Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

Zusammenfassung

Germinant Rezeptor-Proteine-Cluster in "Germinosomes" in der inneren Membran der Bacillus Subtilis Sporen. Wir beschreiben ein Protokoll mit Superresolution Mikroskopie und Leuchtstoffröhren Reporter Proteine, um Germinosomes zu visualisieren. Das Protokoll zeigt auch Spore innere Membrandomänen, die bevorzugt mit dem Membran-Farbstoff FM4-64 gefärbt sind.

Zusammenfassung

Die geringe Größe der Sporen und der relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, Schwierigkeiten in ihrer mikroskopischen Analysen mittels Epifluoreszenz Mikroskopie. Höchstauflösung dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein viel versprechendes Instrument, diese Hürde zu überwinden und die molekularen Details den Prozess der Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) zeigen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer modifizierten SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging-Prozess und fluoreszierende Reporter Proteine für SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Sporen Germinosomes, Transaktionskonflikten der Keimung Proteine. Außerdem präsentieren wir ein (standard) 3D-SIM bildgebendes Verfahren für FM4-64 Färbung von B. Subtilis Sporen Membranen. Mithilfe dieser Verfahren wir unübertroffene Auflösung für die Lokalisierung der Germinosome erhalten und zeigen, dass > 80 % der B. Subtilis KGB80 Sporen nach der Sporenbildung auf definierten minimalen MOPS Medium erhalten haben, ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte. Helle Herde waren auch bei FM4-64 gefärbten Sporen 3D-SIM Bilder darauf hindeutet, dass innere Membran Lipid Domänen wahrscheinlich unterschiedliche Flüssigkeit vorhanden sein. Sind weitere Studien, mit denen doppelte Kennzeichnung Verfahren mit Membran Farbstoffe und Germinosome Reporter Proteine Co Lokalisierung zu bewerten und erhalten so einen optimalen Überblick über die Organisation des Bacillus Keimung Proteine in der inneren Spore-Membran möglich.

Einleitung

Sporen der Aufträge Bacillales und Clostridiales sind metabolisch ruhenden und außerordentlich widerstandsfähig gegen raue Dekontamination Regime, aber es sei denn, sie Keimen, können nicht dazu führen, dass schädliche Auswirkungen im Menschen¹. In nährstoffreichen germinant ausgelöste Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) ist die Einleitung Veranstaltung germinant Bindung an germinant Rezeptoren (GRs) befindet sich in der Spore innere Membran (IM). Anschließend transduzieren die GRs Signale an den SpoVA-Kanal-Protein befindet sich auch in der IM. Dies führt bei der Entstehung des Austauschs von Spore Kern Pyr....

Protokoll

1. B. Subtillis Sporenbildung (Timing: 7 Tage vor der mikroskopischen Beobachtung)

1. Tag1
   1. Eine Bakterienkultur auf ein Luria-Bertani Brühe (LB) Agar-Platte (1 % Tryptone, Hefeextrakt 0,5 %, 1 % NaCl, 1 % Agar)¹³ Streifen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, einzelne Kolonien zu erhalten. Verwenden der B. Subtilis -KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze, GerD-Gfp kan) Stamm und seinen Hintergrund Elternstamm B. Subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) bereits⁷beschrieben.
      Hinweis: Der Einsatz von Sporen mit <....

Ergebnisse

Das aktuelle Protokoll stellt ein SIM-Mikroskop bildgebendes Verfahren für bakterielle Sporen. Die Sporenbildung und Folie Vorbereitung Verfahren wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 gezeigt, vor der Bildgebung. Später wurden die Bildverarbeitung und Analyse Verfahren angewandt sowohl für dim (fluoreszierendes Protein mit der Bezeichnung Keimung Proteine) und hell (lipophile Sonde IM gebeizt) Spore zu Proben, wie im folgenden Text dargestellt.

Diskussion

Das Protokoll präsentiert enthält ein standard-3D-SIM-Verfahren zur Analyse von FM4-64 gebeizt B. Subtilis Sporen, die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und bildgebende Verfahren enthält. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine modifizierte SIMcheck (ImageJ)-unterstützt 3D imaging-Prozess für die SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Spore Germinosomes beschriftet mit fluoreszierenden Reportern. Die letztere Vorgehensweise konnten wir diese dim Unterkonstruktion mit verbesserten Kontrast zu beobachten. D.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Luftgetrocknete Glasobjektträger	Menzel Glä ser	630-2870
APO TIRF N20R8 100&faches Ölobjektiv (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, Δ cotE::tet)
Erlenmeyerkolben 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyerkolben 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres carboxylatmodifizierte Mikrosphären	Invitrogen, 0,1 μ m	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz nichtionischer Dichtegradient mittel	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD-Kamera	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
Mikrofuge-Röhrchen 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3451PK
Mikroskop-Bildgebungssoftware	Nikon, Japan	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure deminerilziertes	Wasser Millipore Milli-Q	IQ 7003
Nikon Eclipse Ti Mikroskop
Polypropylen Schraubverschlussflasche 180 mL	Thermo Fisher Scientific	75003800
Präzisions-Deckgläser	Paul Marienfeld	117650
Röhrchen mit rundem Boden 15 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
Röhrchen mit Schraubverschluss 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM