Summary
نقدم هنا، بروتوكول الوصول للغاية لتقييم حركة الخلية في الخلايا البشرية تروفوبلست باستخدام ثلاثة فحوصات في المختبر: مقايسة الصفر والمقايسة غزو ترانسويل والمقايسة انتشار الخلايا.
Abstract
حركة الخلية خاصية حرجة من تروفوبلاستس أثناء وضع المشيمة والحمل المبكر. تتجلى أهمية الهجرة تروفوبلست السليم وغزو اضطرابات الحمل مثل تقييد النمو داخل الرحم، ومقدمات الارتعاج، التي ترتبط بغزو تروفوبلست غير كافية للمفرج الأمهات. ولسوء الحظ، أن فهمنا للآليات التي تتطور المشيمة من ترحيل trophoblasts محدود. تحليل في المختبر للهجرة الخلية عن طريق المقايسة الصفر هو أداة مفيدة لتحديد العوامل التي تنظم تروفوبلست القدرات المهاجرة. إلا أن هذا التحليل وحدها تحدد التغيرات الخلوية التي يمكن أن تؤدي الهجرة الخلية المتغيرة. يصف هذا البروتوكول ثلاث فحوصات في المختبر المختلفة التي تستخدم مجتمعة لتقييم حركة الخلية تروفوبلست: مقايسة الصفر والمقايسة الغزو والمقايسة الانتشار. كما يمكن تعديل البروتوكولات المذكورة هنا لاستخدامها في خطوط الخلايا الأخرى لقياس حركة الخلية في الاستجابة للمحفزات. هذه الطرق تسمح للمحققين تحديد العوامل الفردية التي تسهم في حركة الخلية وتوفير إجراء فحص دقيق للآليات المحتملة الكامنة وراء التغيرات الواضحة في الهجرة الخلية.
Introduction
التنمية المشيمة خطوة حاسمة في وضع الحمل، والتي تؤثر على صحة الأم والجنين على حد سواء. ومع ذلك، لم يتم فهم أساس الميكانيكية التي تحدث هذه العملية تماما. الهجرة الخلية هو عملية بيولوجية هامة أن يسهم في تأسيس ووظائف المشيمة أثناء الحمل. بعد انغراس الكيسة، يميز تروفيكتوديرم trophoblasts فيلوس، التي تغطي سطح الزوائد المشيمية ويشاركون في الغاز وتبادل المغذيات، وتروفوبلاستس اكسترافيلوس (افتس)، التي تهاجر خارجاً من الزوائد وتقتحم أوروبية والمفرج الأمهات1. هجرة افتس أمر ضروري لإعادة عرض الشرايين لولبية الأمهات وإقامة الدورة الدموية أوتيروبلاسينتال لدعم نمو الجنين2. غزو تروفوبلست غير كافية أثناء الحمل يؤدي إلى وضع المشيمة غير طبيعي وقد تسهم في مضاعفات الحمل مثل بريكلامبسيا ارتفاع ضغط الدم الحملي، وتقييد النمو داخل الرحم والولادة قبل الأوان3، 4. ولذلك، فهم العوامل التي تؤثر في حركية تروفوبلست ضروري لتحديد المسارات المطلوبة من أجل بلاسينتيشن العادية.
ويسيطر الهجرة تروفوبلست شبكة معقدة من إشارات الجزيئات، بما في ذلك عوامل النمو، السيتوكينات والهرمونات و عوامل الأوعية5. بسبب قيود الدراسة المجراة في المشيمة، خلد في المختبر فحوصات استخدام الخلايا البشرية تروفوبلست خطوط كانت حاسمة لتحديد العوامل التي تساهم في حركية تروفوبلست. وقد استخدمت فحوصات الصفر وغزو على نطاق واسع تقييم كمي دور الجزيئات الفردية على تروفوبلست خلية الهجرة6،،من78. ومع ذلك، كانت مفيدة في جنبا إلى جنب للتحقيق في كيفية التغييرات في الهجرة قد يكون سبب تغييرات في الخلية اختزاع، لا تراعي هذه الاختبارات اثنين إضافية من الآليات التي قد تساهم في تغيير معدلات الهجرة الخلية. على سبيل المثال، قد يؤدي تخفيض معدل انتشار الخلايا خلايا أقل المتاحة للهجرة.
