Summary
Qui presentiamo un protocollo per fabbricare un rene corteccia extracellulare derivata matrice idrogel per mantenere la composizione strutturale e biochimica del rene nativo di matrice extracellulare (ECM). Il processo di fabbricazione e le sue applicazioni sono descritte. Infine, una prospettiva sull'utilizzo questo idrogel per supportare la bioingegneria e la rigenerazione cellulare e tessutale del rene-specifici è discussa.
Abstract
Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l'omeostasi del tessuto. Corrente idrogel sintetico offrono robusto supporto meccanico per in vitro colture cellulari ma manca la composizione proteica e ligando necessaria per suscitare fisiologico comportamento dalle cellule. Questo manoscritto descrive un metodo di fabbricazione per un rene corteccia ECM-derivato idrogel con adeguata robustezza meccanica e solidale composizione biochimica. L'idrogel è realizzato meccanicamente omogeneizzazione e solubilizzanti corteccia del rene umano decellularizzati ECM. La matrice mantiene rapporti di proteina di Natale del rene corteccia ECM consentendo anche gelificazione a rigidità meccanica fisiologica. L'idrogel funge da un substrato su cui rene cellule derivate da corteccia possono essere mantenute in condizioni fisiologiche. Inoltre, la composizione di idrogel possa essere manipolata per modellare un ambiente malato che consente lo studio futuro di malattie renali.
Introduction
Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l'omeostasi del tessuto. La composizione molecolare complessa disciplina proprietà strutturali e funzionali del tessuto. Proteine strutturali forniscono cellule con consapevolezza spaziale e permettono di adesione e migrazione1. Associato ligandi interagiscono con recettori di superficie per controllare il comportamento di cella2. Rene ECM contiene una miriade di molecole la cui composizione e la struttura varia a seconda della posizione anatomica, fase inerente allo sviluppo e malattia stato3,4. Ricapitolando la complessità di ECM è un aspetto fondamentale nello Studio in vitrodi cellule derivate dal rene.
I precedenti tentativi di replicare microambienti ECM si sono concentrati sul tessuto decellularizing tutto per creare impalcature in grado di ricellularizzazione. Decellularizzazione è stata eseguita con detergenti chimici come sodio dodecil solfato (SDS) o detergenti non ionici, e utilizza sia organo intero aspersione o immersione e agitazione metodi5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. I ponteggi presentati qui preservare gli spunti strutturali e biochimici trovati in tessuto nativo ECM; Inoltre, ricellularizzazione con cellule del donatore-specific ha rilevanza clinica in chirurgia ricostruttiva14,15,16,17,18, 19. Tuttavia, queste impalcature mancano di flessibilità strutturale e pertanto non sono compatibili con molti dispositivi a corrente utilizzati per gli studi in vitro . Per ovviare a questa limitazione, molti gruppi hanno ulteriormente elaborato decellularizzati ECM in idrogel20,21,22,23,24. Questi idrogeli sono compatibili con bioink e stampaggio ad iniezione ed eludere micrometro scala spaziale i vincoli che decellularized ponteggi posto sulle cellule. Inoltre, composizione molecolare e rapporti trovati in nativo ECM vengono mantenuti3,25. Qui dimostriamo un metodo per fabbricare un idrogel derivato dalla corteccia del rene ECM (kECM).
Lo scopo del presente protocollo è quello di produrre un idrogel che replica il microambiente della regione corticale del rene. Tessuto del rene corteccia è decellularized in una soluzione di SDS 1% sotto costante agitazione per rimuovere la materia cellulare. SDS è comunemente usato per decellularize del tessuto a causa della sua capacità di rimuovere rapidamente immunologici cellulari materiale6,7,9,26. Il kECM è quindi soggetto a omogeneizzazione meccanica e liofilizzazione5,6,9,11,26. Solubilizzazione in un acido forte con pepsina si traduce in un finale idrogel soluzione stock20,27. KECM nativo di proteine che sono importanti per strutturale supportano e segnale di trasduzione sono conservate3,25. L'idrogel può anche essere gelificato all'interno di un ordine di grandezza di Natale del rene umano corteccia28,29,30. Questa matrice fornisce un ambiente fisiologico che è stato utilizzato per mantenere la quiescenza delle cellule del rene-specifici rispetto a idrogeli da altre proteine della matrice. Inoltre, composizione di matrice possa essere manipolati, ad esempio, attraverso l'aggiunta di collagene-I, per ambienti di malattia di modello per lo studio della fibrosi renale ed altri malattie di rene31,32.
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Protocol
Reni umani sono stati isolati da LifeCenter Northwest seguendo linee guida etiche impostate per l'associazione delle organizzazioni di approvvigionamento dell'organo. Questo protocollo segue animale linee guida cultura cura e cella delineate dalla Università di Washington.
1. preparazione del tessuto del rene umano
- Preparazione della soluzione di decellularizzazione
- Sterilizzare un becher da mL 5000 e un ancoretta 70 x 10 mm.
- Mescolare 1: 1000 (peso: volume) sodio dodecil solfato (SDS) in acqua deionizzata in autoclave nel becher. Lasciare la soluzione su un piatto di mescolare a circa 200 rpm per 24 ore o fino a quando la SDS è completamente sciolto.
Nota: In genere, 2500 mL di soluzione 1% SDS è sufficiente per decellularize un singolo rene umano. - Trasferire la soluzione in un filtro vuoto sterile da 500 mL e filtrarlo in contenitori sigillabili sterilizzati.
- Elaborazione del tessuto del rene
- Lavaggio ed autoclave un paio di pinze, pinza emostatica due morsetti, un paio di forbici di grado di servizio generale, due manici per bisturi lama, un becher da 1000 mL coperto con foglio di alluminio e un ancoretta 36 x 9 mm.
- Una cappa di coltura del tessuto con underpad la linea. Posizionare il bicchiere, un piatto di sterili per coltura (150 x 25 mm) e l'organo intero rene nel cofano. Riempire il becher con 500 mL di soluzione 1% SDS.
Nota: I reni umani sono stati ricevuti sul ghiaccio da LifeCenter NorthWest. - Riporre il rene nel piatto sterile coltura tissutale (Figura 1A). Rimuovere tutto il grasso perirenale radendosi leggermente intorno alla capsula renale con un bisturi (Figura 1B).
- Fare un'incisione superficiale 8-10 cm con il bisturi, appena abbastanza in profondità per rompere la capsula renale senza danneggiare il tessuto sottostante di corteccia, attraverso l'estremità superiore del rene. Rimuovere la capsula renale da peeling lontano il tessuto di corteccia con due pinze pinza emostatica (Figura 1).
- Bisecare il rene lungo il piano corona utilizzando il bisturi lungo il lato laterale del rene (Figura 1). Isolare il tessuto di corteccia da entrambe le metà di ritagliarsi la regione midollare con il bisturi (Figura 1E) e tagliare a dadini il tessuto di corteccia in pezzi di cm 0,53 (Figura 1F). Rimuovere qualsiasi grandi vasi visibili.
- Isolamento della matrice extracellulare
- In una cappa di coltura del tessuto, riempire un bicchiere da 1000 mL con 500 mL di soluzione 1% SDS. Posizionare la barra di tessuto e mescolate a dadini corteccia nel becher contenente la soluzione di SDS. Coprire il becher con un foglio di alluminio in autoclave e metterlo su un piatto di mescolare a circa 400 giri esterno della cappa di coltura del tessuto.
- Dopo il tessuto di corteccia è stato sulla piastra stir per 24 h, portare il becher in un cappuccio di coltura del tessuto e aggiungere un filtro sterile cella 40 µm realizzato con maglia di nylon. Riempire un becher da mL 1000 separata con 200 mL di candeggina e collocarlo nella cappa di coltura del tessuto.
- Dispensare la soluzione SDS attraverso il filtro delle cellule nel becher contenente candeggina. Pipettare fuori tutta la soluzione SDS finché non solo tessuti decellularizzati e del filtro cella rimangono nel becher.
Nota: Il filtro cella deve evitare qualsiasi tessuto da essere rimosso durante l'aspirazione di soluzione. - Lasciare il filtro cella nel becher e riempire con 500 mL di soluzione fresca di SDS. Coprire il becher con la stessa carta stagnola e mettere in un piatto mescolare alla stessa velocità come prima.
- Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.3 ogni 24 ore con soluzione fresca di SDS per un totale di cinque giorni.
- Sciacquare il tessuto decellularizzato con autoclave DI acqua ogni 24 ore, per un totale di 3 giorni, seguendo la tecnica descritta nella procedura 1.3.1-1.3.3.
- Sciacquare decellularizzato tessuto con acqua di grado di cultura cellulare ogni 24 h per totale di 2 giorni, seguendo la tecnica descritta nella procedura 1.3.1-1.3.3.
- Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.2. Trasferire il tessuto decellularizzato (denominato kECM da questo punto in su) in un 30 mL self standing e tubo conico e riempirlo con acqua di grado di cultura cellulare fino a quando tutto il tessuto è sommerso.
2. fabbricazione di soluzione Stock di idrogel
- Lavorazione meccanica del tessuto decellularizzato
- In una cappa di coltura del tessuto, omogeneizzare meccanicamente il kECM all'interno del tubo conico con un omogeneizzatore del tessuto per 2 min.
Nota: KECM omogeneizzato dovrebbe assomigliare ad una soluzione opaca senza le parti visibili di ECM. - Immergere il tubo conico contenente il kECM in azoto liquido fino a quando non è più bollente che circonda il tubo persiste. Conservare il kECM a-4 ˚ c durante la notte.
- In una cappa di coltura del tessuto, omogeneizzare meccanicamente il kECM all'interno del tubo conico con un omogeneizzatore del tessuto per 2 min.
- Liofilizzazione del tessuto congelato decellularizzato
- Allentare leggermente il tappo del tubo conico per consentire lo scambio di gas e posizionare il tubo in una macchina di liofilizzazione. Lyophilize la kECM per tre giorni o fino a che assomiglia ad una polvere bianca fine. Archivio a-4 ˚ c.
- Digestione chimica e solubilizzazione di gel
- Autoclave una fiala di scintillazione 20ml e tappo, un ancoretta 15,9 x 7,9 mm e un paio di belle-punta forcipe.
- Pesare il kECM liofilizzato e calcolare il volume di HCl e massa di pepsina necessaria per solubilizzare il kECM per una soluzione di 3% (30 mg/mL) utilizzando le seguenti equazioni, dove mpepsina è la massa di pepsina, tessuto di m è la massa del tessuto liofilizzato e VHCl è il volume di 0.01 N HCl:
- In una cappa di coltura del tessuto, aggiungere l'ancoretta, 0.01 N HCl e pepsina gastrica suina nella fiala di scintillazione e lasciarlo su una zolla di mescolare a circa 500 giri/min fino a sciolta tutti la pepsina. Trasferire la kECM liofilizzato nel flaconcino di scintillazione e lasciare la soluzione su un piatto di mescolare a circa 500 giri/min per tre giorni.
3. idrogel gelificazione
- Preparazione di idrogel di rene ECM
- Gel l'idrogel mescolando la soluzione madre di idrogel di kECM con 1 N NaOH, 10 x Media supplemento (M199) e terreni di coltura delle cellule. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio.
Nota: Le concentrazioni di gel finale di 7,5 mg/mL sono state utilizzate per la coltura cellulare. 1 mL di gel di kECM era sufficiente per esperimenti di coltura cellulare presentati. - Determinare il volume di lavorabile kECM gel prodotto e volume di stock kECM idrogel necessari utilizzando l'equazione seguente, dove Vfinale è il volume del gel creato, VkECM stock è il volume di idrogel di stock kECM necessario, Cstock kECM è la concentrazione dell'idrogel di stock kECM e Cfinale è la concentrazione del gel finale:
- Determinare il volume dei reagenti necessari utilizzando le seguenti equazioni, dove VNaOH è il volume di 1 N NaOH di neutralizzazione, V10 X è il volume di M199 supplemento 10 X media, e V1 X è la volume di terreno di coltura delle cellule:
- In una cappa di coltura del tessuto, dispensare i reagenti neutralizzanti (NaOH, M199 e terreni di coltura delle cellule) in una sterile 30ml self standing e tubo conico. Miscelare la soluzione di reagente neutralizzante con un microspatula.
- Utilizzare una siringa sterile da 1 mL per trasferire il volume appropriato di stock kECM idrogel per la soluzione di reagente neutralizzante. Utilizzare un microspatula per miscelare la soluzione fino ad ottenuta un impasto omogeneo in soluzione di idrogel di colore.
Nota: Evitare di introdurre bolle d'aria mescolando lentamente e delicatamente. - Per incorporare le cellule nell'idrogel di kECM, sottrarre 10 µ l di terreno di coltura cellulare (V1 X) i calcoli di volume di soluzione neutralizzante nel passaggio 3.1.1.3.
- Sospendere le cellule in 10 µ l di terreno di coltura delle cellule. Determinare il numero di cellule in sospensione utilizzando l'equazione seguente, dove #cellule implica il numero delle cellule di sospendere efinale V è il volume del gel creato:
Nota: 300.000 cellule/mL è la concentrazione di celle utilizzate nel gel kECM. - Pipettare i 10 µ l di soluzione di cella sospesa in gel kECM finale dopo la soluzione di riserva di kECM è stata mescolata con soluzione di reagente neutralizzante. Agitare la soluzione con un microspatula fino a quando le cellule sono distribuite uniformemente.
- Sospendere le cellule in 10 µ l di terreno di coltura delle cellule. Determinare il numero di cellule in sospensione utilizzando l'equazione seguente, dove #cellule implica il numero delle cellule di sospendere efinale V è il volume del gel creato:
- Gel l'idrogel mescolando la soluzione madre di idrogel di kECM con 1 N NaOH, 10 x Media supplemento (M199) e terreni di coltura delle cellule. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio.
- Utilizzare una siringa da 1 mL per riempire un cella desiderata cultura dispositivo con l'idrogel di kECM.
- Lasciare che il gel impostare a 37 ˚ c per 1 h prima di trasferire o cellule di placcatura.
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Representative Results
L'idrogel di kECM fornisce una matrice per la coltura delle cellule del rene con composizione chimica simile come il microambiente di Natale del rene. Per fabbricare l'idrogel, tessuto del rene corteccia è meccanicamente isolato da un organo rene intero e tagliato a dadini (Figura 1). Decellularizzati con un detersivo chimico (Figura 2A.1-a. 3) seguito da risciacqui con acqua per rimuovere le particelle di detersivo (Figura 2A.,4-6) produce ECM corteccia renale isolata. La valutazione istologica conferma tipiche basale laminare proteine come le proteine del collagene IV e laminina e strutturali come il collagene-è conservato con vitronectina come l'unico osservato eccezione (Figura 2B). Inoltre, la composizione proteica, inclusa la conservazione delle isoforme, in ECM rimane coerente con i valori osservati nel rene nativo ECM (Figura 3). L'ECM (Figura 4A) è omogeneizzato meccanicamente e liofilizzato (Figura 4B) poi solubilizzato per produrre l'idrogel di kECM finale (Figura 4). L'idrogel di kECM apparso opaco con piccole quantità di tessuto visibile e non era più viscosi come collagene tradizionale-ho idrogel. Misura reologica di gelificato kECM ad una concentrazione di 15 mg/mL ha rivelato un modulo complesso (modulo elastico dinamico) di circa 800 Pa sopra la gamma lineare di ceppo valori, significativamente superiore a quella del collagene di 7,5 mg/mL-mi (p = 1.602E-14). Rene umano peritubular cellule endoteliali microvascolari (HKMECs) coltivate sul collagene-I, kECM e un gel di miscela 1:1 hanno mostrato differenze nel fenotipo, in particolare nell'espressione di CD31 intorno superfici delle cellule e giunzioni (Figura 5). HKMECs coltivate sul collagene-visualizzato uniforme CD31 espressione mentre HKMECs coltivate sui due gel contenenti kECM visualizzata ridotta espressione di CD31 in distribuzioni irregolari. Tipo di matrice non sembrano influenzare il PV1 alta e bassa espressione di sindrome di Raynaud nella HKMECs.
Figura 1: isolamento del tessuto del rene corteccia. Lavorazione meccanica di un organo intero rene per isolare il tessuto di corteccia come materiale di base per l'idrogel di kECM. Isolamento meccanico inizia con (A) la rimozione del tessuto adiposo perirenale. Grandi pezzi di tessuto adiposo possono essere strappate dal rene con morsetti a pinza emostatica. Restanti pezzi di tessuto adiposo può essere rimosso mediante l'esecuzione di un bisturi contro la capsula renale ad un angolo. (B) la capsula renale è meglio rimosso praticando un'incisione superficiale lungo l'estremità superiore del rene e (C) peeling la capsula renale dal tessuto di fondo con morsetti a pinza emostatica. (D) che attraversano il rene lungo l'asse corona consente la visualizzazione delle regioni corteccia e midollo. (E) isolamento del tessuto corteccia è fatto meglio ritagliando pezzi di tessuto del midollo con un bisturi. Il colore della regione corticale è notevolmente più scuro di quello della regione midollare e può essere usato differenziare i due tessuti anatomicamente distinti. L'elaborazione finale del tessuto corteccia coinvolge (F) per tagliare a dadini il tessuto in pezzi di3 0,5 cm per facilitare la successiva decellularizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: decellularizzazione di tessuto corteccia. Caratterizzazione visiva e istologico del tessuto decellularizzato. Submerging (a. 1) a dadini tessuto corteccia in soluzione all'1% SDS provoca la lisi delle cellule e la rimozione del materiale cellulare. Dopo (a. 2) 1 h e (a. 3) 24 ore, il tessuto comincia a perdere il colore, indicando materia cellulare sta per essere rimosso. Di (a. 4) 120 h il tessuto viene sbollentato e rimane solo l'ECM. Risciacqui con acqua a (a. 5) 24 h e a. (6) 120 h non visualizza nessun cambiamento visibile al tessuto. (B) immunofluorescenza colorazione del tessuto non trattato e decellularizzati corteccia rivela vicino a rimozione completa della materia cellulare e conservazione delle principali proteine strutturali (collagene IV = Col-IV; laminina = LAM; fibronectina = FN; eparina solfato proteoglicani = HSPG; e vitronectina = VN). Scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: spettroscopia di massa di tessuto decellularizzato. Analisi del tessuto corteccia decellularizzati mediante spettrometria di massa per determinare la composizione proteica di ECM. Tutti i rapporti sono misurati come percentuale di massa. (A) strutturali e altre proteine associate con la lamina basale erano presenti con collagene-IV e - ho rappresentato il più altamente. Catene di collagene-IV (b. 1) A1 e A2, onnipresente in tutte le membrane dello scantinato, furono conservate. Catene di collagene IV A3 e A5, presente solo nelle membrane dello scantinato del glomerulo, inoltre sono state rilevate. (B. 2) isoforme comuni di laminine e collagene (b. 3)-io fossi anche rilevato. Questa figura è stata riprodotta con permesso12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: fabbricazione di idrogel kECM. Trattamenti chimici e meccanici del tessuto decellularizzati corteccia produce un idrogel kECM realizzabile con sufficiente proprietà meccaniche dopo la gelificazione con reagenti di neutralizzazione. (A) decellularizzati corteccia tessuto è omogeneizzato meccanicamente con un omogeneizzatore del tessuto fino a quando non rimangono frammenti visibili di ECM. (B) una polvere grossolana è stato ceduto dopo 3 giorni sotto liofilizzazione. (C) solubilizzazione in HCl e digestione chimica con pepsina in un flaconcino di scintillazione è provocato da un idrogel lavorabile kECM. L'idrogel