Name: In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie In-vitro-Tests zur Bewertung von Migration, Invasion und Proliferation in verewigten menschlichen Ersttrimester-Trophoblast-Zelllinien. Diese Methoden ermöglichen visuelle und quantitative Analysen für die Geburtshilfeforschung.

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Die Autoren danken Dr. Gil Mor für die Bereitstellung der Sw.71 Zellen. Diese Forschung wurde durch eine Albert McKern Scholar Award, S.W unterstützt.

1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>Zellen in T-75 Flaschen in standard Wachstumsmedien bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Hinweis: In diesen Experimenten verwendeten Zellen wurden die verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zellen Linien Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10. Die Sw.71 Zellen wurden in DMEM/F-12 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 1,0 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt beibehalten. Die HTR-8/SVneo-Zellen waren gepflegt, ergänzt mit 5 % RPMI-1640 Hitze-inaktivierten FBS.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen repliziert bis zum Zusammenfluss von 90-100 % erreichen. Mit einer sterilen Gewebekultur Fluss Kapuze, aspirieren Sie die Medien aus der Flasche und waschen Zellen mit 10 mL von sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Aspirieren der PBS und 5 mL 1 x (0,05 %) Trypsin-EDTA in den Kolben, um sicherzustellen, dass Zellen von Trypsin abgedeckt werden. Ort-Kolben im Labor Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten werden, bis alle Zellen von der Unterseite des Kolbens (ca. 5-10 min) gelöst haben.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL vorgewärmten Wachstumsmedien in den Kolben, die Trypsin-EDTA zu deaktivieren.</li>
</ol>(2) kratzen Assay
<ol><li>Folgenden Schritt 1.4, Samen die entsprechende Anzahl von Zellen in einer 24-Well-Platte, 100 % Zusammenfluss in 48 h zu erreichen. Hinweis: Es ist möglich, den Scratchen Test mit einer Vielzahl von verschiedenen Platte Layouts durchführen. Die maximale Anzahl von Brunnen durch die Wunde-Maker-Tool erlaubt ist ein 96-Well-Format.</li>
	<li>Am nächste Tag (Tag vor Kratzer Assay), ändern Sie Medien in Phenol-rot freie Medien ergänzt je nach Bedarf, einschließlich Hitze-inaktivierten, Holzkohle Dextran abgestreift FBS. Hinweis: Andere Studien haben die Verwendung von Medien mit geringer Konzentration FBS (z. B. 1 %) empfohlen. Zellproliferation, minimieren die als Alternative in diesem Protokoll11verwendet werden können.</li>
	<li>Am Tag der Scratch-Test vorbehandeln Sie Zellen für 30 min indem gewünschte Behandlung zu den Medien in jede Vertiefung. Die beschriebenen Experimente nutzte Fahrzeug (1 X PBS) und 100 nM Dexamethason in 1 X PBS verdünnt.</li>
	<li>
Um einheitliche Wunden verursachen, setzen Sie sterile 10 µL-Pipettenspitzen an den Pins des Werkzeugs Wunde Maker. Senken Sie die Tipps in der ersten Zeile der Brunnen und verschieben Sie die Platte entlang der Strecke von der Wunde Maker, bis die Pipettenspitzen die andere Seite des Brunnens zu erreichen.
