Summary
Desenvolvemos e descrever um protocolo baseado no conceito de fiação úmida, para a construção de biomateriais baseados em gelatina, usada para a aplicação da engenharia de tecidos.
Abstract
Este artigo apresenta um método de baixo custo para fabricar gelatina, como um polímero natural, em fibras monofilamento ou outras formas adequadas. Através da fiação método molhado, fibras de gelatina são fabricadas por extrusão suave em um meio adequado de coagulação. Para aumentar a superfície funcional destas fibras de gelatina e sua capacidade de imitar as características dos tecidos, a gelatina pode ser moldada em forma de tubo referindo-se a este conceito. Examinado por testes in vitro e in vivo, os tubos de gelatina demonstram um grande potencial para aplicação em engenharia de tecidos. Atuando como um material de enchimento adequado lacuna, gelatina de tubos podem ser usados para substituir o tecido na área danificada (por exemplo, no sistema nervoso ou cardiovascular), bem como a promover a revitalização, fornecendo uma substituição direta de células-tronco e circuitos neurais. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para a criação de um biomaterial, baseado em um polímero natural, e sua implementação deverá beneficiar muito o desenvolvimento de polímeros naturais correlativos, que ajudam a perceber as estratégias de regeneração do tecido.
Introduction
O mais recente desenvolvimento na regeneração de tecidos envolve a aplicação de engenharia de tecidos, o que representa um desafio para a melhoria de novas estratégias terapêuticas em tratamentos médicos. Por exemplo, o limitado potencial de regeneração do sistema nervoso, seguir lesão ou doença, coloca um problema de saúde significativo em todo o mundo. Devido à complexidade dos processos fisiopatológicos associados com o sistema nervoso, o uso de auto-enxerto tradicional ou a execução de cirurgia de estabilização tem sido mostrada para oferecer benefícios em termos de resultados funcionais, mas não há nenhuma evidência forte para os efeitos de fixação da coluna vertebral, cirurgia1,2. O tecido na área danificada é perdido e substituído com astrócitos hypertrophically induzido3, eventualmente formando uma densa cicatriz glial4,5. Esta matriz age como uma barreira que bloqueia a recuperação do nervo função6,7 e é, assim, dificulta grandemente regeneração. Portanto, espera-se um material de abertura de enchimento adequado para evitar a perda de tecido e reduzir a formação de cicatriz-associado do tecido conjuntivo, mantendo a integridade da área danificada, bem como fornecendo a substituição direta de células neurais e circuitos para promover a regeneração do axônio.
Biomateriais poliméricos tem sido preferidos como andaimes para a terapia de regeneração de tecido, baseado na regulamentação da progressão de comportamento e o tecido celular ou axônio através de suporte natural da matriz extracelular (ECM). O formato da fibra é comumente considerado como um bloco de construção para vários materiais, devido à sua estrutura unidimensional8. As fibras geralmente podem ser obtidas por extrusão de derretimento ou molhado girando o método; no entanto, o grande tamanho e custo do equipamento e a dificuldade para realizar esses métodos são desafiadores. Além disso, a maioria dos trabalhos relacionados com fibras de polímero tem sido focada em materiais sintéticos ou compostos. Polímeros naturais como fonte de biomaterial oferecem melhor biocompatibilidade Propriedades, para o corpo humano. No entanto, para obter o alinhamento das fibras de polímero natural é relativamente mais difícil do que de polímero sintético fontes9. Portanto, a conversão de um polímero natural, como uma rica fonte de proteína em fibras biomaterial é uma importante estratégia — não somente as fibras do biomaterial podem ser diretamente isolado da matéria-prima, evitando assim uma transformação desnecessária de monômeros, mas o fibras de proteínas também têm uma boa aparência e características favoráveis10.
A este respeito, nós descrevemos um método de baixo custo de processamento para a fabricação de fibras de polímero natural através do conceito básico de fiação úmida, que pode ser implementada na escala de laboratório para a engenharia de tecidos. Fiação úmida é executada pela extrusão e coagulação de uma solução de polímero em um nonsolvent de polímero apropriado. Uma solução adequada, viscous dopada em meio de coagulação faz com que as moléculas de polímero dissolver. Durante a transição de fase, os filamentos então perdem sua solubilidade e são precipitados sob a forma de um polímero sólido fase11. Referindo-se a este conceito, então ampliamos o desenvolvimento de gelatina para a forma de tubo por um processo de moldagem, que é considerado adequado para a aplicação de regeneração do tecido. Além disso, intrinsecamente, podemos também desenvolver qualquer forma de material de fibras de gelatina (por exemplo, canalização de gelatina enrolado de várias fibras de gelatina), para outro desejado aplicações.
