Method Article

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

DOI:

10.3791/59388

⸱

April 15th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Germinant Rezeptor-Proteine-Cluster in "Germinosomes" in der inneren Membran der Bacillus Subtilis Sporen. Wir beschreiben ein Protokoll mit Superresolution Mikroskopie und Leuchtstoffröhren Reporter Proteine, um Germinosomes zu visualisieren. Das Protokoll zeigt auch Spore innere Membrandomänen, die bevorzugt mit dem Membran-Farbstoff FM4-64 gefärbt sind.

Abstract

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Die geringe Größe der Sporen und der relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, Schwierigkeiten in ihrer mikroskopischen Analysen mittels Epifluoreszenz Mikroskopie. Höchstauflösung dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein viel versprechendes Instrument, diese Hürde zu überwinden und die molekularen Details den Prozess der Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) zeigen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer modifizierten SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging-Prozess und fluoreszierende Reporter Proteine für SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Sporen Germinosomes, Transaktionskonflikten der Keimung Proteine. Außerdem präsentieren wir ein (standard) 3D-SIM bildgebendes Verfahren für FM4-64 Färbung von B. Subtilis Sporen Membranen. Mithilfe dieser Verfahren wir unübertroffene Auflösung für die Lokalisierung der Germinosome erhalten und zeigen, dass > 80 % der B. Subtilis KGB80 Sporen nach der Sporenbildung auf definierten minimalen MOPS Medium erhalten haben, ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte. Helle Herde waren auch bei FM4-64 gefärbten Sporen 3D-SIM Bilder darauf hindeutet, dass innere Membran Lipid Domänen wahrscheinlich unterschiedliche Flüssigkeit vorhanden sein. Sind weitere Studien, mit denen doppelte Kennzeichnung Verfahren mit Membran Farbstoffe und Germinosome Reporter Proteine Co Lokalisierung zu bewerten und erhalten so einen optimalen Überblick über die Organisation des Bacillus Keimung Proteine in der inneren Spore-Membran möglich.

Introduction

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Sporen der Aufträge Bacillales und Clostridiales sind metabolisch ruhenden und außerordentlich widerstandsfähig gegen raue Dekontamination Regime, aber es sei denn, sie Keimen, können nicht dazu führen, dass schädliche Auswirkungen im Menschen1. In nährstoffreichen germinant ausgelöste Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) ist die Einleitung Veranstaltung germinant Bindung an germinant Rezeptoren (GRs) befindet sich in der Spore innere Membran (IM). Anschließend transduzieren die GRs Signale an den SpoVA-Kanal-Protein befindet sich auch in der IM. Dies führt bei der Entstehung des Austauschs von Spore Kern Pyridin-2,6-dicarboxylic Säure (Dipicolinic Säure; DPA; bestehend aus 20 % der Spore Kern trocken wt) für Wasser über den SpoVA Kanal. Anschließend die DSG-Version löst die Aktivierung der Hirnrinde Peptidoglycan Hydrolyse und zusätzliche Wasseraufnahme folgt2,3,4. Diese Ereignisse führen zu mechanischen Belastungen auf die Schichten, seine spätere Ruptur, Beginn der Auswuchs und schließlich vegetative Wachstum. Die genauen molekularen Details der Keimungsprozess werden jedoch noch weit von aufgelöst.

Eine wichtige Frage zu Spore Keimung betrifft die biophysikalischen Eigenschaften der Lipide IM Keimung Proteine sowie die IM SpoVA-Kanal-Proteine. Diese weitgehend unbeweglich IM Lipid Bilayer ist die wichtigste Permeabilitätsbarriere für viele kleine Moleküle, einschließlich giftige chemische Konservierungsmittel, von die einige ihr Handeln in die Spore Kern oder vegetativen Zelle Zytoplasma5,6ausüben. IM Lipid Bilayer dürfte in einem Gel-Zustand gibt es zwar ein erheblicher Anteil der mobilen Lipide in der IM5. Die Spore IM hat auch das Potenzial für signifikante Erweiterung5. Somit erhöht sich die Fläche der IM 1,6-fache bei der Keimung ohne zusätzliche Membran Synthese und geht einher mit dem Verlust dieser Membran charakteristische niedrige Permeabilität und Lipid Unbeweglichkeit5,6.