	<ol>
<li>Verschieben Sie die Platte wieder in die Ausgangsposition, so dass die Pipettenspitzen, kontinuierlich die Unterseite der Platte zu gewährleisten eine konstante Wunde über den Durchmesser des Brunnens zu berühren. Entfernen Sie und ersetzen Sie die sterile 10 µL Pipettenspitzen und senken Sie die Tipps in die nächste Zeile der Brunnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.4, bis alle Brunnen zerkratzt sind. Hinweis: Wenn eine Wunde-Maker-Tool nicht verfügbar ist, können die Wunden durch manuell Schaben der Mitte der Brunnen mit einer 10 µL Pipettenspitze erstellt werden.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien sorgfältig und waschen Sie vorsichtig Zellen zweimal mit 1 X PBS. Im Anschluss an eine letzte Wäsche fügen Sie ergänzt Phenol-rot kostenlose, abgespeckte oder Low-FBS Medien mit gewünschten Behandlung oder Fahrzeug (wie in Schritt 2.3 verwiesen hinzu). Hinweis: HTR-8/SVneo Zellen sollten mit ergänzten Phenol-Red Media gewaschen werden, da mit 1 X PBS waschen Zellen führt zu lösen.</li>
	<li>Legen Sie die 24-Well-Platte mit zerkratzten Brunnen in der automatisierten, Time-Lapse Imager (siehe Tabelle der Materialien) in einem Labor-Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gepflegt untergebracht. Bild-Brunnen in regelmäßigen Abständen nach Bedarf damit Zellen Wundheilung (z. B. alle 2 h 72 h) abzuschließen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Wunde Dichte und Breite von der Software, die automatisierte, Time-Lapse Imager zugeordnet (siehe Tabelle der Materialien). Berechnen Sie die prozentuale Veränderung in der Wunde Größe im Verhältnis zur Größe der Wunde ab, legen Sie die Breite der Wunde zum Zeitpunkt 0 entspricht 100 %. Teilen Sie die Wunde Größe in jeder nachfolgenden Timepoint durch die Wunde Größe zum Zeitpunkt 0 und multiplizieren mit 100 um den Prozentsatz (Abbildung 1) zu erhalten.</li>
</ol>(3) Invasion Assay
<ol><li>Folgenden Schritt 1.4, Samen die entsprechende Anzahl von Zellen in 6-Well-Platten damit Zellen 90 % Zusammenfluss in 48 h. Maintain Zellen in einem Labor-Inkubator legen Sie auf 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit zu erreichen.</li>
	<li>Ändern Sie am nächsten Tag Medien in Phenol-rot freie Medien ergänzt je nach Bedarf, einschließlich Hitze-inaktivierten, Holzkohle Dextran abgestreift FBS. Hinweis: Zellen können zu diesem Zeitpunkt je nach Versuchsanordnung vorbehandelt werden.</li>
	<li>Zu diesem Zeitpunkt, legen Sie das Fläschchen der extrazellulären Matrix 10 mg/mL (siehe Tabelle der Materialien) auf Eis, und lassen Sie es über Nacht im Kühlschrank auftauen.</li>
	<li>Am nächsten Tag vor kühlen Invasion Assay liefert indem man 24-Well Platten, Zellkultur einfügt, Mikrozentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen im Kühlschrank (4 ° C) für mindestens 2 Stunden vor der Arbeit mit der extrazellulären Matrix.</li>
	<li>Verdünnen Sie mit gekühlten Lieferungen in der Gewebekultur-Haube, 10 mg/mL extrazelluläre Matrix 1:1 mit Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien, eine Endkonzentration von 5 mg/mL. Hinweis: Immer die Lager und verdünnte extrazelluläre Matrix auf Eis. Das Verhältnis der extrazellulären Matrix, Medien kann anhand der Eigenschaften der im Test verwendeten Zelllinie eingestellt werden.</li>
	<li>Fügen Sie mithilfe gekühlte Lieferungen in der Gewebekultur Kapuze 100 μL verdünnt extrazelluläre Matrix zu den Einsätzen (siehe Tabelle der Materialien), die in den 24-Well-Platte platziert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Matrix blasenfrei ist. Legen Sie die 24-Well-Platte mit Matrix-beschichteten Wendeschneidplatten im Inkubator bei 37 ° C um die Matrix zu Härten zu ermöglichen.</li>
	<li>Prep Zellen für Invasion Assay Zellen mit 1 mL 1 X PBS waschen, Aspirieren der PBS und 500 µL 1 X Trypsin-EDTA in jede Vertiefung hinzufügen. Platz 6-Well-Platte im Labor Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten werden, bis alle Zellen von der Unterseite der Platte gelöst haben.</li>
	<li>Sobald Zellen getrennt haben, fügen Sie 500 µL Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien in jede Vertiefung der trypsiniert Zellen.</li>
	<li>Transfer von 1.000 µL freistehende Zellen zum Microcentrifuge Schlauch und Spin-down für 5 min bei 400 X g bei 4 ° c</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien und Aufschwemmen Zellen in Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien (Volumen wird je nach Konzentration der Zellen). Anzahl Zellen mit Hilfe einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien) und Lautstärke der Zellsuspension für eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen pro mL. Hinweis: Ein Hemocytometer und ein Mikroskop können auch verwendet werden, um Zellen zu zählen.</li>
	<li>Fügen Sie 600 μL des kompletten Wachstumsmedien in die Vertiefungen der 24-Well-Platte, die für die Invasion Assay verwendet werden. Hinweis: Zusätzliche Chemoattractants oder Behandlungen können das komplette Wachstumsmedium im Brunnen (Unterhaus) hinzugefügt werden. Die beschriebenen Experimente hinzugefügt Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM Dexamethason verdünnt mit 1 X PBS-Puffer für die untere Kammer.</li>
	<li>Ort der vorbeschichtete stecken Sie in jedes gut mit vollständigen Wachstumsmedium, die für die Invasion Assay verwendet werden. Dann fügen Sie 200 μL der Zellen auf der Oberseite jedes vorbeschichtete Zelle einfügen (Oberhaus) für eine Gesamtmenge von 1 x 105 Zellen. Hinweis: Als Negativkontrolle für dieser Assay kann die obere Kammer ein gleiches Volumen Phenol-Rotfrei-, serumfreie Medien (ohne Zellen) hinzugefügt werden.</li>
	<li>Platz 24-Well-Platte im Labor Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für 24 h gewartet. Hinweis: Die 24 h Inkubationszeit wurde optimiert für die verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zellen und weitere Tests müssen gegebenenfalls die erforderlichen Inkubationszeit bei anderen Zelllinien zu bestimmen.</li>
	<li>Nach Inkubation über Nacht Saug-die restlichen Medien aus der oberen und unteren Kammer ohne zu stören die extrazelluläre Matrix. Dann entfernen Sie vorsichtig die extrazelluläre Matrix und nicht überfallen Zellen aus dem oberen Teil des Einsatzes mit einem Wattestäbchen, wischt so oft wie nötig, um die extrazellulären Matrix zu entfernen.</li>
	<li>Jedes waschen legen Sie 3 X mit 1 X PBS, die oberen und unteren Kammern des Brunnens PBS hinzufügen. Aspirieren Sie PBS nach jedem Waschen.</li>
	<li>Zellen zu den Einsätzen durch Platzieren von Einsätzen in 100 % eiskaltem Methanol für 30 min bei 4 ° c zu beheben Wash fügt 3 X mit 1 x PBS und entfernen PBS, nachdem das Finale zu waschen. Färben Sie die Zellen auf die Einsätze für 10 min mit 0,2 % Kristallviolett in 20 % Ethanol.</li>
	<li>Spülen Sie 3 X mit entionisiertem Wasser und aspirieren Sie deionisiertes Wasser nach dem letzten waschen.</li>
	<li>Trocknen Sie Einsätze für 1 h bei Raumtemperatur an der Luft. Mit einer Pinzette und einer Rasierklinge, schneiden Sie vorsichtig die untere Membran des Einsatzes und auf einem Objektträger mit der Unterseite nach oben montieren. Lassen Sie Montage-Medien bei Raumtemperatur trocknen.</li>
	<li>Mindestens 4 einzigartige Bilder der angegriffene Zellen pro Probe mit einem Licht Mikroskop mit einem Objektiv 20 X zu erhalten. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jedem Bild und normalisieren Sie die Anzahl der Zellen zu Kontrollproben und plot-Daten (Abbildung 2).</li>
</ol>4. Verbreitung Assay
<ol><li>Folgenden Schritt 1.4, trypsiniert Zellen aus der Flasche mit einem automatisierten Zelle Zähler zählen und in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Bohrloch in standard Wachstumsmedien Samen.</li>
	<li>Platzieren Sie Zellen in einem Labor-Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für 4 h oder bis Zellen eingehalten haben gehalten.</li>