هنا، يمكننا وصف الأساليب الكمية في المختبر لتقييم الهجرة تروفوبلست استخدام الصفر، وتكاثر الخلايا، وفحوصات غزو الخلية. في مقايسة الصفر، جرح موحدة يتم إنشاؤه في أحادي الطبقة خلية، ويقاس هجرة الخلايا إلى سد هذه الفجوة بالتصوير الآلي، والوقت الفاصل بين حجم الجرح وكثافة الخلايا داخل الجرح. تحليل انتشار الخلايا يستند حساب نسبة الخلايا في كل وقت نقطة مقارنة بكمية بداية معروفة من الخلايا. في مقايسة غزو الخلية، الخلايا هي تبذر فوق دائرة لإدراج ثقافة خلية المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية (مثل ترانسويل)، ويتم حساب عدد الخلايا التي تغزو عن طريق المصفوفة خارج الخلية استجابة للعلاج الكيماوي-جاذبة.
والرزن الصفر هو أداة بسيطة وفعالة يمكن استخدامها لتحديد ظروف بيئية مختلفة كيف تؤثر الهجرة الخلية. وبعد ذلك يمكن استخدام فحوصات انتشار وغزو لتحديد مساهمة تكاثر الخلايا واختزاع للتغييرات الشاملة في الهجرة الخلية. مجتمعة، هذه فحوصات توفير قياسات قوية للعمليات البيولوجية التي قد تساهم في حركية الخلية. واستخدمت السطرين خلية مخلدة الاثلوث الأول تروفوبلست في فحوصات وصفت، Swan.71 (Sw.71) و HTR-8/سفنيو9،10. ولكن أيضا يمكن تحسين هذه فحوصات لاستخدامها في أنواع الخلايا الأخرى لتحديد المغيرون الرئيسية الخلية الهجرة والغزو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الخلية
- الحفاظ على الخلايا في قوارير T-75 في وسائط النمو القياسي في 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95%.
ملاحظة: كانت الخلايا المستخدمة في هذه التجارب مخلدة خطوط الخلية تروفوبلست الاثلوث الأول Swan.71 (Sw.71) و9،HTR-8/سفنيو10. واستمرت الخلايا Sw.71 في دميم/و-12 تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS)، بيروفات صوديوم 1.0 مم، 10 مم حبيس، الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 0.10 مم، 100 وحدة/مل البنسلين و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. وأبقى على الخلايا HTR-8/سفنيو في ربمي-1640 تستكمل مع 5% الحرارة-إبطال FBS. - السماح للخلايا للنسخ المتماثل حتى تصل إلى التقاء 90-100%. باستخدام غطاء تدفق زراعة أنسجة معقمة، نضح وسائط الإعلام من الخلايا قارورة، والمياه والصرف الصحي مع 10 مل 1 العقيمة x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل 1 × (0.05%) التربسين-أدتا إلى قارورة، التأكد من أن الخلايا تغطيها التربسين. ضع قارورة في الحاضنة مختبر المحافظة في 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% حتى يكون فصل كافة الخلايا من الجزء السفلي لقارورة (حوالي 5-10 دقيقة).
- إضافة 10 مل وسائط النمو المعالجون مسبقاً إلى قارورة لإلغاء تنشيط التربسين-يدتا.
2-الصفر الإنزيم
- وبعد الخطوة 1.4، البذور عدد مناسب من الخلايا إلى لوحة 24-جيدا لتحقيق التقاء 100% في ح 48.
ملاحظة: فمن الممكن لإجراء الفحص الصفر مع مجموعة متنوعة من تخطيطات لوحة مختلفة. الحد الأقصى لعدد من الآبار المسموح بها من قبل الأداة صانع الجرح شكل 96-جيدا. - اليوم التالي (يوم قبل الفحص الصفر)، تغيير الوسائط للفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة استكمالها حسب الاقتضاء، بما في ذلك إبطال الحرارة، والفحم جردت ديكستران FBS.
