Summary
Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan å indusere gruppert stomata i cotyledons av Arabidopsis thaliana frøplanter av nedsenking behandling med en sukker inneholder middels løsning og observere intracellulær strukturer som chloroplasts og piskehale som henger i de grupperte cellene med AC confocal laser mikroskopi.
Abstract
Øverst bevegelse formidler anlegget gassutveksling, som er avgjørende for fotosyntesen og transpirasjon. Øverst åpning og lukking gjøres ved en betydelig økning og nedgang i vakt celle volum, henholdsvis. Fordi skyttel ioner og vann oppstår mellom celler og større nærliggende epidermal celler under øverst bevegelse, anses linjeavstand fordelingen av anlegget stomata en optimal fordeling for øverst bevegelse. Eksperimentell systemer for perturbing linjeavstand mønster av stomata er nyttige å undersøke avstand mønsterets betydning. Flere viktige gener tilknyttet den linjeavstand øverst fordelingen er identifisert, og klynger stomata kan eksperimentelt indusert ved å endre disse genene. Alternativt kan gruppert stomata også indusert ved eksogene behandlinger uten genmodifisering. I denne artikkelen beskriver vi en enkel induksjon system for grupperte stomata i Arabidopsis thaliana planter av nedsenking behandling med en sukrose inneholder middels løsning. Vår metode er enkelt og direkte gjelder transgene eller mutant linjer. Større chloroplasts presenteres som en celle biologiske kjennetegner sukrose-indusert gruppert celler. I tillegg vises et representativt AC confocal mikroskopiske bilde kortikale piskehale som henger som et eksempel på intracellulær observasjon av gruppert celler. Radial retningen kortikale piskehale som henger opprettholdes i grupperte celler som spredte celler i kontroll forhold.
Introduction
Anlegget stomi er et viktig organ for gassutveksling for fotosyntesen og transpirasjon øverst bevegelse oppnås ved betydelige endringer i celler gjennom ion-drevet opptak og flushing. Under et mikroskop, kan vi observere en avstand fordelingsmønster av stomata på overflater av blader og stengler. Linjeavstand distribusjonen av stomata anses å øverst bevegelse, som er regulert av ion og vann utveksling mellom celler og nabolandet epidermal celler1,2. Eksperimentell induksjon systemer for grupperte stomata er nyttige for å undersøke betydningen av linjeavstand distribusjon av stomata.
Det har blitt rapportert at romlig klynging av stomata kan indusert ved genmodifisering av viktige gener for vakt cellen differensiering3,4 eller behandling med kjemisk sammensatte5. Vi rapporterte også at nedsenking behandling med en middels løsning supplert med sukker inkludert sukrose, glukose, og fruktose forårsaket øverst klynging i cotyledons Arabidopsis thaliana frøplanter6. Redusert callose i ny cellen vegger skille meristemoids og epidermal celler ble observert i sukrose-behandlet cotyledon overhuden, antyder at sucrose løsning nedsenking behandling negativt påvirker cellen vegg, som hindrer lekkasje og ektopisk handling av nøkkel genprodukter for vakt celledifferensiering (f.eks transkripsjonsfaktorer) mot tilstøtende epidermal cellene6. En tilsvarende ordning ble foreslått fra studier på gsl8/chor mutanter7,8. Vår eksperimentelle system for reproduserbar induksjon av klyngede stomata bruker sukrose inneholder middels løsning er ganske enkelt og billig. Det kan også brukes til å undersøke intracellulær strukturer som organeller og cytoskeleton i de grupperte cellene når transgene linjer uttrykke fluorescerende markører som etiketten intracellulær strukturer9, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av 3% sukrose inneholder 1/2 Murashige-Skoog middels løsning
- Legge til 1.1 g av Murashige-Skoog middels salter og 15 g sukrose et beger.
- Legg 490 mL destillert vann og bland godt med en røre bar.
- Justere pH til 5,8 bruker KOH.
- Fortynne til 500 mL med destillert vann og overføre løsningen i en middels flaske.
- Sterilisere løsningen av autoklavering (121 ° C, 20 min). Hvis ikke brukes umiddelbart, kan denne løsningen holdes på 4 ° C etter sterilisering.
2. induksjon av klyngede Stomata av sukrose inneholder middels løsning nedsenking behandling
- Sterilisere frøene.
- Forberede sterilisering løsningen ved å legge 500 µL av 5% aktiv klor NaClO løsningen og 1 µL av 10% Triton X-100 til 500 µL sterilt vann.
- Sett ca. 50 transgene A. thaliana frø bærer en fluorescerende markør som CT-GFP11 eller GFP-TUB612 i en 1.5-mL tube.
- Legg 1 mL av 70% etanol løsning og bland godt ved å snu fem ganger. La for 1 min.
- Frøene vil synke å bunnen av røret. På en ren benk, forsiktig fjerne 70% etanol ved hjelp av brønnene, og legger 1 mL av sterilisering løsning. Bland godt invertere fem ganger og la stå i 5 minutter.
- Vask frøene. Fremdeles arbeider under aseptiske forhold på en ren benk, forsiktig fjerne løsningen bruker brønnene, og legger 1 mL steril vann. Gjenta dette trinnet fem ganger.
- Legge til 1,5 mL sterilisert 3% sukrose inneholder 1/2 Murashige-Skoog middels løsning i hver brønn av en 24-vel plate på en ren benk.
- Legge til to sterilisert frø i hver brønn. Tape lokket på 24-vel plate med to lag med parafilm.
- Overføre 24-vel platen et vekst kammer sett på 23,5 ° C med en 12-h/12-h lys og mørke syklus med 100 µmol m2 s−1 hvite lyset og ruge i 14 dager.
