Summary
نقدم بروتوكول باستخدام نهج وراثي إلى الأمام لفحص المتحولين الذين يظهرون التنكب العصبي في دروسوفيلا melanogaster. وهو يتضمن اختبار التسلق، وتحليل الأنسجة، ورسم خرائط الجينات وتسلسل الحمض النووي لتحديد الجينات الجديدة المتعلقة بعملية الحماية العصبية في نهاية المطاف.
Abstract
هناك الكثير لفهم حول ظهور وتطور الأمراض العصبية، بما في ذلك الجينات الكامنة المسؤولة. الفحص الجيني الأمامي باستخدام الطفرات الكيميائية هو استراتيجية مفيدة لرسم خرائط الأنماط الظاهرية المتحولة للجينات بين دروسوفيلا والكائنات الحية النموذجية الأخرى التي تشترك في المسارات الخلوية المحفوظة مع البشر. إذا لم يكن الجين المتحول الذي يهمه الأمر قاتلاً في المراحل التنموية المبكرة للذباب، يمكن إجراء فحص للتسلق للكشف عن المؤشرات الفينوتية لانخفاض أداء الدماغ، مثل انخفاض معدلات التسلق. في وقت لاحق، يمكن إجراء التحليل النسيجي الثانوي لأنسجة الدماغ من أجل التحقق من وظيفة محصنة للجين عن طريق تسجيل الأنماط الظاهرية للتكوين العصبي. وتشمل استراتيجيات رسم خرائط الجينات رسم الخرائط المتجانسة والقصور التي تعتمد على هذه الاختبارات نفسها يمكن أن يتبعها تسلسل الحمض النووي لتحديد التغيرات النيوكليوتيدات المحتملة في جين الفائدة.
Introduction
الخلايا العصبية هي في معظمها بعد mitotic وغير قادرة على تقسيم1،2. في معظم الحيوانات، توجد آليات محصنة للحفاظ على هذه الخلايا طوال عمر الكائن الحي، وخاصة في سن الشيخوخة عندما تكون الخلايا العصبية الأكثر عرضة للتلف. ويمكن تحديد الجينات الكامنة وراء هذه الآليات في المسوخ التي تظهر تنكس الأعصاب، وهو مؤشر فينوتيبيك لفقدان الحماية العصبية، وذلك باستخدام بروتوكول وراثي متقدم. الشاشات الوراثية الأمامية التي تستخدم الطفرات الكيميائية مثل إيثيل ميثانسولفونات (EMS) أو N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) مفيدة بشكل خاص بسبب الطفرات العشوائية التي تحفزها، مما يؤدي إلى نهج غير متحيز بطبيعته ألقى الضوء على العديد من الوظائف الجينية في الكائنات الحية نموذج eukaryotic3،4،5 (على النقيض من ذلك ، يخلق موت التناضح بالأشعة السينية فواصل الحمض النووي ويمكن أن يؤدي إلى إعادة ترتيب بدلا من الطفرات نقطة6).
ذبابة الفاكهة المشتركة Drosophila melanogaster هو موضوع مثالي لهذه الشاشات نظرا لجودته العالية، تسلسل الجينوم المشروح جيدا، تاريخها الطويل ككائن حي نموذجي مع أدوات وراثية متطورة للغاية، والأهم من ذلك، تقاسمها تاريخ تطوري مع البشر7,8. والعامل المحدد في انطباق هذا البروتوكول هو الفتك المبكر الناجم عن الجينات المتحولة، التيمن شأنها أن تمنع الاختبار في سن التاسعة من العمر . ومع ذلك، بالنسبة للطفرات غير المميتة، فإن اختبار التسلق، الذي يستفيد من التجواق الجغرافي ة السلبية، هو طريقة بسيطة، وإن كانت واسعة النطاق، لتحديد الأداء الحركي الضعيف10. لإظهار ما يكفي من التفاعل الحركي، يعتمد الذباب على الوظائف العصبية لتحديد الاتجاه، والشعور بموقفه، وتنسيق الحركة. عدم قدرة الذباب على الصعود بما فيه الكفاية استجابة للمحفزات يمكن أن تشير بالتالي إلى عيوب