Gelatina, um polímero natural e biodegradável, é formada por colágeno hidrolisado e desnaturado, incluindo qualquer estado helicoidal semicrystalline, amorfo ou triplo de colágeno12. É sabido que o colágeno é a proteína estrutural essencial em todos os tecidos conjuntivos de vertebrados e invertebrados13,14, que é semelhante à estrutura da proteína do ECM principal que induz o crescimento do nervo e, simultaneamente, substitui uma grande quantidade de glicosaminoglicano secretada durante lesões na medula espinhal. Portanto, o uso da gelatina como uma fonte seria uma ótima escolha para qualquer veículo a médica. Além de ser uma fonte de baixo custo, a gelatina também é biodegradável e cytocompatible e clinicamente provado ser um temporário defeito de enchimento15. Desenvolvido em forma de tubo,, testes in vitro e in vivo, descritos aqui demonstram que a gelatina tem um excelente biocompatibilidade e adequação do tecido futura aplicações de engenharia. Cultivadas com células-tronco adiposas humanas, tubos de gelatina melhoram a diferenciação de célula em células progenitoras neurais usando positivo nestin coloração como um marcador de células nervosas. Além disso, gelatina como enchimento material de lacuna, como produzido pelo método estabelecido neste estudo, é esperada para ser seguro e gerenciável e beneficiar muito engenheiros de tecido que estão actualmente a desenvolver polímeros naturais correlativos ao reforço de tecido estratégias de regeneração.
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Protocol
Os tecidos gordos foram obtidos em cirurgias ortopédicas como certificada pelo institucional Review Board do Tri-serviço geral Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal nacional Centro médico de defesa, Taiwan (R.O.C).
1. Umedeça girando o processo
-
Preparação da solução
- Dissolva 5 g de gelatina em pó em 100 mL de água bidestilada para obter a concentração da solução de 5% (p/v).
- Agite a mistura lentamente a 60-70 ° C durante a noite para conseguir uma dispersão homogênea completamente sem quaisquer bolhas.
-
Molhar a fiação
- Formação das fibras
Nota: Um esquema do método é mostrado na Figura 1A. A instalação da fiação está equipada com uma máquina de bomba peristáltica (ver Tabela de materiais) que fornece alta precisão velocidade e controla a entrega Lisa do fluxo.- Conecte uma seringa de 26 x 1/2 polegada (0,45 x 12 mm) como o injetor de solução tubo de vinil clara.
- Prepare 100 mL de solução de acetona 99,5% em um copo de béquer deve ser usado como banho de coagulação.
- Executar a máquina de bomba peristáltica em 21 rpm (3,25 mL/min) e deixe a solução de gelatina descansar por alguns segundos numa solução de acetona antes de enrolar.
- Retire as fibras de gelatina a partir da solução de acetona e mergulhe-os em 2,5% (p/v) de solução de diclorometano/policaprolactona (PCL/DCM) com 01:20 (w/w).
- Deixe a gelatina de fibras na solução PCL/DCM seca durante a noite, sob o capô à temperatura ambiente.
- Formação do tubo
Nota: Um esquema do método é mostrado na Figura 1B.- Use um cateter venoso periférico de 24 x 3/4 de polegada (0,7 x 19 mm) como molde do tubo.
- Carregar o cateter para a solução de gelatina e segurá-la lá por 3 s.
- Carregar o cateter para a solução de acetona e segure por 1 min.
- Carregar o cateter novamente para a solução de gelatina e segurá-la lá por 3 s.
- Repita este procedimento alternativo de 20x.
- Retire o cateter a partir da solução de acetona e deixe o tubo moldado secar à temperatura ambiente por 5 min.
- Suavemente retire o tubo de gelatina do cateter, usando uma pinça hemostática e transferir cuidadosamente o tubo de gelatina em um copo de pipetas com a imersão de 2,5% (p/v) da solução de PCL/DCM.
- Deixe a pipeta Pasteur contendo que o tubo de gelatina e solução PCL/DCM seca durante a noite, sob o capô à temperatura ambiente.
- Formação das fibras
2. morfologia do tubo gelatina
- Monte o pedaço de tubo de gelatina secas em um esboço de carbono.
- Colocar a amostra na máquina íon sputter coater (ver Tabela de materiais) e revestir a amostra com ouro por 60 s; em seguida, observar sua morfologia por microscopia eletrônica (ver Tabela de materiais).
