Summary
L'obiettivo del presente protocollo è illustrare come indurre cluster stomi nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione di media contenenti zucchero e come osservare strutture intracellulari quali cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia in cluster utilizzando confocale microscopia laser.
Abstract
Stomatica movimento media lo scambio di gas della pianta, che è essenziale per la fotosintesi e traspirazione. Apertura e di chiusura stomatica sono compiute da un significativo aumento e diminuzione nel volume delle cellule di guardia, rispettivamente. Perché il servizio di trasporto di ioni e acqua avviene tra cellule di guardia e cellule epidermiche vicine più grandi durante il movimento stomatica, la distribuzione distanziata di stomi pianta è considerata una distribuzione ottimale per il movimento stomatica. Sistemi sperimentali per perturbare il modello distanziato di stomi sono utili per esaminare il significato del pattern spaziatura. Sono stati identificati diversi geni chiave associate alla distribuzione stomatica distanziata e stomi cluster possono essere sperimentalmente indotta alterando questi geni. In alternativa, gli stomi cluster possono essere anche indotta da trattamenti esogeni senza modificazione genetica. In questo articolo, descriviamo un sistema di induzione semplice per cluster stomi nei semenzali di Arabidopsis thaliana dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Il nostro metodo è facile ed è direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutante. Più grandi dei cloroplasti sono presentati come un marchio di garanzia biologico delle cellule delle cellule di guardia cluster indotta da saccarosio. Inoltre, un'immagine al microscopio confocale rappresentativa dei microtubuli corticali è indicata come un esempio dell'osservazione intracellulare delle cellule di guardia in cluster. L'orientamento radiale dei microtubuli corticali è mantenuto in cluster cellule di guardia come nelle cellule di guardia distanziate in condizioni di controllo.
Introduction
Lo stoma di pianta è un organo essenziale per lo scambio di gas per la fotosintesi e traspirazione, e movimento stomatica è compiuto dai cambiamenti significativi nelle cellule di guardia attraverso l'assorbimento dello ione-driven e rilascio di acqua. Sotto un microscopio, possiamo osservare un modello di distribuzione distanziati di stomi sulle superfici delle foglie e steli. Questa distribuzione distanziata di stomi è considerata per aiutare il movimento stomatica, che è regolata da scambio di acqua e ioni tra cellule di guardia e vicine cellule epidermiche1,2. Sistemi ad induzione sperimentale per cluster stomi sono utili per indagare l'importanza della distribuzione distanziata di stomi.
È stato segnalato che spatial clustering di stomi può essere indotta da modificazioni genetiche di geni chiave per la differenziazione delle cellule di guardia3,4 o il trattamento con un composto chimico5. Abbiamo anche riferito che il trattamento ad immersione con una soluzione media completati con zuccheri tra cui saccarosio, glucosio, e fruttosio causato stomatica clustering in cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine6. Callosio ridotta in nuove pareti cellulari che separa meristemoids e cellule epidermiche è stata osservata nell'epidermide saccarosio-trattati cotiledone, suggerendo che il saccarosio soluzione immersione trattamento colpisce negativamente la parete cellulare, che impedisce la fuoriuscita e azione ectopica dei prodotti del gene chiave per la differenziazione delle cellule di guardia (ad es. fattori di trascrizione) verso adiacente epidermica cellule6. Un meccanismo simile è stato suggerito da studi sulla gsl8/chor mutanti7,8. Il nostro sistema sperimentale per induzione riproducibile di stomi cluster utilizzando soluzione Media contenente saccarosio è abbastanza facile ed economico. Può anche essere utilizzato per indagare le strutture intracellulari come organelli e il citoscheletro nelle cellule di guardia del cluster quando applicato a linee transgeniche che esprimono marcatori fluorescenti che etichetta strutture intracellulari9, 10.
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Protocol
1. preparazione della soluzione medio 3% contenenti saccarosio Murashige 1/2-Skoog
- Aggiungere 1,1 g di sali medi Murashige-Skoog e 15 g di saccarosio in un becher.
- Aggiungere 490 mL di acqua distillata e miscelare bene utilizzando una barra per l'agitazione.
- Regolare il pH a 5,8 utilizzando KOH.
- Diluire a 500 mL con acqua distillata e trasferire la soluzione in una bottiglia di media.
- Sterilizzare la soluzione in autoclave (121 ° C, 20 min). Se non utilizzato immediatamente, questa soluzione può essere conservata a 4 ° C dopo la sterilizzazione.
2. induzione di cluster stomi da contenenti saccarosio immersione media di solubilizzazione
- Sterilizzare i semi.
- Preparare la soluzione di sterilizzazione aggiungendo 500 µ l di cloro attivo 5% soluzione di NaClO e 1 µ l di 10% Triton X-100 per acqua sterile di 500 µ l.
- Posto ca. 50 transgenici semi di a. thaliana portando un marcatore fluorescente come CT-GFP11 o GFP-TUB612 in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di etanolo 70% e mescolare bene capovolgendo cinque volte. Lasciare agire per 1 min.
- I semi affonderanno alla parte inferiore del tubo. Su un banco pulito, delicatamente rimuovere l'etanolo al 70% utilizzando una micropipetta e aggiungere 1 mL di soluzione di sterilizzazione. Mescolare bene capovolgendo cinque volte e lasciare per 5 min.
- Lavare i semi. Ancora lavorando in condizioni asettiche, un banco pulito, delicatamente rimuovere la soluzione utilizzando una micropipetta e aggiungere 1 mL di acqua sterile. Ripetere questo passaggio cinque volte.
- Aggiungere 1,5 mL di sterilizzata 3% saccarosio-1/2 Murashige-Skoog medie soluzione contenente in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti su un banco pulito.
- Aggiungere due semi sterilizzati in ciascun pozzetto. Nastro il coperchio sulla piastra 24 pozzetti utilizzando due strati di parafilm.
- Trasferire la piastra a 24 pozzetti a un set di camera di crescita a 23,5 ° C con un ciclo luce-buio 12-h/12-h utilizzando 100 µmol m− 2 s− 1 bianco luce e incubare per 14 giorni.
3. microscopica osservazione di stomi cluster
- Posto 30 µ l di 3% contenenti saccarosio di 1/2 Murashige-Skoog soluzione medio da un pozzetto della piastra 24-pozzo al centro del vetrino (dimensioni: 76 × 26 mm, spessore: 1.0-1.2 mm).
- Rimuovere un cotiledone da un semenzale di 14-giorno-vecchio usando le forbici per dissezione. Galleggiante il cotiledone con il lato di osservazione rivolta verso l'alto la goccia di soluzione.
- Preparare il campione di cotiledone seguendo il nostro metodo precedente13. Essenzialmente, porre 30 µ l della soluzione al centro di una copertura in vetro (dimensioni: 18 × 18 mm, spessore: 0.12-0.17 mm). Capovolgere il vetro di copertura e posizionarlo sul cotiledone delicatamente. Togliere il tampone in eccesso con un panno privo di lanugine.
- Impostare un esemplare sul palco di un microscopio confocale e selezionare cluster cellule di guardia per osservazione usando illuminazione in campo chiaro.
- Acquisire immagini confocal di strutture intracellulari fluorescente etichettati secondo le istruzioni del produttore del microscopio.
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Representative Results
Qui, è stato presentato il protocollo per un semplice metodo di induzione stomatica clustering con soluzione Media contenente saccarosio nei semenzali di a. thaliana . Le cellule di guardia cluster coltivate in soluzione Media contenente saccarosio (Figura 1B) hanno più grandi cloroplasti di guardia le cellule coltivate in condizioni di controllo privo di saccarosio (Figura 1A). L'allargamento dei cloroplasti è stata confermata con CT-GFP11, un marcatore di stroma del cloroplasto e clorofilla autofluorescenza (Figura 1C-F), suggerendo che il trattamento di saccarosio ha provocato nell'accumulazione di grano di amido nella cloroplasti tramite saccarosio soluzione l'assorbimento. Inoltre, confocale osservazione di GFP-TUB612 ha rivelato che i microtubuli corticali erano radialmente orientati anche in saccarosio-cluster guard cellule trattate, come quelli in cellule di guardia distanziate in condizioni di controllo privo di saccarosio (Figura 2). Queste osservazioni suggeriscono che le cellule di guardia cluster indotta da saccarosio hanno un orientamento normale per i microtubuli corticali e cellulosa microfibrils per consentire l'apertura stomatica in risposta a stimoli ambientali9.
