 2а.1-а.3) следуют полоскания с водой для удаления моющего средства частиц (рисунок 2A.4-A.6) дает изолированных почечной коры ECM. Гистологическая оценка подтверждает типичный базальной ламинарные белков, таких как коллаген IV и Ламинин и структурных белков, таких как коллаген-я сохранились, с vitronectin как только отметил исключение (Рисунок 2Б). Кроме того состав белка, включая сохранение изоформ, в ECM по-прежнему соответствует наблюдаемых значений в родной почек ECM (рис. 3). ECM (рис. 4A) механической гомогенизации и лиофилизированном (рис. 4B), затем солюбилизирован производить окончательный kECM гидрогеля (рис. 4 c). Гидрогель kECM появился непрозрачный с небольшим количеством видимых ткани и не был как вязкая, как традиционные коллаген-я гидрогеля. Реологические измерение загущенное kECM в концентрации 15 мг/мл показали комплексный модуль (динамический модуль упругости) около 800 ПА над диапазона линейной деформации значения, значительно больше, чем 7,5 мг/мл коллагена-я (p = 1.602E-14). Нарушения функции почек peritubular микрососудистых эндотелиальных клеток (HKMECs) выращиваются на коллаген-I, kECM и 1:1 смесь гель показали различия в фенотипе, специально в CD31 выражении вокруг ячейки поверхностей и узлов (рис. 5). HKMECs, культивируемых на коллаген-при HKMECs культивировали на двух гели, содержащие kECM отображается сокращение CD31 выражение в неравномерного распределения отображаться форма выражения CD31. Тип матрицы не влияет на высокий PV1 и низкой VWF выражение в HKMECs.
Рисунок 1: изоляция почечной ткани коры. Механическая обработка всей почек органа изолировать ткани коры как базовый материал для kECM гидрогеля. Механическая изоляция начинается с (A) удаление периренальных жировых тканях. Большие куски из жировой ткани можно оторвать от почек с зажим струбцины. Оставшиеся куски жировой ткани могут быть удалены, запустив скальпель против почечной капсулой под углом. (B почечной капсула лучше всего удаляется, сделав мелкий разрез вдоль Улучшенный конце почек и (C) пилинг почечной капсула от основной ткани с зажим струбцины. (D) рассекает почек вдоль оси корональных позволяет для визуализации областей коры и мозгового вещества. (E) изоляции ткани коры лучше всего сделать, вырезая куски ткани мозга с помощью скальпеля. Цвет корковых региона заметно темнее, чем мозговое региона и может быть использован дифференцировать два анатомически различных тканей. Окончательная обработка ткани коры предполагает (F) перетасовки ткани на 0,5 см3 куски для помощи в последующих decellularization. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Decellularization ткани коры. Визуальные и гистологической характеристики decellularized ткани. Submerging (A.1) нарезанные ткани коры в 1% растворе SDS вызывает лизировать клетки и удаление клеточного материала. После (A.2) 1 час и 24 h (а.3), ткани начинает терять цвет, указывающий клеточной материи удаляется. По (а.4) 120 h бланшированные ткани, и остается только ECM. Полоскания с водой (а.5) 24 ч и 120 h (а.6) показывают без видимых изменений в ткани. (B) иммунофлюоресценции окрашивание ткани необработанных и decellularized коры показывает полное удаление клеточной материи и сохранения основных структурных белков (коллаген IV = Col-IV; Ламинин = Лам; фибронектин = FN; сульфат протеогликаны гепарин = HSPG; и vitronectin = VN). Масштаб = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: масс-спектрометрия ткани, decellularized. Анализ decellularized коры ткани по масс-спектрометрии для определения состава белков ECM. Массовая доля измеряются все коэффициенты. (A) структурные и другие белки, связанные с базальной пластинки были представлены с коллагена IV и - я наиболее высоко представляемого. Коллаген-IV (в.1) А1 и А2 цепи, повсеместно в всех подвале мембраны, были сохранены. Коллаген-IV A3 и A5 цепи, присутствует только в подвале мембран glomerulus, были также обнаружены. Общие изоформ (в.2) laminins и коллагена (в.3)-я были также обнаружены. Эта цифра была воспроизводится