3. cultura de células-tronco adiposas humana
- Coloque os tecidos gordos (obtidos de tecido adiposo oral por cirurgia clínica) em uma placa de Petri contendo 10 mL de solução de transferência consiste em 0.1 M tampão fosfato salino (PBS), 1% penicilina/estreptomicina e 0,1% de glicose.
- Corte os tecidos em pedaços pequenos (menos de 1 mm2) com uma lâmina de bisturi.
- Transferi os tecidos em um tubo plástico de 15 mL e centrifugar 500 x g por 5 min.
- Remover o sobrenadante e incubar o sedimento em um tubo de plástico contendo 10 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM, consistindo de 4 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e vermelho de fenol de 15 mg/L) com colagenase de 0,1% a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% CO2, por 1 dia.
- Centrifugar o tubo plástico a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante cuidadosamente (não toque o sedimento) e então, suspender o sedimento suavemente pela adição de 10 mL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e deixe 1 dia a 37 ° C , em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO2.
- Centrifugar o tubo plástico a 500 x g por 5 min e descartar o sobrenadante cuidadosamente; em seguida, adicione 1 mL de meio de células-tronco (composto de queratinócitos soro livre médio (K-SFM), 5% de FBS, N-acetil-L-cisteína, ácido ascórbico-2-fosfato, estreptomicina e anfotericina) para suspender o sedimento, transferi-lo para um balão de cultura T25 contendo 4 mL de meio de célula-tronco e deixá-lo ficar por 3 dias a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO2.
- Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL de ácido de 0,25% do trypsin-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-incubar a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo ar de 95% e 5% de CO2 para 3,5 min, para separar as células da parte inferior do recipiente de cultura.
- Adicionar 1 mL de FBS, suspender a mistura e transfira para um tubo de microcentrifugadora.
- Centrifugar a suspensão de 500 x g durante 3,5 minutos, suspender o sedimento com 1 mL de meio de células-tronco e transferi-lo para o frasco de cultura contendo 5 mL de meio de células-tronco; em seguida, mantê-lo a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% de CO2.
- Manter a subcultura, alterando o meio de células-tronco em 3 dias.
4. cultivo de células do tubo de gelatina
- Esterilizar o tubo de gelatina com luz UV para 2h; em seguida, mergulhe-a em 75% (v/v) de etanol e lavá-lo 2 x com média de células-tronco para remover o etanol residual.
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Colete as células-tronco adiposas humanas (hASCs) do frasco de cultura.
- Retire o meio do frasco de cultura.
- Adicione 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% CO2 para 3,5 min, para desanexar o hASCs do fundo do balão de cultura.
- Adicionar 1 mL de FBS, suspender a mistura e transfira para um tubo de microcentrifugadora.
- Centrifugar o tubo microcentrifuga a 500 x g durante 3,5 min; em seguida, descartar o sobrenadante, cuidadosamente e suspender o sedimento com 1 mL de meio de células-tronco.
- Coloque o tubo de gelatina em uma placa de 6 contendo 3 mL do meio de células-tronco e semente 4 x 104 de hASCs para o tubo; Incube-os por 2 semanas a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO2.
- Altere o meio de células-tronco em 3 dias para fornecer a nutrição suficiente para crescimento celular.
5. imunocitoquímica
- Retire o meio de células-tronco e lave o poço com PBS.
- Fixe o tubo com células com 0,1% de ácido acético glacial por 30 min à temperatura ambiente.
- Lave bem 2 x com PBS.
- Adicionar um surfactante (NP-40, 0.05%) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Lave-o bem 3x com PBS.
- Adicionar 2% de soro de cabra normal e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
- Decantar a solução, adicionar o anticorpo primário nestin (marcador de células progenitoras neurais) e incubar durante a noite a 4 ° C.
- Lave-o bem 3x com PBS.
- Adicione o anticorpo secundário burro isotiocianato de anti-mouse-fluoresceína (FITC) e manter a amostra no escuro por 2 h.
- Lave-o bem 3x com PBS.
- Adicione 1 mL de Hoechst 33342 para manchar os núcleos e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Lave o bem suavemente e observá-lo sob um microscópio de fluorescência.
6. no ensaio de biocompatibilidade In Vivo
Nota: Ratos com peso entre 201-225 g tem testados com êxito usando este protocolo.
-
Anestesia
- Induzir e manter a anestesia; de preferência, anestesiar um rato (ratos Sprague Dawley de 8 semanas de idade, fêmea) através de uma injeção intramuscular de tiletamina e eficiente (25 mg / kg + 25 mg / kg, respectivamente) e xilazina (5 mg/kg). Execute um teste de estímulo de dor, pressionando os dedos do rato para confirmar a anesthetization.
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Esterilização do local cirúrgico
- Raspar e limpar a pele da área do trapézio do rato (sobre a parte traseira do pescoço) e limpe-a com loção de iodo-povidona para preparar a condição asséptica da pele (100 mg/mL).
- Cobrir o rato com cortinas cirúrgicos estéril para reduzir transferência bacteriana e subsequente contaminação do local cirúrgico.
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Implantação de tubo de gelatina
- Delicadamente, corte a pele da área do trapézio do rato com uma tesoura cirúrgica.
- Criar uma ferida de 2 cm e coloque o tubo de gelatina diretamente na camada entre a fáscia e o músculo.
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Cirurgia postimplantation
- Feche a ferida com sutura de nylon e limpe-a com solução de iodo-povidona (100mg/mL).
- Induzi o rato através de uma injeção intramuscular de cetoprofeno (2,5 mg/kg) e cefazolina (15 mg/kg).
- Mantenha o rato em condições assépticas, por 7 dias.
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Eutanásia
- Rato é eutanásia através de asfixia de CO2 em conformidade com diretrizes de AVMA para eutanásia. Confirme a morte do rato pela pitada de dedo do pé e cauda, seguida tocando no peito para garantir os batimentos cardíacos.
- Cortar o rato delicadamente com uma lâmina de bisturi, remover o tecido implantado e tirar fotos para observação.
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Representative Results
Neste estudo, temos desenvolvido com sucesso a gelatina em fibras(Figura 2)e tubos (Figura 2B, C), através do conceito de fiação úmida user-friendly. Estes materiais à base de gelatina podem ser utilizados como qualquer ferramenta médica, dependendo de suas formas. Considerando que a superfície funcional e quadro de tais materiais são mais apropriados para a regeneração dos tecidos, examinamos a biocompatibilidade do tubo de gelatina através da realização de testes in vitro e in vivo.
Para obter uma visão geral sobre o tubo de gelatina, em primeiro lugar, realizamos observações morfológicas usando microscopia eletrônica (Figura 3). Os resultados mostraram que a superfície do tubo gelatina não era muito suave(Figura 3),seu diâmetro interno era mais de 200 µm (Figura 3B), e sua espessura era aproximadamente de 20 µm (Figura 3C).
Em seguida, imunocitoquímica foi realizada para examinar a biocompatibilidade do tubo gelatina in vitro (Figura 4). Inicialmente, o tubo de gelatina foi incubado com células-tronco adiposas humanas por 2 semanas e foi manchado com nestin como um marcador de células nervosas(Figura 4). Sob o microscópio de fluorescência, a coloração mostrou o positivo nestin coloração marcador (cor verde) junto com um monte de núcleos detectados (cor azul), que sugeriu que as células poderiam penetrar e aderir bem ao tubo de gelatina e se diferenciar em células progenitoras neurais (Figura 4B). Além disso, o teste de biocompatibilidade in vivo do tubo gelatina mostrou resultados análogos. O tubo de gelatina foi inserido na camada de fáscia na área do trapézio de um rato por 7 dias. O resultado demonstra que a implantação do tubo gelatina na camada de fáscia indicado a sua segurança e biocompatibilidade grande, não mostrou nenhuma indicação de vermelhidão, inchaço, ou outros inflamação sintomas do tecido local e estava rodeada por tecidos conjuntivos bem desenvolvidos (Figura 5A, B).
Figura 1 : Esquema de fiação instalação o molhado. (A) fibras de gelatina. Tubo de gelatina (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagens de exibição brilhante de material à base de gelatina obtida através de molhado girando método. (A) fibras de gelatina. Tubo de gelatina (B). (C) gelatina tubo em solução de PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Morfologia do tubo de gelatina, observado por microscopia eletrônica. (A), A visão superficial da superfície do tubo gelatina (barra de escala = 50 µm). (B) vista de plano inclinado (barra de escala = 200 µm). (C) Vertical vista (barra de escala = 25 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Observação do crescimento de células-tronco adiposas humana (hASC) no tubo do gelatin. (A) imagem de exibição brilhante de gelatina tubo-hASCs. (B) sob o microscópio de fluorescência, a coloração mostrou o positivo nestin coloração marcador junto com um monte de núcleos corados com tubo de gelatina 33342.The Hoechst fornecido um ambiente ideal para hASCs de aderir e crescer dentro do tubo (barra de escala = 200 µm; cor azul = núcleos; cor verde = nestin). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: teste de biocompatibilidade In vivo do tubo gelatina. (A) a implantação do tubo gelatina na camada de fáscia. (B) observação do ambiente local do tecido implantado com o tubo de gelatina (área do retângulo vermelho) após 7 dias. Observaram-se sem vermelhidão, inchaço ou outros sintomas de inflamação, e o tubo está rodeado por bem desenvolvidos tecidos conjuntivos 7 dias após o implante. Isso é indicativo de uma excelente biocompatibilidade do tubo gelatina com o ambiente local do tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos o desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina usando um simples molhado girando a técnica que pode ser aplicada no estudo de polímeros naturais para a regeneração de tecidos. Este trabalho demonstrou a possibilidade de fabricação de gelatina como fonte de proteína excelente, sem adição de outras fontes, com o objetivo de otimizar as propriedades da gelatina em si. O desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina foi inteiramente realizado em temperatura ambiente (22-26 ° C). Uma preparação de solução suave é um passo crítico no âmbito do protocolo, como é manter uma concentração de solução exata e mexendo a solução muito suavemente para evitar quaisquer bolhas. O aparecimento de bolhas na solução, especialmente quando carregado para a seringa, irá afetar a forma de gelatina no meio de coagulação.