Während die molekularen Details der Aktivierung von Proteinen, Keimung und Organisation IM Lipide in Sporen sind attraktive Themen für das Studium, Herausforderung die geringe Größe von B. Subtilis Sporen und die relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, eine mikroskopische Analysen. Griffiths Et Al. zwingende Beweise dafür Epifluoreszenz Mikroskop, mit fluoreszierenden Reporter verschmolzen zu Keimung Proteine, legt nahe, dass das Gerüst Protein GerD B. Subtilis Sporen drei GR-Untereinheiten (A, B und C) für GerA, B und K GRs organisiert, in einer Cluster-7. Sie prägte den Begriff "Germinosome" für diesen Cluster der Keimung Proteine und die Strukturen als ~ 300 nm großen IM Protein Brennpunkte8beschrieben. Bei der Initiation der Spore Keimung, fluoreszierende Germinosome Brennpunkte letztlich verwandeln sich in größeren disperse fluoreszierende Muster mit > 75 % der Spore Bevölkerungen Anzeigen dieses Muster in Sporen gekeimt für 1 h mit L-Valin-8. Beachten Sie, dass das Papier oben verwendeten genannten Bilder aus Dutzenden von aufeinander folgenden fluoreszierenden Bilder gemittelt, um statistische Aussagekraft gewinnen und die Hürde niedrig fluoreszierende Signale beobachtet während der Bildgebung. Diese Visualisierung dieser Strukturen in Bakteriensporen war am Rande des technisch mit klassischen mikroskopischen Tools und weder eine Bewertung der Höhe der Herde in einem einzigen Spore Machbaren auch ihre ausführlichere subzelluläre Lokalisation mit diesem Ansatz möglich.

Hier zeigen wir den Einsatz von strukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM), eine detaillierte Visualisierung zu erhalten und Quantifizierung der Germinosome(s) in Sporen von B. Subtilissowie ihre IM Lipid Domänen9. Das Protokoll enthält auch Anleitungen für die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und Bildanalyse von SIMcheck (v1. 0, eine ImageJ-Plugin) sowie ImageJ10,11,12.

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Protocol

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1. B. Subtillis Sporenbildung (Timing: 7 Tage vor der mikroskopischen Beobachtung)