	<li>Änderung zu Phenol-rot freie Medien ergänzt je nach Bedarf, einschließlich Hitze-inaktivierten, Holzkohle Dextran abgestreift FBS Medienund fügen Sie gewünschte Behandlung. Die beschriebenen Experimente hinzugefügt Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM Dexamethason in 1 X PBS verdünnt. Legen Sie die 6-Well-Platten in einem Labor-Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten.</li>
	<li>Entfernen Sie Medien zu und ersetzen Sie durch neue Medien und Behandlung alle 48 h.</li>
	<li>Nach 24, 48 oder 72 Stunden Behandlung Zellen mit 1 mL 1 X PBS waschen und 500 µL Trypsin-EDTA in jede Vertiefung hinzufügen. Platz 6-Well-Platte im Inkubator bis Zellen von der Platte gelöst haben.</li>
	<li>Sobald Zellen von der Platte getrennt haben, fügen Sie 500 µL ergänzten Phenol-rot freien Medien, Trypsin zu deaktivieren.</li>
	<li>5 µL Trypan blau in einem separaten Rohr 5 µL der trypsiniert Zellen hinzufügen und Mischen von pipettieren.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen aus jedem Brunnen in zweifacher Ausfertigung mit einem automatisierten Zelle Zähler.</li>
	<li>Durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Bohrloch an jedem Zeitpunkt und Grundstück als Funktion der Zeit (Abbildung 3).</li>
</ol>

<ol><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester%3A+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li>
<li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+implantation+and+placentation%3A+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li>
<li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li>
<li>Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li>
<li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8%2FSVneo+Trophoblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li>
<li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li>
<li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li>
<li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line%2C+Swan+71%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li>
<li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Migration und Invasion Assays um die Rate der Zellproliferation als möglicher Beitrag zum gemessenen Unterschiede in der Trophoblast Zellbewegung erweitert. Diese in-vitro-Untersuchungen sind zusammen verwendet werden, einfache und effektive Methoden, die verwendet werden können, um die zelluläre Signalwege zu identifizieren, die Trophoblast Migration zu regulieren. Wie oben beschrieben, können Trophoblast Zellen Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren oder andere Moleküle...

Plazentar Entwicklung ist ein entscheidender Schritt bei der Einrichtung der Schwangerschaft Auswirkungen auf die Gesundheit von Müttern und fetalen. Allerdings ist die mechanistische Grundlage, dieser Vorgang wird, nicht vollständig verstanden. Zellmigration ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für die Errichtung und die Funktionen der Plazenta während der Schwangerschaft beiträgt. Nach Implantation der Blastozyste unterscheidet die Trophektoderm in Zotten Trophoblasten, die bedecken die Oberfläche der Chorionzotten und Gas- und Nährstoffaustausch beteiligt sind, und extravillous Trophoblasten (EVTs), die heraus von der Zotten migrieren und dringen in die mütterliche Decidua und Gefäßsystem1. Migration von der EVTs ist essentiell für mütterliche Spirale Arterien Umbau und Einrichtung uteroplazentalen Umlauf um fetale Wachstum2zu unterstützen. Unzureichende Trophoblast Invasion während der Schwangerschaft führt zu abnormalen plazentar Entwicklung und kann dazu beitragen, Komplikationen während der Schwangerschaft wie Präeklampsie, Schwangerschafts-Hypertonie, intrauterine Wachstumsretardierung und Frühgeburt3, 4. Daher ist es wichtig zu bestimmen, die Wege für normale Einpflanzung erforderlich, Verständnis der Faktoren, die Trophoblast Motilität zu beeinflussen.