عصبية11. بمجرد تحديد النمط الظاهري التسلق المعيبة معينة، يمكن استخدام مزيد من الاختبارات باستخدام شاشة ثانوية مثل التحليل النسيجي لأنسجة الدماغ، لتحديد التنكّن العصبي في الذباب التسلق المعيبة. ويمكن بعد ذلك استخدام رسم خرائط الجينات اللاحقة للكشف عن المنطقة الجينية على الكروموسوم الذي يحمل الجين المعيب الذي يحمي الأعصاب. لتضييق المنطقة الكروموسومية ذات الأهمية، يمكن إجراء رسم الخرائط الميوتيكية باستخدام خطوط ذبابة متحولة تحمل جينات العلامات المهيمنة مع مواقع معروفة على الكروموسوم. تعمل جينات العلامة كنقطة مرجعية للطفرة حيث يوفر تردد إعادة التركيب بين موضعين مسافة قابلة للقياس يمكن استخدامها لرسم الموقع التقريبي للجين. وأخيرا، عبور خطوط متحولة مع خطوط تحمل أوجه القصور المتوازنة على منطقة الكروموسومات التي تم تعيينها بشكل مثيوتي يخلق اختبار تكملة التي يمكن التحقق من جين الفائدة إذا تم التعبير عن النمط الظاهري المعروف5. يمكن تقييم تسلسلات النيوكليوتيدات المتعددة الأشكال في الجين المحدد، مما قد يؤدي إلى تغيير تسلسل الأحماض الأمينية، من خلال تسلسل الجين ومقارنته بتسلسل جينوم دروسوفيلا. ويمكن أن يشمل التوصيف اللاحق لجين الاهتمام اختبار الأليلات اتوّه اتّصال اتّصال إضافيّة، وتجارب إنقاذ الطفرة، وفحص الأنماط الظاهرية الإضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وشيخوخة الذباب
- الحصول على أو توليد6 مجموعة من المسوخ Drosophila التي سيتم استخدامها للشاشة الوراثية. هنا، يتم استخدام خطوط ENU-mutagenized التي تم تعيينها إلى الكروموسوم الثاني ومتوازنة على CyO.
- تضخيم خطوط النمط الجيني التجريبي في حاضنة تعيين في 25 درجة مئوية، 12 ساعة دورة الضوء / الظلام على دقيق الذرة دبس السكر المتوسطة.
- جمع حوالي 20 ذرية متجانسة بين 0-2 أيام من eclosion الكبار من كل النمط الجيني التجريبي. القضاء على التحيز الجنسي عن طريق جمع الذباب إما الذكور أو الإناث باستمرار.
- عمر الذباب على دقيق الذرة دبس المتوسطة كما هو مطلوب في 29 درجة مئوية، التقليب قارورة كل 2-3 أيام من أجل الحفاظ على الذباب على المواد الغذائية الطازجة مع تقدمها في السن. في الشاشة المعروضة هنا، كان عمر الذباب لمدة 10-12 يوما.
- تجميع غرفة اختبار فحص التسلق باستخدام قارورتين والشريط كما سبق وصفه10. يجب توصيل القنينات في كلا الطرفين المفتوحين. استخدم مسطرة لوضع علامة على خط 5 سم على نهاية واحدة من الغرفة.
2. البروتوكول 1: التسلق -
- التحقق من صحة التسلق. في هذه الدراسة، اختبار اختبار التسلق على أساس المنهجية الموصوفة سابقا من قبل علي وآخرون10،وذلك باستخدام ElavC155> UAS-TauR406W (تظهر معدلات أقل لاجتياز التسلق) وElav C155>UAS-GFP ( السيطرة) وElavC155>UAS-mCherry (السيطرة) الذباب.
- قلب الذباب في غرفة الاختبار، خط واحد في وقت واحد (لا تستخدم ثاني أكسيد الكربون التخدير) والسماح لهم بالتعافي لمدة 5 دقائق. إذا تم إجراء الاختبار في أيام مختلفة، قم بإجراء الفحص في نفس الوقت من اليوم. في هذه الدراسة، تم إجراء جميع الاختبارات التسلق في فترة ما بعد الظهر للسيطرة على آثار circadian على الحركة12.
ملاحظة: تجنب تعريض الذباب لأشعة الشمس المباشرة عند الاختبار. وهذا سوف تتداخل مع قدرتهم على الصعود. - الاستفادة قسرا من الغرفة (ملحوظ الجانب إلى أسفل) على لوحة الماوس وضعت على سطح صلب 3 مرات حتى تبدأ جميع الذباب في التدقيق في الجزء السفلي. مراقبة حركة الطيران على مدى فترة 10 ق.
- تسجيل عدد الذباب التي تصل أو تمر خط 5 سم في هذا الوقت، فضلا عن العدد الإجمالي للذباب اختبارها. كرر البروتوكول، في انتظار دقيقة واحدة بين كل محاكمة، لمدة لا تقل عن 3 تكرار اتّباب لكل سطر.
ملاحظة: وفي هذه الدراسة، كانت كل قارورة تحتوي على ما بين 2 و19 ذبابة للفحص الأولي (الذباب الذكور) وما بين 6 و21 ذبابة لتحليل نقص المتحولة في خطوط الإناث المتقاطعة (القسم 5-3).
3- البروتوكول 2: اختيار سلالات دروسوفيلا لمزيد من التحليل
- أدخل بيانات إجراء تحليل التسلق في Microsoft Excel أو البرامج المشابهة وحساب معدل تمرير التسلق لكل سطر عبر كافة النسخ المتماثلة كنسبة مئوية.
-
إجراء تحليل إحصائي للكشف عن خطوط متحولة التي تحيد بشكل كبير عن متوسط قيمة النسبة المئوية للتسلق من جميع الخطوط باستخدام حزمة برامج R13.
- قراءة في ملفات البيانات التي تم تنسيقها لملفات R (.csv أو .txt مع عمود لكل متغير أو عامل والصفوف التي تمثل القيم المحددة).
ملاحظة: هنا، تم إدخال البيانات الخاصة بالذكور (الفحص الأولي) والإناث (الخط 867 عبرت إلى خطوط نقص) في أوراق .xlsx منفصلة كعمودين، واحد حيث الصفوف من العمود تحديد خط متحولة وعدد المرات التي تم فيها تكرار الفحص والآخر حيث الصفوف تمثل متوسط نجاح التسلق (كنسبة مئوية) لكل قارورة تكرار من الذباب. - قراءة البيانات في R باستخدام التعليمات البرمجية التالية:
مالي<-read.csv(".. /male_init.csv")
femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
ملاحظة: .." في دلائل المسار مسارات مطلقة من الدليل الجذر للكمبيوتر الخاص بالمستخدم وتحتاج إلى تحديد من قبل المستخدم الفردي لمسارات الدليل الكمبيوتر الخاص بهم. - تنفيذ النمذجة الخطية
- تنفيذ الانحدار المتغير وهمية مع الدالة lm في R. للتحليل الأولي للخطوط المتحولة، تقييم أهمية تأثيرات مستوى العامل (خطوط متحولة) على نسبة النجاح في التسلق مقابل المتوسط الكبير لمتغير استجابة مركزة صفر (النجاح في المئة).
ملاحظة: استدعاء "-1" في نهاية دالة lm في القسم 3.2.3.2. يزيل اعتراض ويسمح لنا لاختبار جميع مستويات عامل مقابل متوسط الصفر تتمحور متوسط نسبة تسلق معدل النجاح. - طباعة النتائج إلى الشاشة باستخدام وظيفة ملخص R:
mali_anova<-lm (مقياس (مالي $ P_Success) ~ مالي $ متحولة -خط -1)
ملخص (مالي-أنوفا) - استخدام خطوط التحكم (إذا كانت موجودة) كخط الأساس لاختبار تأثيرات مستوى عامل مقابل استخدام رمز R التالي: x<-relevel(femdef$Mutant_line ref="a867_plus")
femdef_anova<-lm (femdef$P_success~x)
ملخص (femdef_anova)
ملاحظة: يقوم السطر الأول من التعليمات البرمجية بإعادة ترتيب مستويات العامل بحيث يصبح خط التحكم السالب اعتراض خط الأساس الذي يتم اختبار كافة مستويات العوامل الأخرى (خطوط متحولة) مقابله مع الاختبارات tالمضمنة في الدالة lm.
- تنفيذ الانحدار المتغير وهمية مع الدالة lm في R. للتحليل الأولي للخطوط المتحولة، تقييم أهمية تأثيرات مستوى العامل (خطوط متحولة) على نسبة النجاح في التسلق مقابل المتوسط الكبير لمتغير استجابة مركزة صفر (النجاح في المئة).