ملاحظة: وقد أوصت دراسات أخرى استخدام وسائط الإعلام مع التركيز المنخفض FBS (مثلاً، 1%) للحد من انتشار الخلايا، الذي يمكن استخدامه كبديل في هذا البروتوكول11. - في يوم الفحص الصفر، بريتريت الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل إضافة العلاج المطلوب لوسائل الإعلام في كل بئر. تستخدم التجارب المبينة مركبة (1 x PBS) و 100 نانومتر الديكساميتازون المخفف في برنامج تلفزيوني x 1.
-
لإنشاء الجروح موحد، وضع معقم 10 ميليلتر ماصة نصائح حول دبابيس الأداة صانع الجرح. انخفاض النصائح إلى الصف الأول من الآبار ونقل اللوحة على طول مسار صانع الجرح حتى نصائح ماصة تصل إلى الجانب الآخر من البئر.
- نقل اللوحة مرة أخرى إلى موضع البداية، السماح لنصائح ماصة للمس الجزء السفلي من لوحة لضمان ثابت الجرح عبر قطر البئر بشكل مستمر. إزالة واستبدال العقيم 10 ميليلتر ماصة نصائح وانخفاض النصائح إلى الصف التالي في الآبار.
- كرر الخطوة 2، 4 حتى يتم خدش جميع الآبار.
ملاحظة: إذا لم يتوفر أداة صانع جرح، يمكن إنشاء الجروح بواسطة يدوياً إلغاء مركز الآبار مع تلميح ماصة 10 ميليلتر. - نضح وسائل الإعلام بعناية ولطف تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني x 1. عقب يغسل نهائي، إضافة الفينول-الأحمر تستكمل مجاناً، وجردت أو وسائط منخفضة-FBS مع العلاج المطلوب أو مركبة (وفقا لتوجيهات في الخطوة 2، 3).
ملاحظة: يجب غسلها الخلايا HTR-8/سفنيو مع الوسائط الفينول الأحمر المكملة، الغسل ببرنامج تلفزيوني x 1 سوف يسبب الخلايا لفصل. - 24-كذلك لوحة تحتوي على آبار خدش في الآلي، تصوير مرور الزمن (انظر الجدول للمواد) يسكنون في حاضنة مختبر الإبقاء على 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95%. صورة آبار على فترات منتظمة كلما دعت الحاجة للسماح بإكمال التئام الجروح (مثلاً كل ح 2 عن ح 72) الخلايا.
- حساب كثافة الجرح والعرض من البرمجيات المرتبطة بالتصوير الآلي، ومرور الزمن (انظر الجدول للمواد). لحساب النسبة المئوية للتغير في حجم الجرح بالنسبة لحجم الجرح انطلاق، تعيين عرض الجرح في وقت 0 يساوي 100%. تقسيم حجم الجرح في كل تيميبوينت اللاحقة بحجم الجرح في الوقت 0 وضرب 100 للحصول على النسبة المئوية (الشكل 1).
3-غزو الإنزيم
- الخطوة التالية 1.4، البذور عدد مناسب من الخلايا إلى لوحات 6-جيدا السماح بالتوصل إلى التقاء 90% في 48 h. المحافظة على الخلايا في حاضنة مختبر تعيين إلى 37 درجة مئوية ورطوبة 95% 5% CO2الخلايا.
- في اليوم التالي، تغيير الوسائط للفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة استكمالها حسب الاقتضاء، بما في ذلك إبطال الحرارة، والفحم جردت ديكستران FBS.
ملاحظة: يمكن بريتريتيد الخلايا في هذا الوقت اعتماداً على التصميم التجريبي. - وفي هذا الوقت، ضع قنينة المصفوفة خارج الخلية 10 ملغ/مل (انظر الجدول للمواد) على الجليد، والسماح لها بالذوبان في الثلاجة بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، لوازم المقايسة باردة قبل الغزو بوضع لوحات 24-جيدا، خلية ثقافة، أنابيب ميكروسينتريفوجي، وإدراج نصائح ماصة في الثلاجة (4 درجات مئوية) على الأقل 2 ح قبل العمل مع المصفوفة خارج الخلية.