  1. Tag1
    1. Eine Bakterienkultur auf ein Luria-Bertani Brühe (LB) Agar-Platte (1 % Tryptone, Hefeextrakt 0,5 %, 1 % NaCl, 1 % Agar)13 Streifen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, einzelne Kolonien zu erhalten. Verwenden der B. Subtilis -KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze, GerD-Gfp kan) Stamm und seinen Hintergrund Elternstamm B. Subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) bereits7beschrieben.
      Hinweis: Der Einsatz von Sporen mit ΔcotEΔgerE Hintergrund ist in Germinosome Visualisierung, um die Autofluoreszenz des Spore Mantel Schichten7zu minimieren.
    2. Sterilisieren Sie alle Medien, Rohre, Mehrkanalpipette und andere Kultur-Materialien mit geeigneten Methoden verwendet werden.
  2. Tag2
    1. Impfen Sie eine einzige Kolonie in 5 mL LB-Medium in den frühen Morgenstunden zu und inkubieren Sie die Kultur unter ständige Unruhe in einem Schraubverschluss Rohr bei 200 u/min/min und 37 ° C, bis die OD600 0,3-0,4 (ca. 7 h) erreicht.
    2. 500 mL MOPS Medium (pH 7,5) zu machen, enthält 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O 0,276 mM K2SO4, 0,01 mM FeSO4·7H2O 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-Glukose-Monohydrat und 10 mM NH4Cl.
    3. Schraubverschluss Röhren 10-1- 10-7 Verdünnungsreihen der LB-Kultur in 5 mL MOPS Medium vorbereiten und die Kulturen über Nacht unter ständigen Unruhe bei 200 u/min/min und 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Die serielle Verdünnungen hier wollen eine Verdünnung in frühen exponentielle Phase am nächsten Morgen zu gewinnen. Diesen und den nächsten Schritt sind erforderlich, damit die Zellen zur Anpassung an den MOPS gepufferten Wachstumsmedium.
  3. Tag3
    1. Wählen Sie eines der MOPS Verdünnungen mit einem OD-600 von 0,3 bis 0,4. Impfen Sie 0,2 mL der Kultur auf vorgewärmten (37 ° C) 20 mL MOPS Medium in eine konische 250 mL Flasche zu und inkubieren Sie unter ständigen Unruhe bis OD600 0,3-0,4 (~ 7 h) erreicht.
    2. Beimpfen der MOPS basierend Sporenbildung Medium (250 mL) mit 1 % (V/V) Vorkultur ab Schritt 1.3.1 und inkubieren Sie für 3 Tage bei 37 ° C in einem konischen Liter Kolben unter ständige Unruhe. FM4-64 Färbung von PS4150 Sporen, fügen Sie 2 µg/mL FM4-64 Sonde (siehe Tabelle der Materialien), die Sporenbildung Medium 1 oder 2 h nach dem Gipfel OD600 Wert des vegetativen Wachstums (in der Regel etwa 2) und ermöglichen die Kultur zu Anschließend sporulate während es schützt vor Licht5.
  4. 7. Tag: Ernte von Sporen
    1. Bestimmen Sie die Sporenbildung Ausbeute (Sporen Vs vegetativen Zellen) mit Phasenkontrastmikroskopie bei 100 X Vergrößerung, um die Phase hellen Sporen aus Phase dunklen Zellen und evtl. reifen Sporen zu unterscheiden. Eine 90 % Phase hell Spore Ausbeute wird erwartet.
    2. Pellet-die Sporen bei 4.270 X g für 15 min bei 4 ° C im Rundboden Zentrifuge Röhren. Waschen Sie die Spore Pellet 2-3 Mal mit 40 mL sterilem hochreine Typ1 demineralisiertes Wasser in 50 mL konische Zentrifuge Röhren (siehe Tabelle der Materialien). Spin-Down bei jedem Waschgang 4.270 x g für 15 min (4 ° C).
  5. Tag 7: Spore-Reinigung
    1. Spore Reinigung: Spore Pellet in 750 µL 20 % nichtionische Dichte Gradienten Medium aussetzen (siehe Tabelle der Materialien) und laden auf 800 µL 50 % nichtionische Dichte Gradienten Medium in sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 60 min bei 21.500 X g. Das Pellet erhalten enthält die kostenlose Sporen. Aussetzen der Spore Pellet in 200 µL 20 % nichtionische Dichte Gradienten Medium und laden auf 1 mL 50 % nichtionische Dichte Gradienten Medium in einem Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 15 min bei 21.500 X g.
    2. Waschen Sie die endgültige Spore Zubereitung und Lagerung: das Pellet erhalten enthält gereinigten Sporen. Waschen das Spore-Pellet 2-3 Mal mit 1,5 mL sterile Reinstwasser Typ1 (siehe Tabelle der Materialien) und Spin-Down zwischen 9.560 x g für 15 min bei 4 ° c Zu guter Letzt das Pellet in sterilen Typ1 Reinstwasser auf eine endgültige OD600 von rund 30 aussetzen. Aliquote der Sporen können bei-80 ° C für 8 Wochen14gespeichert werden.