- قراءة في ملفات البيانات التي تم تنسيقها لملفات R (.csv أو .txt مع عمود لكل متغير أو عامل والصفوف التي تمثل القيم المحددة).
- اختر عتبة لخطوط المرشحين وفقًا للعمر في وقت الاختبار. لتحديد العتبة، وإجراء اختبار أولي في العمر المطلوب باستخدام المسوخ المعروفة التي تظهر التنكب العصبي وانخفاض معدلات تمرير التسلق بالمقارنة مع نوع البرية، والتحكم الذباب10.
ملاحظة: معدل تمرير أقل من 50٪ قد يكون مناسبا للذباب 10 أيام من العمر كما ذكرت سابقا لخطوط Drosophila overexpressing الجينات البشرية ذات الصلة التنجن العصبي تاو في الجهاز العصبي10. الذباب الأكبر سنا ينبغي أن يكون أعلى عتبة معدل النجاح حيث أنه من المتوقع أن تظهر انخفاض الحركة، وبالتالي، زيادة تنكس الأعصاب.
4. البروتوكول 3: تحليل الأنسجة
- ارتداء القفازات، وحلق رؤساء يطير مع شفرة الجراحية بعد اختبار التسلق واستخدام فرشاة الطلاء لوضعها بلطف في 1 مل من المثبت كارنوي (6:3:1 من 100٪ EtOH: الكلوروفورم: حمض الخليك الجليدي) في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل O / N في 4 درجة مئوية. تأكد من أن الرؤوس تغرق في الحل المثبت.
- استبدال الحل المثبت في اليوم التالي مع 1 مل من 70٪ EtOH والحفاظ على العينات لا تزال في 4 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.
ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه الخطوة. - ضع الرؤوس من الخطوة 4.2. بحد أقصى خمسة لكل كاسيت خزعة. على الفور وضع الكاسيت في حاوية مليئة EtOH 70٪. تخزين الحاوية في 4 درجة مئوية قبل الشحن إلى مرفق علم الأنسجة لمعالجة وتضمين البارافين من رؤساء. في حالة توفر معدات لمعالجة الأنسجة وتضمينها، اتبع الخطوة 4.4.
- تضمين رؤساء في البارافين لقسم microtome:
- اتبع إعدادات البرنامج لآلة معالجة الأنسجة الآلي بالترتيب المعروض في الجدول 1 للجفاف، ومسح والتسلل مع البارافين رؤساء.
- نقل العينات إلى قوالب قاعدة معدنية تناسب كاسيت باستخدام البارافين ساخنة في 60 درجة مئوية باستخدام محطة تضمين البارافين.
- توجيه رؤساء (اتجاه الأنتيرو الخلفي التي تواجه الجزء العلوي) في القالب الأساسي باستخدام ملقط غرامة للسماح التصور السليم لأنسجة الدماغ بعد القسم. ويمكن القيام بذلك عن طريق إعادة تسخين البارافين عند 60 درجة مئوية وإعادة وضع الرؤوس إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يمكن استبدال قوالب معدنية بقوالب قاعدة يمكن التخلص منها. - ضع الكاسيت على الجزء العلوي من القالب الأساسي المقابل وحركها برفق إلى الجانب المبرد من محطة تضمين البارافين (4 درجة مئوية). انتظر حتى تصلب الكتلة قبل إزالتها من المحطة.
- إزالة كتلة شكل القالب عن طريق فصل بلطف القالب من كاسيت.
- تقليم كل كتلة البارافين قبل المقطع لتقليل السطح الذي سيتم تقسيمه.
- تعيين microtome لقطع 5 أقسام ميكروم من كل كتلة.
- ضع شريط البارافين المقطع الذي يحتوي على الأنسجة في حمام مائي ساخن (35 درجة مئوية) لمدة أقصاها 5 دقائق.
- تزج شريحة المغلفة بولي يسين (يساعد على الاحتفاظ الأنسجة) في حمام الماء ساخنة، ووضع الشريط مقطععلى الشريحة باستخدام التطبيقات الخشبية. اسمحوا الشرائح الهواء الجاف O / N في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتسخين الشرائح لمدة 15 دقيقة عند 63 درجة مئوية باستخدام تدفئة الشرائح.