Trophoblast Migration wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalmoleküle, einschließlich angiogenen Faktoren5, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Hormone gesteuert. Aufgrund der Einschränkungen des Studiums der Plazenta in-vivo verewigt in-vitro-Untersuchungen mit menschlichen Trophoblast Zellen Linien wurden entscheidend zur Identifizierung von Faktoren, die zu Trophoblast Motilität. Kratzer und Invasion Assays wurden ausgiebig zur quantitativ bewerten die Rolle einzelner Moleküle am Trophoblast Zelle Migration6,7,8. Jedoch während nützlich im Tandem zu untersuchen, wie Änderungen in der Migration durch Änderungen in Zelle Invasivität verursacht werden können, erklären diese beiden Tests nicht zusätzliche Mechanismen, die zu veränderten Zellwanderung beitragen können. Senkung der Rate der Zellproliferation können beispielsweise weniger Zellen zur Migration führen.
Hier beschreiben wir quantitative in-vitro-Methoden zur Bewertung der Trophoblast Migration mit Scratch, Zellproliferation und Zelle Invasion Assays. In der Scratch-Test eine einheitliche Wunde entsteht in einer Zelle monomolekularen Film, und die Wanderung von Zellen, die Lücke durch automatisierte, Time-Lapse Bildgebung der Wunde Größe und Dichte der Zellen in der Wunde gemessen. Die Zelle Verbreitung Assay basiert auf das Verhältnis von Zellen zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zu einer bekannten Ausgangspunkt Menge von Zellen berechnen. In der Zelle Invasion Assay Zellen sind auf eine extrazelluläre Matrix-beschichtete Zelle Kultur einfügen Kammer (z.B. Transwell) gesät, und die Anzahl der Zellen, die durch die extrazelluläre Matrix als Reaktion auf die Chemo-Lockstoff eindringen werden gezählt.
Der Scratch-Test ist ein einfaches und effektives Werkzeug, das verwendet wird, um festzustellen, wie die verschiedenen Umweltbedingungen beeinflussen Zellmigration. Die Proliferation und Invasion Assays können anschließend verwendet werden, um den Beitrag der Zellproliferation und Invasivität zu allgemeinen Änderungen in Zelle Migration zu bestimmen. Zusammen bieten diese Assays robuste Messungen der biologischen Prozesse, die zur Zelle Motilität beitragen können. Zwei verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien wurden im beschriebenen Assays, Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10verwendet. Allerdings können diese Tests auch für den Einsatz in anderen Zelltypen, wichtige Modulatoren der Zelle Migration und Invasion zu identifizieren optimiert werden.

<table><tbody><tr><td>0,4 % Trypanblau Fleck</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten-Transwell-Einsätze</td><td>Corning</td><td>3422</td><td>Enthält Polycarbonat-Filter mit einem 8 &mu; m Porengröße</td></tr><tr><td>Aktivkohle dextran-gestreift FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-119</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason (Dex; 1, 4-Pregnadien-9&alpha;-fluor-16&alpha;-methyl-11&beta;, 17, 21-triol-3,20-dion; &ge; 98% TLC)</td><td>Steraloide</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham" s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 24-Well-ImageLock-Platten</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>Wenn Sie das IncuCyte Zoom-Bildgebungssystem verwenden, säen Sie Zellen auf IncuCyte ImageLock-Platten. Diese Platten haben Passermarken an der Unterseite der Platte, die als Referenz für die wiederholte Bildgebung in einem konstanten Sichtfeld verwendet werden.</td></tr><tr><td>IncuCyte Software</td><td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM System</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td>Scratch Assay-Bilder wurden mit dem Preset " Kratzwunde" Parameter auf dem IncuCyte ZOOM-System. Es können auch andere Zeitraffermikroskope verwendet werden.</td></tr><tr><td>Matrigel Membran Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>Wachstumsfaktor reduziert, phenol-rot frei</td></tr><tr><td>Mikro-Objektträger</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverses</td><td>Mikroskop Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 & Mikro; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrotfreies DMEM/Ham's F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Halbautomatisches Wundmacherwerkzeug</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-tests zur bewertung der migration, invasion und proliferation von verewigt menschlichen ersttrimester-trophoblast zelllinien