с разрешения12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Изготовление kECM гидрогеля. Механические и химические обработки ткани decellularized коре дает реальные kECM гидрогеля с достаточной механических свойств после гелеобразования с нейтрализация реагентами. (A) decellularized коры ткань механически гомогенизированные с ткани гомогенизатор, до тех пор, пока остаются без видимых частей ECM. (B грубого порошка был принесли после 3 дней при лиофилизации. (C) солюбилизация HCl и химическое разложение с пепсин в флаконе, Сцинтилляционный привели к работоспособной kECM гидрогеля. Гидрогель был непрозрачным и низкой вязкости. (D) физическая характеристика kECM гидрогеля, после гелеобразования с нейтрализация реагентами. Реологические эксперименты были проведены с системой параллельной пластине диаметром 30 мм. Края образца были защищены с минеральным маслом и грузовая платформа была установлена в 37 градусов. Гидрогель kECM было разрешено лари за 1 ч до начала испытаний. Вязкоупругие свойства геля были измерены с точностью штамм от 0,01 до 20%. Три пробы kECM и коллагена-я были протестированы (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: клетки роста квалификации. Характеристика морфологических различий в HKMECs, выращенных на различные матрицы. Гидрогели были смешаны с нейтрализации реагентов и в 37 градусов 45 мин в формы с открытым лицом полидиметилсилоксана. HKMECs были посеяны на поверхности гели и хранится в культуре за 72 ч до фиксированной и витражи. Immunofluorescent образы HKMECs культивировали в коллагена (A и D) 7,5 мг/мл-я лари; Гель kECM 7,5 мг/мл (B и E); и (C и F) 1:1 смесь гель 7,5 мг/мл. (A-C): красный = CD31; Зеленый = VWF; синий = ядер; шкалы бар = 50 µm. (D-F): красный = F-актина; Зеленый = PV1; синий = ядер; шкалы бар = 50 мкм. Эта цифра была воспроизводится с разрешения12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Матрицы обеспечивают важные механические и химические сигналы, которые регулируют поведение клеток. Синтетические гидрогели способны поддержать комплекс 3-мерной патронирования, но не предоставляют разнообразные внеклеточные сигналы в физиологических матрица микросреды. Гидрогели, производный от родной ECM являются идеальным материалом для в vivo и in vitro исследования. Предыдущие исследования использовали decellularized ECM гидрогели для пальто синтетических биоматериалов для предотвращения хост иммунологических реакций33,34, чтобы дифференцировать стволовые клетки35,,3637 , 38, как субстрат для 2D и мягкие литографии клетки культуры39,40,41,42и в подготовке bioinks для 3-мерного печати43, 44 , 45 , 46. ECM гидрогели обеспечивают клетки с надлежащей сигнализации инициировать адгезии и дальнейшего контроля пролиферации и дифференцировки2,47.
Соотношение и состав основных компонентов ECM, коллагены, laminins, эластин, фибронектин и гликозаминогликанов, сильно зависит от анатомического расположения и функциональность ткани48,49, 50. Хорошо известно, что с помощью неспецифические или неродном ECM-производные гидрогели вызовет неправильное ответы от клетки21,51,52,,5354. В почках ECM состав широко варьируется от анатомических местах1,2. Таким образом, важно проводить различие между регионами, например коры, продолговатого мозга или сосочка до изготовления гидрогели для экспериментального использования.
KECM матрица, изготовленные здесь сохраняет родной почечной коры ECM белка соотношения после decellularization, позволяя при этом гелеобразования физиологически соответствующие механические жесткость3,25,28, 29,30. Сывороточный альбумин, белок плазмы крови, был обнаружен в следовых количествах в ткани decellularized коры, возможно из-за связывания гепарина, который бежал decellularization и полоскания55,56. Хотя пепсина, химическое вещество не носителями в почечной коры ECM, присутствует в решении запасов kECM, он только приходится 2,5% (w/v) загущенное конечного продукта. Кроме того пепсин становится деактивирован с добавлением нейтрализующего реагента решение57.