- ضع الشرائح على رف تلطيخ الشرائح ووصمة عار مع هيماتوكسيلين وeosin (H & E) تحت غطاء الدخان من خلال احترام الخطوات التالية.
- ضع الحامل في Histochoice (استبدال غير سامة من إكسيلين، مما يساعد على إزالة البارافين من العينة) لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة Histochoice لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 1 00٪ لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 100٪ 2 لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 95٪ لمدة 3 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 70٪ لمدة 3 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة المقطر H2O لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة هاريس هيماتوكسيلين لمدة 2-5 دقائق.
- إخراج الرف من محلول Hematoxylin وضعه تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 10 دقيقة.
- نقل الرف في حاوية مليئة بالماء المقطر عن طريق القيام دونك قصيرة.
- نقل الرف في حاوية مليئة Eosin لمدة 1-2 دقيقة.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 95٪ عن طريق القيام دونك قصيرة.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 95٪ لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 100٪ لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة EtOH 100٪ لمدة 5 دقائق.
- نقل الرف في حاوية مليئة Histochoice (أو إكسيلين) لمدة 5-10 دقيقة حتى يتم تركيب جميع الشرائح.
- قم بتركيب الشريحة والانزلاق (24 مم × 60 مم من الحجم). باستخدام ملقط، واتخاذ الشريحة للخروج من الحل Histochoice أو إكسيلين وجعل شريط رقيقة من المتوسطة تصاعد على الجزء العلوي منه. وضع بلطف غطاء على الجزء العلوي، في محاولة لتجنب تشكيل فقاعات.
- دع الوسائط المتصاعدة على الشرائح المثبتة تصلب O/N تحت غطاء الدخان قبل التحليل.
- تخزين الشرائح الملونة في مربع في درجة حرارة الغرفة.
- قياس التنكّد العصبي من خلال النظر إلى جميع المقاطع التسلسلية على الشريحة في التكبير 20x تحت المجهر الخفيف. فحص الدماغ بأكمله، مع ملاحظة نوعية من حجم وعدد من vacuoles التي تظهر في ثلاثة أقسام متتالية.
- الحصول على صور لأقسام الدماغ التمثيلية في منتصف الدماغ تقريبا باستخدام مجهر خفيف مجهز ببرامج التصوير.
5. البروتوكول 4: رسم الخرائط الجينية للنمط الظاهري المتنحية
- تجاوز خط المرشح إلى نوع البرية كانتون (BL_ 9517) أو نوع آخر البرية أو سلالة isogenized (على سبيل المثال، OregonR (BL_ 2376)، ث1118 (BL_5905) أو yw (BL_ 6599) لتحديد ما إذا كان النمط الظاهري هو المهيمن أو المتنحيه.
ملاحظة: النتائج من هذه الخطوة سوف توجه الخطوات التالية من التعيين. إذا كان النمط الظاهري متنحيًا، يمكن إجراء رسم خرائط نقص.- باستخدام فرشاة الطلاء، وجعل الصليب عن طريق وضع في قارورة تحتوي على الغذاء CO2-الذباب التخدير من خط اهتمام متحولة (5 ذكور) وخط كانتون (10-15 الإناث العذراء). ضع القارورة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- جمع ذرية F1 heterozygous وتكرار التسلق والتجارب الأنسجة.
- قارن النتائج التي تم الحصول عليها إلى خط التحكم وحده وإلى المتحولين المتجانسين. وهناك مؤشر جيد على النمط الظاهري المتنحية سيكون إذا لمسوخ heterozygous تظهر الأنماط الظاهرية مماثلة للذباب نوع البرية.
- إجراء رسم خرائط النيوتيك لتقدير موقع الطفرة على الكروموسوم الثاني تقريبًا باستخدام wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL_3227) أو سلالة مكافئة مع العلامات المهيمنة المرتبطة بها في المعروفة موقع الخلوية. في هذه الحالة، كان من المعروف سابقا أن الطفرة تقع على الكروموسوم الثاني.