- استخدام اللوازم المبردة في هود زراعة الأنسجة، تمييع المصفوفة خارج الخلية 10 ملغ/مل 1:1 مع خالية من الأحمر الفينول، خالية من المصل وسائل الإعلام بتركيز 5 ملغ/مل نهائي.
ملاحظة: دائماً الاحتفاظ بالمخزون والمصفوفة خارج الخلية المخفف على الجليد. يمكن تعديلها استناداً إلى خصائص خط الخلية المستخدمة في الفحص نسبة المصفوفة خارج الخلية لوسائل الإعلام. - استخدام اللوازم المبردة في هود زراعة الأنسجة، إضافة 100 ميكروليتر من المصفوفة خارج الخلية المخففة لإدراج (انظر الجدول للمواد) التي تم وضعها في لوحة 24-جيدا. تأكد من أن المصفوفة هو المستوى دون أي فقاعات. ضع لوحة 24-كذلك يتضمن إدراج المغلفة بالمصفوفة في الحضانة عند 37 درجة مئوية للسماح للمصفوفة تتصلب.
- الإعدادية الخلايا لغزو المقايسة، تغسل الخلايا مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني ونضح برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميليلتر التربسين س 1-يدتا لكل بئر. ضع لوحة 6-جيدا في الحاضنة مختبر المحافظة في 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% حتى يكون فصل كافة الخلايا من الجزء السفلي من اللوحة.
- بمجرد فصل الخلايا، إضافة 500 ميليلتر وسائط خالية من الأحمر الفينول، وخالية من المصل لكل بئر من الخلايا تريبسينيزيد.
- نقل 1,000 ميليلتر من خلايا منفصلة لأنبوب ميكروسينتريفوجي وتدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 400 x ز في 4 درجات مئوية.
- نضح وسائل الإعلام وريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام خالية من الأحمر الفينول، وخالية من المصل (الحجم سوف تعتمد على تركيز الخلايا). حساب عدد الخلايا باستخدام خلية الآلي مواجهة (انظر الجدول للمواد)، وضبط حجم تعليق خلية لتركيز نهائي من 5 × 105 خلايا كل مل.
ملاحظة: قد تستعمل أيضا هيموسيتوميتير ومجهر عد الخلايا. - إضافة 600 ميكروليتر من وسائط النمو الكامل للآبار التي بليت 24-البئر الذي سيتم استخدامه لتحليل الغزو.
ملاحظة: يمكن إضافة تشيمواتراكتانتس إضافية أو علاجات للمتوسطة النمو الكامل في البئر (مجلس النواب). وأضاف التجارب المبينة مركبة (1 x PBS) أو 100 نانومتر الديكساميتازون المخفف في برنامج تلفزيوني x 1 لمجلس النواب. - المكان قبل المغلفة إدراج كل بئر يحتوي على متوسط النمو الكامل الذي سيتم استخدامه لتحليل الغزو. قم بإضافة 200 ميكروليتر من الخلايا على رأس كل إدراج خلية قبل المغلفة (مجلس الشيوخ) لمجموعة خلايا 1 × 105 .
ملاحظة: كعنصر تحكم سلبية لهذا التحليل، يمكن إضافة وحدة تخزين تساوي وسائط خالية من الأحمر الفينول، وخالية من المصل (بدون الخلايا) إلى مجلس الشيوخ. - ضع لوحة 24-جيدا في مختبر الحاضنة الإبقاء على 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ح 24.
ملاحظة: فترة الحضانة 24 ح الأمثل للخلايا مخلدة الاثلوث الأول تروفوبلست وقد يلزم المزيد من الاختبارات لتحديد فترة الحضانة المطلوبة في خطوط الخلايا الأخرى. - وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، شفط الوسائط المتبقية من الدائرة العلوية والسفلية دون إزعاج المصفوفة خارج الخلية. ثم، بعناية إزالة المصفوفة خارج الخلية والخلايا غير غزت من الجزء العلوي من الإدراج مع مسحه القطن، ينظف عدة مرات حسب الضرورة لإزالة المصفوفة خارج الخلية.