(2) Entschichten

  1. PS4150 Sporen zu behandeln mit 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) / 0,1 M Dithiothreitol (DTT) bei 70 ° C für 1 h waschen die Sporen 10 Mal mit sterilisierten Reinstwasser Typ1 Wasser15,16. Auf diese Weise einer FM4-64-Sonde in der Spore äußeren Membran adsorbiert und äußere Schichten entfernt werden.

3. Deckglas und Vorbereitung der Folie11 (Timing: 1 H vor Beobachtung)

  1. Pre-clean hochpräzise Deckgläsern (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 M HCl für 30 min im Wasserbad vorsichtig schütteln. Waschen der Deckgläsern zweimal in Reinstwasser Typ1, und speichern sie in 100 % (Vol/Vol) EtOH. Lassen Sie sie trocknen und ihre Klarheit vor der Verwendung zu überprüfen. Pre-reinigen Sie den Objektträger in 70 % EtOH. Lassen Sie sie trocknen und ihre Klarheit vor der Verwendung zu überprüfen.

(4) Sampling fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen in der gen-Rahmen Folie10 (Timing-15 Min)

  1. Vorwärmen zwei 70 % EtOH gereinigt und Luft getrockneten Objektträger (siehe Tabelle der Materialien) für einige Sekunden auf einem Heizblock 70 ° C, 65 μL der sterilisierten 2 % Agarose statt bei 70 ° C auf einem Objektträger fallen und legen Sie die anderen Glas-Folie an der Spitze die Agarose-b zu verbreiten Wischen der Folien. Die Agarose-Patch wird in ca. 5 min trocknen.
  2. Schneiden den Agarose-Patch in einem 1 x 1cm-Abschnitt nach dem Entfernen der Glas-Folien 0.4 μl der Probe (fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen von ~ 10-8-/mL), und den Patch auf die hohe Präzision Deckglas zu übertragen, indem man das Deckglas auf den Patch und Abrutschen.
  3. Befestigen Sie einen Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 µL) auf die getrocknete Folie, die das Deckglas schließen alle Ecken des Rahmens aufgesetzt ist, womit sich die Folie für den Einsatz in der Mikroskopie.

(5) Imaging11,17(Timing: 1 H)

  1. Erfassen die Übertragungs- und Fluoreszenz Bilder von Sporen sowie eine Mischung aus rot und gelb-grün Carboxylat-modifizierte fluoreszierende Mikrosphären auf eine strukturierte Beleuchtung-Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien) ausgestattet mit 100 x Objektiv (Öl) Numerische Apertur = 1.49), eine CCD-Kamera und Bild-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Alle Bilder bei Raumtemperatur ohne die Störung des Umgebungslichts zu generieren. Achten Sie darauf, immer das 100 x Objektiv und die Folie mit 75 % Ethanol vor Bildgebung zu reinigen.
  2. Fokus auf 100 nm (Durchmesser) fluoreszierenden Mikrosphären und optimieren Sie die Point-spread-Funktion (Psf) durch die Anpassung des Korrektur-Ring auf das 100 X Objektiv, bis eine symmetrische Psf minimiert Unschärfe des Bildes erreicht ist. Die Psf ist die Impulsantwort oder die Reaktion ein bildgebendes System auf eine Punktquelle oder Point-Objekt.
  3. Wählen Sie eine Sichtfeld mit ca. 10 Runden fluoreszierenden Mikrosphären. Wenden Sie ein Gitter Fokuseinstellung für beide 561 nm und 488 nm Erregung Wellenlängen als Leitfaden für die Bildanalyse-Software.
  4. Konzentrieren Sie sich die Sporen mit dem Getriebe-Licht und erfassen Sie eine Übertragung Lichtbild in die 16 × durchschnittliche Modus mit 200 ms Belichtungen für jedes Bild zu.
  5. 3D-SIM fluoreszierende Rohbilder der Sporen mit Beleuchtung-Modus "3D-SIM", die Kamera-Einstellungen Auslesen Modus Elektron Multiplikation (EM) Gain 10MHz bei 14-Bit- und EM-Gewinn bei 175 zu erfassen. Begeistern Sie die FM4-64-Sonde in PS4150 Sporen mit 561 nm Laserlicht an 20 % Laserleistung und eine Leuchtdauer von 400 ms.
  6. GerKB-mCherry zu begeistern und GerD-GFP in KGB80 Sporen mit, bzw. 561 nm Laserlicht bei 30 % Laserleistung für 1 s und 488 nm Laserlicht an 60 % Leistung laser für 3 S. Z-Stapel-Einstellungen sind in der von oben nach unten Modus, 0,2 µm / Schritt, 7 Schritte und 20 Schritten für Germinosome und IM Analyse, beziehungsweise.
    Hinweis: Diese Laserparameter wurden angewandt, um einen maximalen Helligkeitswert im Histogramm-Fenster von rund 4.000 zu gewährleisten.