era opaco e una bassa viscosità. (D) caratterizzazione fisica dell'idrogel di kECM dopo la gelificazione con reagenti di neutralizzazione. Reologici esperimenti sono stati eseguiti con un sistema di piastra parallela diametro 30 mm. I bordi di campione sono stati protetti con olio minerale e il pianale di carico è stato impostato a 37 ˚ c. L'idrogel di kECM è stato permesso di gel per 1 h prima del test. Proprietà viscoelastiche del gel sono stati misurati con una spazzata di ceppo tra 0,01 al 20%. Tre campioni di kECM e di collagene-io fossi testato (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cell caratterizzazione crescita. Caratterizzazione delle differenze morfologiche in HKMECs coltivate su matrici differenti. Idrogeli erano mescolati con i reagenti di neutralizzazione e impostare a 37 ˚ c per 45 min in open-faced polidimetilsilossano stampi. HKMECs erano teste di serie sulla superficie del gel e tenute in coltura per 72 h prima di essere fissato e macchiato. Immunofluorescente immagini di HKMECs coltivate in collagene di 7,5 mg/mL (A e D)-mi gel; Gel di kECM 7,5 mg/mL (B ed E); e gel di miscela 1:1 di 7,5 mg/mL (C e F). (A-C): rosso = CD31; verde = sindrome di Raynaud; blu = nuclei; barra della scala = 50 µm. (D-F): rosso = F-actina; verde = PV1; blu = nuclei; barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata riprodotta con permesso12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Matrici di forniscono importanti indicazioni meccaniche e chimiche che governano il comportamento delle cellule. Idrogeli sintetici sono in grado di supportare complesse patterning 3-dimensionale, ma non riescono a fornire i diversi segnali extracellulari trovati in microambienti matrice fisiologica. Idrogel derivato dal nativo ECM sono materiali ideali per studi sia in vivo che in vitro . Precedenti studi hanno utilizzato decellularizzati ECM idrogeli per rivestire biomateriali sintetici per evitare33,risposte immunologiche host34, differenziare cellule staminali35,36,37 , 38, come substrato per Litografia 2D e morbido cella cultura39,40,41,42e in preparazione di bioinks per stampa 3-dimensionale43, 44 , 45 , 46. ECM idrogeli forniscono cellule con segnalazione adeguata per avviare adesione nonché controllare ulteriormente la proliferazione e differenziazione2,47.
I rapporti e la composizione dei principali componenti della ECM, quali collagene, laminine, elastina, fibronectina e glicosaminoglicani, sono altamente dipendente sulla posizione anatomica e la funzionalità del tessuto48,49, 50. È assodato che utilizzando aspecifici o stati idrogeli ECM-derivato di suscitare risposte improprie da cellule21,51,52,53,54. Nel rene, ECM composizione varia ampiamente tra localizzazioni anatomiche1,2. Pertanto, è importante differenziare tra regioni, come la corteccia, midollo o papilla prima di fabbricare idrogel per uso sperimentale.
La matrice di kECM fabbricata qui conserva rapporti di proteina di Natale del rene corteccia ECM seguendo decellularizzazione consentendo anche gelificazione a una rigidità meccanica fisiologicamente rilevanti3,25,28, 29,30. Albumina, una proteina del plasma sanguigno, è stato rilevato in tracce all'interno del tessuto di corteccia decellularizzati, probabilmente a causa di associazione all'eparina che sfuggito decellularizzazione e risciacquo55,56. Anche se pepsina, un prodotto chimico non-nativi di ECM di corteccia del rene, è presente nella soluzione stock kECM, rappresenta solo 2,5% (p/v) del prodotto finale gelificato. Inoltre, pepsina diventa disattivata con l'aggiunta di reagenti soluzione neutralizzante57.