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Zelle Bewegung ist eine wichtige Eigenschaft des Trophoblasten während plazentar Entwicklung und frühe Schwangerschaft. Die Bedeutung der richtigen Trophoblast Migration und Invasion zeigt Schwangerschaft Erkrankungen wie der Präeklampsie und intrauteriner Wachstumsretardierung, die mit unzureichenden Trophoblast Einmarsch in das mütterliche Gefäßsystem verbunden sind. Leider, unser Verständnis der Mechanismen, durch die die Plazenta von Migration entwickelt Trophoblasten ist begrenzt. In-vitro-Analyse der Zellwanderung über der Scratch-Test ist ein nützliches Werkzeug bei der Identifizierung von Faktoren, die Trophoblast wandernden Kapazität zu regulieren. Dieser Assay allein definiert jedoch nicht die Zellveränderungen, die veränderte Zelle Migration führen können. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene in-vitro-Untersuchungen, die gemeinsam verwendet werden, um Trophoblast Zelle Bewegung zu bewerten: der Scratch-Test, die Invasion-Assay und der Verbreitung Assay. Die hier beschriebenen Protokolle können auch für den Einsatz in anderen Zelllinien zur Quantifizierung der Zellbewegung in Reaktion auf Reize geändert werden. Diese Methoden können Forscher, einzelne Faktoren zu identifizieren, die dazu beitragen, die Zellbewegung und bieten eine gründliche Prüfung der möglichen Mechanismen, die offensichtlichen Veränderungen der Zellmigration.

Verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zell-Linien Sw.71 und HTR-8/SVneo dienten in diesen Experimenten um die Rolle von Glucocorticoiden in Trophoblast Zelle Migration12zu bestimmen. Glukokortikoide wurden in diesen Experimenten verwendet, als sie vor kurzem gezeigt worden, um Trophoblast Funktionen ändern obwohl alternative Behandlungen verwendeten12sein könnte. Beide Zelllinien wurden behandelt mit Fahrzeug (1 X PBS) oder 100 nM ...

Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Diese Methoden können verwendet werden, um Faktoren zu bestimmen, die Trophoblast Invasion beeinflussen, die Einblick in wichtige negative geburtshilfliche Ergebnisse bieten können. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie eine visuelle und quantitative Analyse mehrerer Faktoren bietet, die die Trophoblasteninvasion beeinflussen können, einschließlich Proliferation und Migration. Um den Kratztest zu beginnen, säen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in eine 24-Well-Platte, um 100% Zusammenfluss in 48 Stunden zu erreichen.Am nächsten Tag, ändern Sie die Medien auf phenolrote freie Medien mit Wärme inaktivierte Kohle dextran entfernt FBS ergänzt. Am Tag des Kratzers, fügen Sie die gewünschte Behandlung zu den Medien in jedem Brunnen, um die Zellen für 30 Minuten zu pziehen. Um gleichmäßige Wunden zu erzeugen, legen Sie sterile 10 Mikroliter Pipettenspitzen auf die Stifte des Wundmacherwerkzeugs.Senken Sie die Spitzen in die erste Reihe der Brunnen und bewegen Sie die Platte entlang der Spur des Wundmachers, bis die Pipettenspitzen die andere Seite des Brunnens erreichen. Dann bewegen Sie die Platte zurück in die Ausgangsposition, um eine konstante Wunde über den Durchmesser des Brunnens zu gewährleisten. Senken Sie die Spitzen in die nächste Reihe von Brunnen und wiederholen Sie, bis alle Brunnen zerkratzt sind.Bestätigen Sie, dass der Kratzer die Breite des Brunnens bedeckt, indem Sie die Platte unter dem Mikroskop beobachten. Als nächstes die Medien vorsichtig ansaugen und die Zellen zweimal mit 1x PBS vorsichtig waschen. Nach einer letzten Wäsche, fügen Sie ergänzt phenolrot frei abgestreift oder niedrige