6. rekonstruieren Sie 3D-SIM Raw-Bilder von FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen

  1. Durchführen Sie die N-SIM Scheibe Rekonstruktion für den FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen raw-Daten. Klicken Sie auf Param für Rekonstruieren Slice auf der N-SIM Pad Registerblatt, N-SIM Scheibe Wiederaufbau-Fenster zu öffnen.
  2. Legen Sie die Wiederaufbau-Parameter im Fenster N-SIM Scheibe Wiederaufbau . Um perfekte rekonstruierten Bilder, folgen Sie den Vorschlag der N-SIM Anweisungen und klicken Sie auf die entsprechenden Steuerelemente im Fenster N-SIM Scheibe Rekonstruktion der Beleuchtung Modulation Kontrast (IMC) auf Auto, hoch eingestellt Auflösung Noise Suppression (HRNS) 1.00 und Aus dem Fokus verwischen Unterdrückung (OFBS) auf 0,05 als Ausgangspunkte.
  3. Klicken Sie auf Scheibe zu rekonstruieren , im Fenster N-SIM Scheibe Wiederaufbau , das Bild zu rekonstruieren. Bewerten Sie die Qualität der rekonstruierten Bilder durch die schnelle Fourier umgewandelt (FFT) Bilder und Wiederaufbau-Score, der nach der Rekonstruktion12angezeigt.
  4. Passen Sie die HRNS von 0,10 bis 5.00 und OFBS von 0,01 bis 0,50 durch Klick auf die entsprechenden Steuerelemente im Fenster " N-SIM Scheibe Rekonstruktion ", bis die besten Parametereinstellungen abgerufen werden.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche im Fenster N-SIM Scheibe Bildinventars , geänderte Parameter anzuwenden . Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen , um das Fenster zu schließen.
  6. Machen Sie eine FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen raw-Bild aktiv und klicken Sie Rekonstruieren Slice auf der N-SIM Pad Registerblatt Slice Rekonstruktionausführen. Speichern Sie das rekonstruierte Bild.