L'idrogel di kECM funge da un substrato su cui le cellule del rene corteccia specifiche possono essere mantenute in condizioni fisiologiche. Abbiamo dimostrato che questa matrice possa sostenere la crescita di HKMEC su una superficie planare. Questi HKMECs mantenuto uno stato quiescente fisiologico come determinato tramite saggi funzionali, espressione fenotipica e genetica espressione58. Al contrario, queste cellule sono diventato attivati quando collagene-I, un componente della tabella correlata con fibrosi del rene, è stata aggiunta l'idrogel di kECM a un rapporto 1:159. In confronto, quando le cellule endoteliali di vena ombelicale umana sono state coltivate su collagene-I, erano quiescenti, e quando mescolato con kECM sono diventato attivato12. Di conseguenza, collagene-ho è noto per essere una parte integrante della composizione della membrana dello scantinato all'interno il cordone ombelicale ed è diminuito sotto stati patologici quali preeclampsia38,60. Questi risultati evidenziano l'importanza di fornire alle cellule tessuto-specifici spunti per mantenere la quiescenza e anche come manipolazione del milieu ECM può influenzare l'omeostasi.
Considerando che tutti i passaggi della procedura delineata sono importanti, sono fondamentali per garantire la vitalità dell'idrogel fabbricati diversi passaggi. Il grado di omogeneizzazione del tessuto corteccia decellularizzati varierà basato sulla tecnica o attrezzature utilizzate. È importante trovare una tecnica che sarà meglio omogeneizzare il tessuto. Durante la solubilizzazione, il pH dovrebbe essere tenuto a 3-4 per garantire che la pepsina è attiva. Quando si miscela l'idrogel con reagenti di neutralizzazione, il gel deve essere miscelato accuratamente e senza l'introduzione di bolle d'aria. Se una miscela uniforme è difficile da ottenere, controllare il pH della soluzione gel per garantire che è neutro.
I risultati rappresentativi presentati in questo metodo dimostrano come si possa ottenere una matrice fisiologicamente rilevante per lo Studio in vitro delle cellule del rene. Decellularizzati rene corteccia ECM fornisce un materiale di base ideale per sostenere la crescita delle cellule del rene-derivato come proteina di ECM sono conservati i rapporti in idrogel finale prodotto3,25. Il prodotto gelificato può anche raggiungere fisiologicamente rilevanti proprietà meccaniche28,29,30. L'idrogel di kECM consente interazioni cellula-matrice corretta e ha dimostrato di suscitare maggiore comportamento fisiologico da cellule di rene di collagene-io quando coltivate su una superficie planare. Inoltre, l'idrogel possono essere seminati con cellule di rene-specifiche prima della gelificazione per modellare un ambiente 3-dimensionale più fisiologicamente rilevante. La composizione dell'idrogel di kECM possa anche essere facilmente manipolata. Ad esempio, mescolando l'idrogel con diverse quantità di collagene-prima della gelificazione potrei produrre matrici che imitano gli stati progressivi di fibrosi renale31,32. L'accordabilità di questo idrogel ECM-derivati per simulare composizioni note di ECM malate autorizza l'indagine successiva e consentirà lo studio futuro di malattie renali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori si desidera ringraziare la Lynn e Mike Garvey Imaging laboratorio presso l'Istituto per le cellule staminali e medicina rigenerativa e LifeCenter NorthWest. Vorrebbero anche riconoscere il sostegno finanziario di sovvenzioni National Institutes of Health, UH2/UH3 TR000504 (di J.H.) e DP2DK102258 (per Y.Z.), NIH T32 formazione grant DK0007467 (per R.J.N.) e un regalo senza restrizione dai centri nord-ovest del rene per la Istituto di ricerca del rene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
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