Biomateriais baseados em gelatina foram obtidos durante a transição da fase da solução de gelatina em um meio adequado de coagulação que faz com que o desolvation das moléculas do polímero e precipita a solução de gelatina em um polímero sólido fase11. Utilizando este conceito básico de molhado girando método, utilizamos a forma de gelatina em forma de tubo para aumentar a funcionalidade de sua superfície e para imitar as características de tecidos humanos, através do processo de moldagem. Neste caso, os tempos adequados para carregar, segurar e repita os passos são necessários para construir uma forma exata de tubo. Neste protocolo, a homogeneidade da forma do tubo durante o processo não pode ser controlada, considerando a forma assíncrona de fase de transição da parte inferior para a parte de cima do tubo. Além disso, os métodos preservados e esterilização para este material são limitados devido ao seu conteúdo de proteína.
Examinado por testes in vitro e in vivo, os resultados atuais demonstraram que os tubos de gelatina criados com este protocolo exibem uma excelente biocompatibilidade e tem grande aplicabilidade potencial em engenharia de tecidos. O diâmetro interno dos tubos gelatina obtidos neste estudo foi superior a 200 µm (Figura 3B), que permite que as células para passar e facilmente aderir à superfície dos tubos, interior16. Além disso, a espessura e superfície levemente asperous do tubo fornece um modelo adequado para a fixação da célula (Figura 3A, C). Consistentemente, os resultados de imunocitoquímica mostraram que as células penetraram e aderiram a gelatina tubo-particularmente o neural células-tronco, como observado através da coloração positiva das células neurais com o marcador nestin (Figura 4B ). Como o marcador nestin foi encontrado na área dos cones de crescimento durante os estágios de extensão do axônio, a coloração positiva de nestin é indicativa do cone crescimento17. Em última análise, esta combinação de gelatina-hASCs positiva pode ser implementada no tratamento da regeneração do sistema nervoso. A medula espinhal é composta por grupos de axônios do neurônio e feixes de fibras nervosas ao longo das vértebras da coluna vertebral. Assim, o tubo de gelatina pode não apenas fornecer o material de enchimento adequado lacuna mas também guia crescimento de fibras nervosas e regeneração através do tubo. Além disso, a grande biocompatibilidade observada pela implantação de um tubo de gelatina para a fáscia camada não demonstrou qualquer prejudiciais e efeito de inflamação nos tecidos locais e o tubo foi rodeado por tecidos conjuntivos bem desenvolvidos (Figura 5 A, B).
Em conclusão, temos desenvolvido com sucesso um protocolo simples e útil para a construção de biomateriais à base de gelatina com ambiente excelente biocompatibilidade e celular que pode ser usado em tecido de prospect engenharia de aplicações, tais como em nervoso regeneração do sistema, a substituição do vaso sanguíneo, a reconstrução do trato urinário e na reconstrução de partes de órgãos. Este protocolo pode ser implementado por engenheiros de tecido que são atualmente desenvolvendo correlativos polímeros naturais sem qualquer adição de polímero sintético. O protocolo pode ser facilmente expandido e pode ser usado para personalizar o design de biomateriais específicos. No futuro, este protocolo pode ser adaptado para a produção de biomateriais à base de proteínas em uma escala maciça, ajudando assim a perceber a regeneração de tecidos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pelo Ministério da defesa nacional (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; Mab-107-065), o Ministério da ciência e tecnologia (a maioria dos 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, o National Defense centro médico, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041) e Hospital Geral de Cheng-Hsin e cooperação centro de médico de defesa nacional (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
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