Figura 1 : Cloroplasti nelle cellule di guardia cluster trattati con soluzione Media contenente saccarosio. Campo luminoso (A, B), marcatore di stroma del cloroplasto CT-GFP (C, D)e clorofilla autofluorescenza (E, F) immagini di guardia le cellule coltivate in condizioni di saccarosio di condizioni (A, C, E) e 3% di controllo senza zucchero (B, D, F). Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Corticali microtubuli in cellule di guardia cluster trattati con soluzione di saccarosio. Condizioni di microtubuli corticali etichettati con GFP-TUB6 di guard cells nel controllo senza zucchero (A) e cluster cellule di guardia in 3% di saccarosio (B). Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo presentato protocolli per l'induzione di stomi cluster in a. thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione Media contenente saccarosio. Come mostrato qui, questo metodo è molto semplice e non richiede nessuna abilità specializzata ma efficiente può indurre gli stomi cluster. Oltre il 45% delle cellule di guardia sono raggruppati con 3% saccarosio-contenente soluzione medio (valori medi di più di 20 osservazioni indipendenti)6. Inoltre, questo sistema sperimentale può essere applicato direttamente alle linee transgeniche o mutante come illustrato per linee transgeniche che esprimono CT-GFP (Figura 1) o GFP-TUB6 (Figura 2). Anche se solo immagini di snapshot vengono visualizzate qui, sarebbe anche possibile effettuare osservazioni sequenze temporali durante lo sviluppo stomatico.
Si noti che questo metodo si basa su un trattamento artificiale esogene, quindi non possiamo escludere la possibilità che fenomeni che non sono direttamente correlati alla distribuzione stomatica sono causati dal trattamento ad immersione soluzione di saccarosio. Infatti, i cloroplasti delle cellule di guardia sono allargati dal trattamento (Figura 1). Questo potrebbe essere dovuto ad accumulo di grano di amido nell'assorbimento dei cloroplasti tramite saccarosio soluzione. Inoltre, una più piccola apertura stomatica è stata osservata in cellule di guardia cluster indotta da saccarosio9, suggerendo che lo stress saccarosio-mediata iperosmotico soppressa apertura stomatica. Tuttavia, l'orientamento radiale dei microtubuli corticali è stata mantenuta (Figura 2). Inoltre, l'apertura stomatica delle cellule di guardia del cluster aumenta significativamente in risposta al trattamento di fusicoccin, come nel caso di stomi distanziati9. Quindi, anche se sarà necessario giudicare attentamente se questo sistema sperimentale modello è utile a seconda del tuo scopo di ricerca, il nostro sistema fornirebbe informazioni penetranti riguardanti la relazione tra distribuzione stomatica e risposta.
Come accennato nell'introduzione, zucchero soluzione trattamento potrebbe diminuire l'integrità della parete cellulare, con conseguente perdita dei prodotti del gene chiave per la differenziazione stomatica (ad es. fattori di trascrizione) alle cellule epidermiche adiacenti. Partiamo dal presupposto che la localizzazione ectopica indotta da saccarosio di questi prodotti genici causa cluster stomi. Tuttavia, questa ipotesi di lavoro non è sufficientemente supportata da prove biologiche molecolari. Screening per zucchero-insensibile mutanti sarebbe un modo promettente per chiarire i meccanismi molecolari sottostanti zucchero indotta da soluzione di clustering stomatica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Prof. ssa Seiichiro Hasezawa per il suo gentile sostegno del nostro lavoro. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHgrant numeri 17K 19380 e 18 H 05492, dalla Fondazione per una sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base Sumitomo concede numero 160146 e la Canon Foundation di T.H. Questo sistema sperimentale è stato sviluppato sotto un sostegno finanziario dal numero di pagine JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Ringraziamo Robbie Lewis, MSc, dal gruppo di Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di una brutta copia del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