- أغسل كل إدراج 3 x مع 1 x برنامج تلفزيوني، مشيراً إلى برنامج تلفزيوني للمجلسين الأعلى والأدنى من البئر. نضح برنامج تلفزيوني بعد كل غسل.
- إصلاح الخلايا المرفقة لتدرج بوضع إدراج إلى 100 ٪ الميثانول المثلج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. أغسل إدراج 3 x 1 x برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني بعد أن يغسل النهائي. وصمة عار الخلايا المرفقة لإدراج لمدة 10 دقيقة مع 0.2% الكريستال البنفسجي في الإيثانول 20%.
- شطف x 3 مع المياه ونضح المياه بعد الغسيل النهائي.
- أيردري إدراج ح 1 في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ملقط وشفرة حلاقة، قطع الغشاء السفلي للإدراج بعناية وجبل على شريحة زجاجية مع الجانب السفلي مواجها لأعلى. السماح لوسائل الإعلام المتزايدة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
- الحصول على صور فريدة من نوعها على الأقل 4 خلايا غزت كل عينة باستخدام مجهر خفيفة ذات هدف 20 x. حساب إجمالي عدد الخلايا في كل صورة وتطبيع عدد الخلايا لمراقبة العينات ورسم البيانات (الشكل 2).
4-انتشار الإنزيم
- عد الخلايا تريبسينيزيد من قارورة استخدام عداد الآلي خلية الخطوة التالية 1.4، والبذور في لوحات 6-جيدا في كثافة الخلايا 2 × 105 كل بئر في وسائط النمو القياسية.
- وضع الخلايا في حاضنة مختبر الإبقاء على 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% لح 4 أو حتى الخلايا، قد انضمت.
- تغير وسائل الإعلام للفينول الأحمر مجاناً وسائل الإعلام استكمال حسب الاقتضاء، بما في ذلك إبطال الحرارة، والفحم جردت ديكستران FBS وإضافة العلاج المطلوب. وأضاف التجارب المبينة مركبة (1 x PBS) أو 100 نانومتر الديكساميتازون المخفف في برنامج تلفزيوني x 1. وضع لوحات 6-جيدا في حاضنة مختبر الإبقاء على 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95%.
- قم بإزالة الوسائط واستبدال مع وسائط الإعلام الجديدة، ومعاملة كل 48 ساعة.
- بعد 24 أو 48 أو 72 ح العلاج، تغسل الخلايا مع 1 مل من 1 x PBS وإضافة 500 ميليلتر يدتا التربسين لكل بئر. ضع لوحة 6-جيدا في حاضنة حتى يكون فصل الخلايا من لوحة.
- بمجرد فصل الخلايا من اللوحة، إضافة 500 ميليلتر الفينول الأحمر تستكمل وسائل الإعلام الحرة لإلغاء تنشيط التربسين.
- إضافة 5 ميليلتر من الخلايا تريبسينيزيد إلى 5 ميليلتر تريبان الأزرق في أنبوب منفصل ومزيج من بيبيتينج.
- حساب عدد الخلايا من كل بئر في تكرار استخدام عداد الآلي خلية.
- متوسط عدد الخلايا الواحدة وكذلك عند كل نقطة الوقت والأرض كدالة للزمن (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واستخدمت خطوط خلية مخلدة تروفوبلست الاثلوث الأول البشرية Sw.71 و HTR-8/سفنيو في هذه التجارب لتحديد دور الكورتيزون في تروفوبلست خلية الهجرة12. واستخدمت الكورتيزون في هذه التجارب كما أنها مؤخرا تبين أن تغيير مهام تروفوبلست، على الرغم من أن العلاجات البديلة يمكن أن تستخدم12. كلا خطوط الخلايا تعامل مع السيارة (1 x PBS) أو 100 نانومتر الديكساميتازون جلوكوكورتيكويد الاصطناعية (Dex) لجميع التجارب. وقيست تجرح كثافة وحجم كل ح 2 عن 72 ح باستخدام نظام تصوير الآلي، ومرور الزمن. ويبين الشكل 1 مثال للصور والنتائج التي تم الحصول عليها من التحليل الصفر في تيميبوينتس مختلفة. وقد قدمت عينة من الصور من تيميبوينتس 0, 8 و 18 ح لكل العلاجات (الشكل 1A). رسوم بيانية بكثافة الجرح وحجم الجرح على مر الزمن لعينات تعامل مع مراقبة المركبات (فيه) أو 100 نانومتر التنفيذ المباشر (الشكل 1B). معاملة التنفيذ المباشر خفض معدل إغلاق الجرح كما تحددها كثافة الجرح وحجم الجرح، مما يشير إلى أن الكورتيزون تكبح الهجرة الخلية في الخلايا تروفوبلست الاثلوث الأول.
ويبين الشكل 2 مثالاً على الصور التي التقطت لإدراج ثقافة الخلية بعد الفحص الغزو. تم علاج الخلايا ح 24 مع فيه أو 100 نانومتر التنفيذ المباشر. خلايا غزت أحصى من أربعة replicates المستقلة الواحدة والعلاج باستخدام أربعة حقول فريدة من نوعها لعرض كل تكرار. تخفيض العلاج جلوكوكورتيكويد اختزاع الخلية، كما هو موضح بانخفاض 15% في عدد الخلايا غزت.
ويبين الشكل 3 مثال على تحليل انتشار الخلايا. تم عد الخلايا في 24 و 48 و 72 ح بعد العلاج مع فيه أو 100 نانومتر التنفيذ المباشر. العلاج جلوكوكورتيكويد خفض انتشار الخلايا، كما يتبين من خلايا أقل في كل مرة نقطة. عموما، هذه فحوصات تثبت أن التعرض جلوكوكورتيكويد يقلل حركية الخلية عن طريق تثبيط تكاثر الخلايا والغزو.
رقم 1: خلية التحليل الصفر. (أ) الصور الممثل فيه-والتنفيذ المباشر-تعامل لتظهر الخلايا Sw.71 في 0, 8 و 18 ح متأثراً بجراحه. الخطوط الحمراء تبين حجم الجرح. (ب) الجرح تم قياس حجم وكثافة والجرح في الخلايا Sw.71 و HTR-8/سفنيو التعامل مع المركبة (فيه) أو 100 نانومتر التنفيذ المباشر. تم التقاط الصور كل ح 2 عن 72 ح استخدام مجهر الآلي، والوقت الفاصل بين. تمثل البيانات يعني أربعة replicates المستقلة ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الخلية غزو المقايسة. وقد أجريت فحوصات الغزو مع خلايا Sw.71 و HTR-8/سفنيو العلاج 24 ساعة بالسيارة (فيه) أو 100 نانومتر التنفيذ المباشر. (أ) صور الممثل من مقايسة غزو للخلايا تعامل فيه والتنفيذ المباشر بعد حضانة 24 ساعة. صورة اقحم مراقبة سلبية مع أي من الخلايا إضافة إلى مجلس الشيوخ. الصور التي التقطت في 200 x التكبير. هي أشرطة مقياس أحصى 120 ميكرومتر. (ب) خلايا إينفاديد، وتمثل الرسوم البيانية بار يعني تطبيع replicates المستقلة الأربع ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: خلية انتشار المقايسة. Sw.71 و HTR-8/سفنيو الخلايا تعامل مع مركبة (فيه) أو 100 نانومتر التنفيذ المباشر أحصى كل 24 ساعة عداد الآلي خلية باستخدام. عدد خلايا هي رسوم بيانية كما ± يعني وزارة شؤون المرأة على الأقل 11 مستقلة وإنشاء نسخ متماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند هذا الإجراء استخدام الهجرة وغزو فحوصات تشمل معدل انتشار الخلايا كأحد مساهمين المحتملين لقياس الاختلافات في حركة الخلية تروفوبلست. تستخدم معا، هذه فحوصات في المختبر هي الطرق البسيطة والفعالة التي يمكن استخدامها لتحديد المسارات الخلوية التي تنظم الهجرة تروفوبلست. كما هو موضح أعلاه، يجوز أن تعامل الخلايا تروفوبلست مع الهرمونات، السيتوكينات، وعوامل النمو، أو جزيئات أخرى لتحديد تأثيرها على حركة تروفوبلست. وبدلاً من ذلك، قد يكون قد نفد البروتينات المستهدفة من الخلايا توضيح دورها الوظيفي في حركية تروفوبلست. تحديد المغيرون الرئيسية للهجرة تروفوبلست يجوز توفير فهم أفضل للآليات الأساسية الكامنة وراء مضاعفات الحمل تتعلق بعيوب المشيمة، بما في ذلك بريكلامبسيا وتقييد النمو داخل الرحم والولادة قبل الأوان.
وهناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول المطلوبة للحصول على نتائج دقيقة. بسبب وجود الفينول الأحمر النشاط الاستروجيني في التركيزات المستخدمة في خلية ثقافة الإعلام13, من المهم أن وسائل الإعلام الحرة الفينول الحمراء المستخدمة في النهاية تجريبية لمنع التنشيط غير مرغوب فيها من مستقبلات الإستروجين في خلايا. أثناء الفحص غزو ترانسويل، من المهم ضمان أن المصفوفة خارج الخلية متجانسة، ومستوى، وأن الإمدادات الباردة تستخدم لمنع البلمرة سابق لأوانه للمصفوفة. وعند إجراء فحوصات انتشار وغزو الخلية، من المهم لعد عينات فورا لمنع إعادة انضمام الخلايا إلى لوحات زراعة الأنسجة. ينبغي أيضا أخذ قيد النظر أن موت الخلايا نتيجة للعلاج التجريبي يمكن أن تؤثر نتائج جميع الاختبارات الثلاثة. ولذلك، ينبغي تقييم علامات لموت الخلية (مثل الإصدار نازعة لاكتات أو تخريج فوسفاتيديلسيريني تدهور الحمض النووي) استجابة للعلاج في خط الخلية التجريبية قبل تقييم الهجرة، الغزو، و 14من الانتشار. توجد بعض القيود لهذه الاختبارات، وعلى سبيل المثال، عملية إنشاء جرحا في أحادي الطبقة خلية الحث استجابة إصابة خلية مما قد إرباك عملية الهجرة الخلية. وعلاوة على ذلك، قد يعرض القشط اليدوي تقلب إينتيريكسبيريمينت، على الرغم من أن استخدام أداة صانع الجرح أن يخلق عرض الجرح موحدة يمكن تخفيفها جزئيا هذا القيد. عيب المقايسة الغزو هو أنه مقايسة نقطة نهاية، وحركية حركة لا تتحقق بسهولة. وعلى الرغم من هذه القيود، فحوصات الموصوفة هنا توفير البيانات الكمية، واستنساخه في منخفض التكلفة نسبيا.
يمكن أيضا تعديل فحوصات الموصوفة هنا لقياس الهجرة الخلية في أنواع الخلايا الأخرى، على الرغم من أن هذه الاختبارات سوف لا تكون مناسبة لأنواع الخلايا غير ملتصقة. في مقايسة الصفر، يمكن تعديل فترات التصوير للوقت الفاصل بين الفحص المجهري لالتقاط الفروق في معدل الهجرة الخلية بما فيه الكفاية. النظم الآلية لتصوير الخلية الحية يمكن التقاط الجرح حجم الصور وغالباً كل 15 دقيقة من الصور التي التقطت على الأقل كل 30 دقيقة يمكن أن مخيط معا لإنشاء فيلم من التئام. في المقايسة الغزو، تركيز المصفوفة خارج الخلية، بلغ العدد الإجمالي للخلايا، ويمكن تعديل مدة الحضانة قبل تحديد وفرز الخلايا لحساب معدل محدد للغزو في أنواع مختلفة من الخلايا. في مقايسة انتشار الخلايا، يمكن تعديل عدد الخلايا في المصنف على اللوحات والنقاط الزمنية لعد الخلايا لحساب معدلات مختلفة لنمو الخلايا. وعموما، هذه فحوصات هي أدوات مرنة والوصول للغاية التي يمكن استخدامها في طائفة واسعة من أنواع الخلايا لتحديد الآليات الكامنة وراء الهجرة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور جيل مور لتزويد الخلايا Sw.71. أيد هذا البحث "جائزة ألبرت مكيرن الباحث" إلى جنوب غرب
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