Гидрогель kECM служит в качестве субстрата, на котором почки кора специфические клетки может быть сохранен в физиологических условиях. Мы показали, что эта матрица может поддерживать рост HKMEC на плоской поверхности. Эти HKMECs поддерживал покоя физиологическое состояние как определено через функциональные анализы, фенотипические выражения и генетических выражение58. Напротив, эти клетки стал активируется когда коллаген-I, матрица компонент коррелирует с фиброз почек, был добавлен в Гидрогель kECM в соотношении 1:159. Для сравнения, когда человека пупочную вену эндотелиальные клетки были культивированный на коллаген-я, они были покоя, и когда смешиваются с kECM, они стали активированы12. Соответственно, коллаген-я как известно, быть неотъемлемым компонентом состава базальной мембраны в пуповине и уменьшается при патологических состояниях, таких как преэклампсия38,60. Эти результаты подчеркивают важность предоставления клетки ткани конкретных подсказки для сохранения покоя, и также как манипулирование окружение ECM может повлиять на гомеостаз.
Важны все шаги в процедуре описано, в то время как несколько этапов решающее значение для обеспечения жизнеспособности сфабрикованные гидрогеля. Степенью гомогенизации decellularized коры ткани будет меняться в зависимости от техники или оборудования, используемого. Важно найти метод, который лучше всего гомогенизировать ткани. Во время солюбилизация рН должна быть сохранена в 3-4 для обеспечения что пепсин активен. При смешивании гидрогеля с нейтрализации реагентов, гель должен быть смешан тщательно и без введения воздушных пузырьков. Если трудно получить однородную смесь, проверьте рН гель решения, чтобы убедиться, что он является нейтральным.
Представитель результаты, представленные в этом методе продемонстрировать, как можно достичь физиологически соответствующей матрицы для изучения в пробирке клеток почек. Decellularized почки кора ECM предоставляет идеальный базовый материал для поддержки роста клеток почек, полученных как ECM белков, которые сохраняются соотношения в окончательном гидрогеля продукт3,25. Загущенное продукта также можно добиться физиологически соответствующие механические свойства28,29,30. Гидрогель kECM позволяет для надлежащего клеток матрица взаимодействия и было показано, чтобы добиться большей физиологических поведение от почечных клеток, чем коллаген-я когда культивированный на плоской поверхности. Кроме того может быть заполнена гидрогеля с почек специфические клетки до гелеобразования для моделирования более физиологически соответствующие 3-мерной среде. В состав гидрогеля kECM также может быть легко манипулировать. Например, смешивание гидрогеля с различное количество коллагена-я до гелеобразования может производить матриц, которые имитируют прогрессивного государства почечной фиброз31,32. Перестройки этой ECM-производные Гидрогель для имитации известных больной ECM композиции заслуживает дальнейшего изучения и даст возможность будущего исследования заболеваний почек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать Линн и Майк Гарви Imaging лаборатории в институте стволовых клеток и регенеративной медицины и LifeCenter Северо-Запада. Они также хотели бы признать финансовой поддержке национальных институтов здравоохранения грантов, TR000504 UH2/UH3 (в. г.) и DP2DK102258 (для ВМФ), NIH T32 обучения Грант DK0007467 (R.J.N.) и неограниченный подарок от почек центров Северо-Запада Научно-исследовательский институт почек.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
- Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
- Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
- Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
- Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
- Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
- Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
- Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
- O'Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
- Streitberger, K. -J., et al.
- Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
- Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
- Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis? Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
- Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved? Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Kim, M. -S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
- Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
- Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
- Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
- Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
- Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials - Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
- Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
- Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D'Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
- Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
- Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
- Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
- Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
- Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
- Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).