7. die Bildanalyse

  1. Konvertieren Sie Pseudo-Weitfeld-Bilder von der KGB80 germinosome
    1. Umwandeln Sie 3D-SIM raw-Bilder von KGB80 durch die Aktivierung mit einem Linksklick ImageJ Plugins SIMcheck Dienstprogramm Raw Daten SI zu Pseudo-Weitfeld12in Pseudo-Weitfeld-Bilder. Pseudo-Weitfeld Bilder aus SIM-Rohdaten im Durchschnitt und montiert, zum Vergleich ein Bild konventionellen Weitfeld Beleuchtung12entspricht. ImageJ selbst finden Sie unter https://imagej.net/Welcome. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie aus ~ 25 Sporen in jedem Bild invertierte Übertragung für eine spätere Analyse der Germinosome in den fluoreszierenden Pseudo-Weitfeld-Bildern.
    2. Wählen Sie aus insgesamt rund 350 (in diesem Beispiel, 346) KGB80 Sporen in 14 Sichtfelder aus zwei Folien. Die GerD-GFP und GerKB-mCherry fluoreszierende Herde Zahlen in ausgewählten KGB80 Sporen sollte unabhängig von den beiden Forschern gezählt werden. Die Forscher kann auf die 3D-SIM-raw-Bilder wann immer im Zweifel an die Anwesenheit von separaten fluoreszierende Germinosome Brennpunkte in Sporen zurückgreifen.
    3. Bewerten Sie die maximalen Intensitäten der jeder GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkt und die integrierte Intensität der einzelnen KGB80 Spore 3D-Bild mit ImageJ.
  2. Analysieren Sie Pseudo-Weitfeld-Bilder von der KGB80 germinosome
    1. Verwenden Sie die mittlere integrierte Intensitätswert 7 Stacks als die integrierte Signalintensität KGB80 Spore. Bestimmen Sie Hintergrund-Intensitäten von imaging-Hintergrund-Stamm PS4150 mit identischen Einstellungen. Betrachten Sie fluoreszierende Flecken in einzelnen KGB80 Sporen als Germinosome Herde wenn sie aus dem Hintergrund deutlich unterscheidbar sind.
    2. One-Way ANOVA-Tests zur Bestimmung der Bedeutung mit Software Origin 9.0 anwenden. in Anbetracht der P-Werte < 0,05 als statistisch signifikante. Verwenden der Spearman Rank Korrelationskoeffizient18 , die Korrelation von GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkte-Reihe und die Messungen der integrierten Signalintensität zu bewerten.

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Results

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Das aktuelle Protokoll stellt ein SIM-Mikroskop bildgebendes Verfahren für bakterielle Sporen. Die Sporenbildung und Folie Vorbereitung Verfahren wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 gezeigt, vor der Bildgebung. Später wurden die Bildverarbeitung und Analyse Verfahren angewandt sowohl für dim (fluoreszierendes Protein mit der Bezeichnung Keimung Proteine) und hell (lipophile Sonde IM gebeizt) Spore zu Proben, wie im folgenden Text dargestellt.

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Discussion

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Das Protokoll präsentiert enthält ein standard-3D-SIM-Verfahren zur Analyse von FM4-64 gebeizt B. Subtilis Sporen, die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und bildgebende Verfahren enthält. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine modifizierte SIMcheck (ImageJ)-unterstützt 3D imaging-Prozess für die SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Spore Germinosomes beschriftet mit fluoreszierenden Reportern. Die letztere Vorgehensweise konnten wir diese dim Unterkonstruktion mit verbesserten Kontrast zu beobachten. D...

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Disclosures

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Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Die Autoren danken Christiaan Zeelenberg für seine Unterstützung während der SIM-Bildgebung. JW anerkennt der China Scholarship Council für ein Promotionsstipendium und Dank Irene Stellingwerf für ihre Hilfe in der primären Phase der Bildgebung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Luftgetrocknete GlasobjektträgerMenzel Glä ser630-2870
APO TIRF N20R8 100&faches Ölobjektiv (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, Δ cotE::tet)
Erlenmeyerkolben 1 LSigma-AldrichZ567868
Erlenmeyerkolben 250 mLSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres carboxylatmodifizierte MikrosphärenInvitrogen, 0,1 μ mF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz nichtionischer Dichtegradient mittelSigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD-KameraAndor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB AgarSigma-AldrichL2897
Mikrofuge-Röhrchen 1,5 mLThermo Fisher Scientific3451PK
Mikroskop-BildgebungssoftwareNikon, JapanNIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure deminerilziertesWasser Millipore Milli-QIQ 7003
Nikon Eclipse Ti Mikroskop
Polypropylen Schraubverschlussflasche 180 mLThermo Fisher Scientific75003800
Präzisions-DeckgläserPaul Marienfeld117650
Röhrchen mit rundem Boden 15 mLThermo Fisher ScientificNunc TM
Röhrchen mit Schraubverschluss 50 mLThermo Fisher ScientificNunc TM

References

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