FBS-Medien mit einer gewünschten Behandlung.Als nächstes legen Sie die Platte mit den zerkratzten Brunnen in einem automatisierten Zeitraffer-Imager in einem Inkubator, der 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre enthält. Stellen Sie die Zellen in regelmäßigen Abständen nach Bedarf ab, damit die Zellen die Wundheilung abschließen können. Um den Invasionstest zu beginnen, säen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in Sechs-Brunnen-Platten in einem Inkubator, der 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält.Lassen Sie Zellen 90% Zusammenfluss in 48 Stunden erreichen. Am nächsten Tag, ändern Sie die Medien auf phenolrote freie Medien mit Wärme inaktivierte Kohle dextran entfernt FBS ergänzt. Eine Durchstechflasche mit 10 Milligramm pro Milliliter extrazelluläre Matrix in einen Kühlschrank auf Eis legen und über Nacht auftauen lassen.Verwenden Sie am Tag danach gekühlte Pipettenspitzen, um 10 Milligramm pro Milliliter der extrazellulären Matrix mit den phenolroten freien Serum-freien Medien auf eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu verdünnen. Dann 100 Milliliter der verdünnten extrazellulären Matrix zu gekühlten Einsätzen hinzufügen, die in die gekühlte 24-Well-Platte gelegt wurden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, damit die Matrix aushärten kann.Um Zellen für den Invasionstest vorzubereiten, waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 1x PBS. Dann aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 500 Mikroliter von 1x Trypsin EDTA zu jedem Brunnen. Legen Sie die Sechs-Brunnen-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält, bis alle Zellen von der Unterseite der Platte gelöst haben.Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie 500 Mikroliter des phenolroten freien Serums freien Medien zu jedem Brunnen der trypsinisierten Zellen hinzu. Dann 1.000 Mikroliter freigelöster Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr geben und fünf Minuten bei 400 mal g bei vier Grad Celsius nach unten drehen. Als nächstes die Medien ansaugen und die Zellen im phenolroten freien Serumfreie Medium wieder aussetzen.Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und passen Sie das Volumen der Zellsuspension für eine Endkonzentration von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter an. Fügen Sie 600 Mikroliter des gesamten Wachstumsmediums in jeden Brunnen der 24-Well-Platte und legen Sie den vorbeschichteten Einsatz hinein. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Zellen auf jedem vorbeschichteten Zelleinsatz für insgesamt 0,1 Millionen Zellen hinzu.Legen Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre für 24 Stunden hält. Nach der nächtlichen Inkubation die restlichen Medien aus den oberen und unteren Kammern ansaugen, ohne die extrazelluläre Matrix zu stören. Dann entfernen Sie vorsichtig die extrazelluläre Matrix und nicht eingedrungene Zellen aus dem oberen Teil der Einsätze mit einem Wattestäbchen.Waschen Sie jeden Einsatz dreimal, indem Sie 1x PBS sowohl in die oberen als auch in die unteren Kammern des Brunnens einbauen. PBS nach jeder Wäsche aspirieren. Um die an den Einsätzen befestigten Zellen zu fixieren, legen Sie die Einsätze 30 Minuten lang in 100% eiskaltes Methanol bei vier Grad Celsius.Waschen Sie Einsätze dreimal mit 1x PBS und entfernen Sie PBS nach der letzten Wäsche. Färben Sie die an den Einsätzen befestigten Zellen 10 Minuten lang mit 0,2% Kristallviolett in 20% Ethanol. Spülen Sie mit entionisiertem Wasser dreimal und aspirieren deionisiertes Wasser nach der letzten Wäsche.Lufttrockene Einsätze bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schließlich mit Zange und eine Rasierklinge, sorgfältig schneiden Sie die untere Membran des Einsatzes und montieren Sie es auf einem Glasschlitten mit der untere Seite nach oben. Mit einem Lichtmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv erhalten Sie mindestens vier einzigartige Bilder der eingedrungenen Zellen pro Probe.Um den Proliferationstest zu