3. mikroskopiske observasjon av klyngede Stomata
- Sted 30 µL av 3% sukrose inneholder 1/2 Murashige-Skoog middels løsning fra brønn av 24-vel plate på midten av et glass lysbilde (størrelse: 76 × 26 mm, tykkelse: 1.0-1.2 mm).
- Fjerne en cotyledon fra en 14 dager gamle frøplante med dissecting saks. Flyt i cotyledon med observasjon siden vendt opp på løsning drop.
- Forberede cotyledon prøven i henhold til vår tidligere metoden13. I hovedsak sted 30 µL av løsningen på midten av et cover glass (størrelse: 18 × 18 mm, tykkelse: 0,12-0,17 mm). Snu dekket glasset opp ned og plassere den på cotyledon forsiktig. Tørk av overflødig buffer med en lofri vev.
- Angi en prøve på scenen av AC confocal laser mikroskop og velg gruppert celler for observasjon med lyse feltet belysning.
- Erverve AC confocal bilder av fluorescently merket intracellulær strukturer i henhold til mikroskopet produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presentert protokollen for en enkel metode for å indusere øverst klynger med sukrose inneholder middels løsning i A. thaliana frøplanter. De grupperte cellene dyrket i sukrose inneholder middels løsning (figur 1B) har større chloroplasts enn celler dyrket i sukrose-free kontroll forhold (figur 1A). Utvidelsen av chloroplasts ble bekreftet med CT-GFP11, chloroplast stroma markør og klorofyll autofluorescence (figur 1C-F), tyder på at sukrose behandlingen resulterte i stivelse korn akkumulering i den Chloroplasts via sucrose løsning opptak. I tillegg avslørte AC confocal observasjon av GFP-TUB612 at kortikale piskehale som henger var radielt orientert selv i sukrose-behandlet gruppert celler, som de i spredte celler i sukrose-free kontroll forhold (figur 2). Disse observasjonene foreslår at de sukrose-indusert gruppert cellene har en normal retning for kortikale piskehale som henger og cellulose microfibrils aktivere øverst åpning svar på miljømessige stikkordene9.
Figur 1 : Chloroplasts i grupperte celler behandlet med sukrose inneholder middels løsning. Lysende felt (A, B), chloroplast stroma markør CT-GFP (C, D)og klorofyll autofluorescence (E, F) bilder av celler dyrket i sukkerfri kontroll (A, C, E) og 3% sukrose forhold (B, D, F). Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Kortikale piskehale som henger i grupperte celler behandlet med sucrose løsning. Kortikale piskehale som henger merket med GFP-TUB6 guard cells i sukkerfri kontroll (A) og gruppert celler i 3% sukrose forhold (B). Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presentert protokoller for induksjon av klyngede stomata i A. thaliana seedlings av nedsenking behandling med en sukrose inneholder middels løsning. Som vist her, denne metoden er veldig enkelt og krever ingen spesialisert kompetanse men effektivt kan indusere gruppert stomata. Mer enn 45% av celler klynger med 3% sukrose inneholder middels løsning (mener verdier av mer enn 20 uavhengige observasjoner)6. Videre kan eksperimentell systemet brukes direkte til transgene eller mutant linjer som vises for transgene linjer uttrykke CT-GFP (figur 1) eller GFP-TUB6 (figur 2). Selv om bare øyeblikksbilder vises her, ville det også være mulig å utføre gang-sekvensiell observasjoner under øverst utvikling.
Merk at denne metoden er basert på en kunstig exogeneous behandling, så vi ikke kan utelukke muligheten for at fenomener som ikke er direkte relatert til øverst distribusjon er forårsaket av sukrose løsning nedsenking behandling. Faktisk er vakt celle chloroplasts forstørret ved behandling (figur 1). Dette kan skyldes stivelse korn akkumulering i chloroplasts via sucrose løsning opptaket. I tillegg ble en mindre øverst blenderåpning observert i sukrose-indusert gruppert celler9, antyder at sukrose-mediert hyperosmotic stress undertrykt øverst åpning. Radial retningen kortikale piskehale som henger ble imidlertid opprettholdt (figur 2). I tillegg øker øverst blenderåpning gruppert vakt cellene betraktelig i respons til fusicoccin behandling, som i tilfelle av linjeavstand stomata9. Dermed, selv om det blir nødvendig å nøye vurdere om eksperimentell modell systemet er nyttig avhengig av din forskningsformål, systemet ville gi innsiktsfulle informasjon om forholdet mellom øverst distribusjon og svar.
Som nevnt i innledningen, kan sukker løsning behandling redusere cellevegg integritet, som resulterer i lekkasje av nøkkel genprodukter for øverst differensiering (f.eks transkripsjonsfaktorer) til tilstøtende epidermal celler. Vi antar at den sukrose-indusert ektopisk lokaliseringen av produktene genet fører gruppert stomata. Men støttes denne arbeidsgruppen hypotesen ikke tilstrekkelig av molekylære biologiske bevis. Screening for sukker-ufølsom mutanter ville være en lovende måte å avklare molekylære mekanismer underliggende sukker løsning-indusert øverst klynger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Prof Seiichiro Hasezawa slag underhold av vårt arbeid. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHgrant nummer 17K 19380 og 18 H 05492, fra Sumitomo stiftelsen for stipend for grunnleggende vitenskap prosjekter gir flere 160146 og Canon stiftelsen å th Eksperimentell systemet ble utviklet under en økonomisk støtte fra nummeret Javaserver KAKENHgrant 26891006 til K. A. Vi takker Robbie Lewis, MSc, fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) for å redigere et utkast av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