beginnen, verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die trypsinisierten Zellen aus dem Kolben zu zählen. Samenzellen in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von 0,2 Millionen Zellen pro Brunnen in Standard-Wachstumsmedien. Dann legen Sie Zellen in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre für vier Stunden oder bis zellen haftet gehalten.Als nächstes ändern Sie das Medium auf phenolrote freie Medien, ergänzt mit Wärme inaktivierten Holzkohle Dextran abgestreift FBS und gewünschte Behandlung. Legen Sie die Sechs-Brunnen-Platte in den Inkubator, die 37 Grad Celsius Temperatur und 5% Kohlendioxid bei 95% Luftfeuchtigkeit Atmosphäre hält. Dann ersetzen Sie die Medien durch die frischen Medien, die alle 48 Stunden mit der gewünschten Behandlung ergänzt werden.Nach 24, 48 oder 72 Stunden Behandlung, waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 1x 1x PBS und fügen Sie 500 Mikroliter Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzu. Legen Sie eine Sechs-Well-Platte in den Inkubator, bis sich die Zellen von der Platte gelöst haben. Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben, fügen Sie 500 Mikroliter der ergänzten phenolroten freien Medien hinzu, um Trypsin zu deaktivieren.Zum Schluss fünf Mikroliter der trypsinisierten Zellen zu fünf Mikroliter trypan Blue in einem separaten Rohr hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellenzähler, um Zellen aus jedem Brunnen in Duplikat zu zählen. Immortalized menschlichen ersten Trimester trophoblast Schwan.71 Zellen wurden für null, acht und 18 Stunden mit Fahrzeug 1x PBS oder 100 Mikromolar des synthetischen Glukokortikoiddztoxons im Kratztest behandelt. Messung der Wundgröße und der Wunddichte in Swan. 71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die mit Fahrzeug oder 100 nanomolar dex behandelt wurden, zeigten, dass die Dex-Behandlung die Rate des Wundverschlusses reduzierte, was darauf hindeutet, dass Glukokortikoide die Zellmigration hemmen könnten.Nach dem Invasionstest reduzierte die Glukokortikoid-Behandlung die Zellinvasivität, wie eine 15%ige Verringerung der Zahl der eingedrungenen Schwanen zeigt. 71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die 24 Stunden lang mit 100 nanomolarer Dex behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit dem Fahrzeug behandelt wurden. Nach dem Zellproliferationstest reduzierte die Glukokortikoid-Behandlung die Zellproliferation, wie sie durch weniger Swan angezeigt wird.71 und HTR-8/SVneo-Zellen, die mit 100 nanomolaren Dex behandelt wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit Fahrzeug behandelt wurden. Methoden zur Bewertung des Zelltodes könnten in Verbindung mit diesem Verfahren verwendet werden, um festzustellen, ob Apoptose oder Nekrose zu veränderten Trophoblastenfunktionen beitragen. Wir haben den Einsatz von Standardtechniken, die routinemäßig in der Krebsbiologie für die Untersuchung der Trophoblastenfunktion verwendet werden, auf einzigartige Weise übernommen.Mit diesen Methoden sind keine Gefahren verbunden. Die einzige Vorsichtsmaßnahme, die Der Betrachter treffen sollte, ist die Verwendung steriler Technik für die Gewebekultur.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

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In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

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Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

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Trophoblastenzellgewinnung aus Angiogenese-Röhrchenbildungsassay für die Analyse der Differenzierungsmarkerexpression

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Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Erfahren Sie In-vitro-Tests zur Bewertung von Migration, Invasion und Proliferation in verewigten menschlichen Ersttrimester-Trophoblast-Zelllinien. Diese Methoden ermöglichen visuelle und quantitative Analysen für die Geburtshilfeforschung.

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