- باستخدام فرشاة الطلاء، وجعل الصليب عن طريق وضع في قارورة تحتوي على الغذاء CO2-الذباب التخدير من خط الفائدة متحولة (5 الذكور) وWG Sp-1 J1 L2 دبوس1/ CyO خط (10 الإناث). ضع القارورة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
ملاحظة: والهدف من هذا الصليب هو توليد الإناث heterozygous تحمل الكروموسوم مع الطفرة الجديدة وكروموسوم علامة، والتي سوف تتضافر خلال meiosis6،14. يتم اختيار ذرية F1 الإناث بدلا من الذكور منذ إعادة تركيب لا يحدث في الذكور. - جمع ما لا يقل عن 15 ذرية الإناث البكر تحمل الكروموسوم مع الطفرة الجديدة وكروموسوم علامة وعبورها إلى 5 الذكور من خط متوازن يحمل علامة أخرى مهيمنة مرئية (على سبيل المثال، CyO / snaسكو (BL_2555) أو ما يعادلها).
- جمع ذرية الذكور heterozygous تحمل إما سكو أو CyO والكروموسوم الذي يحتمل أن يعاد دمجها من الصليب في الخطوة 5.2.2. ورفيقة بشكل فردي لهم للإناث العذراء من الأسهم تحمل الكروموسوم المتحولة.
- جمع الذرية من الصليب النهائي الموضح في الخطوة 5.2.3. وعمر الذباب في 29 درجة مئوية (في هذه الدراسة كان يطير الذين تتراوح أعمارهم بين 10-14 يوما).
- جمع رؤساء، وإجراء تحليل الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول 3 والنظر في الشرائح مع أقسام الدماغ لتحديد درجة علم الأمراض العصبية كما هو موضح في الخطوة 4.11. يتم إجراء تحليل الأنسجة بدلا من تحليل الحركة بسبب الأنماط الظاهرية التي قد تؤثر على اختبار التسلق ، مثل التشويش (J)، الذي يسبب تراكم السوائل في الأجنحة15.
- باستخدام فرشاة الطلاء، وجعل الصليب عن طريق وضع في قارورة تحتوي على الغذاء CO2-الذباب التخدير من خط الفائدة متحولة (5 الذكور) وWG Sp-1 J1 L2 دبوس1/ CyO خط (10 الإناث). ضع القارورة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- إجراء رسم خرائط نقص على المنطقة الضيقة من الكروموسوم لصقل موقع الطفرة المتنحية باستخدام التسلق. كل خط نقص لديه حذف منطقة مختلفة من الكروموسومات، مما يسمح لهم لاستخدامها في اختبار تكملة.
- ابدأ بأوجه القصور الكبيرة التي تغطي المنطقة المحددة في رسم الخرائط الميوتيكية، والتي يمكن بعد ذلك تضييقها باستخدام أوجه القصور الأصغر حجماً. إذا كان تحليل نقص النتائج في أكثر من جين مرشح واحد، ينصح باستخدام مخزونات التدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) لاستهدافها.
- خطوط متقاطعة من مجموعة نقص دروسوفيلا 16 للكروموسوم الثاني (DK2L في هذه الدراسة) والبحث عن عدم استكمال النمط الظاهري للفائدة (في هذه الدراسة: ارتفاع معدل النجاح من 8.5٪ وهو ما يتوافق مع معدل النجاح من الذباب المتجانس من خط 867 المستخدمة كسيطرة إيجابية).
- تأكيد النمط الظاهري للتنكس العصبي باستخدام التحقق من الأنسجة كما هو موضح في القسم 4 (البروتوكول 3).
6- البروتوكول 5: تسلسل الحمض الخلوي الصبدي وتحليله
ملاحظة: نضع في اعتبارنا أن الطفرات ENU يدخل الطفرات نقطة11.
- تصميم تسلسلات التمهيدي إلى الأمام والعكسي التي تحيط بمنطقة الترميز الطارد للجين الشقي من أجل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في المنطقة ذات الأهمية (في حالة الخط 867 يتم تضخيم جزء من الحمض النووي بحجم 3247 نقطة أساس لـ تسلسل17).
-
استخراج الحمض النووي من ذبابة واحدة18 :
- تسحق الطائرة بلطف في أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 0.5 مل الذي يحتوي على 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسحق (10 مل تريس-كل درجة الحموضة 8.2، 1 مم EDTA، 25 مل NaCl، و 200 ميكروغرام /مل بروتيناس K؛ يجب تخفيف الإنزيم طازجاً من مخزون مجمد قبل كل استخدام) باستخدام P100 أو P200 pipet tipt.
- حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية
- قم بإلغاء تنشيط Proteinase K عن طريق وضع الأنبوب عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي المستخرج عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر.
- إجراء تفاعل PCR باستخدام حمض نووي عالي الدقة Taq Polymerase (ترد الكواشف وظروف الدراجات الحرارية المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2 والجدول 3على التوالي) من خلال احترام تعليمات الشركة المصنعة وتشغيل منتج PCR على 1 ٪ هلام أغاروز التي تحتوي على Invitrogen SYBR آمنة الحمض النووي هلام وصمة عار، وهو بديل غير سامة من بروميد الإيثيديوم.
- قم باستئصال النطاق من الحجم الصحيح من الجل مع مشرط وتنقية المنتج PCR باستخدام المعالج SV جل وPCR نظام تنظيف (Promega) أو مجموعة ما يعادلها، من خلال احترام تعليمات الشركة المصنعة.
- تصميم التمهيديات الأمامية والعكسية التي سيتم استخدامها لتسلسل الحمض النووي من أجل تغطية المنطقة بأكملها من الفائدة، إذا كان ذلك ممكنا. تسلسل الحمض النووي الهلام تنقية من الخطوة السابقة لتحديد الطفرات نقطة. ويمكن تحقيق دقة عالية في تسلسل Sanger الفلورسنت الآلي لمدة تصل إلى 700 نقطة أساس.
ملاحظة: يمكن استخدام بوليميراز التقوى السابق (TaKaRa) لتضخيم منتجات PCR من قوالب الحمض النووي الجينومي تصل إلى 20 كيلو بايت من الحجم. -
تحليل تسلسلات الحمض النووي التي تم الحصول عليها باستخدام محرر البلازميد (ApE، بواسطة M. Wayne Davis) أو برامج مماثلة عن طريق محاذاتها ومقارنتها بالتسلسلات التي تم الحصول عليها بعد تسلسل نفس المنطقة الجينية للسلالة المرجعية (على سبيل المثال، في الأصل، تم تحويلها في الأصل خط).
- فتح ملفات التسلسل مع ApE. كمرجع، استخدم ملف ApE يحتوي على تسلسل توافق الآراء الجينومي لجين الشقي الذي تم تنزيله بتنسيق FASTA من Flybase، أو ملف يحتوي على نتائج لتسلسل التحكم في الخلفية الوراثية (على سبيل المثال، Drosophila المتحولة أصلاً خط).
- انتقل إلى أدوات، ثم محاذاة التسلسلات. باستخدام ماوس الكمبيوتر، حدد كافة التسلسلات للمقارنة. تذكر الإشارة إلى التسلسل المرجعي المستخدم لهذه المحاذاة في القائمة المنسدلة.
- فحص المنطقة المتسلسلة للتغيرات النيوكليوتيد بالمقارنة مع التسلسل المرجعي. إذا رغبت في ذلك، احفظ المحاذاة على الكمبيوتر بتنسيق .rtf بالنقر فوق نص، ثم حفظ.
ملاحظة: وإذا لم يتم تحديد أي طفرات، فإن بروتوكول تسلسل الحمض النووي وتحليله سيتكرر مع مواد أولية مصممة لتشمل مناطق غير ترميزية للجين.
7- البروتوكول 6: مواصلة تحليل وظيفة الجينات المرشحة
- إجراء تجارب الإنقاذ في الخلايا العصبية لتحديد ما إذا كان الشقي الجينات هي المسؤولة عن النمط الظاهري التنكّي العصبي.
- توازن مزدوج UAS-brat19 ومخزونات بالوطي-Gal4 محددة neuroblast (wor-G4) تحمل المنشآت على الكروموسوم الثالث، فضلا عن خط 867، وهو متحولة لbrat الجينات الموجودة في الثانية الكروموسوم.
- جعل ثلاثة الصلبان منفصلة عن طريق وضع في ثلاثة قارورة مختلفة تحتوي على الغذاء 5 الذكور من UAS-Brat، wor-G4 وخطوط 867 وإضافة إلى كل مجموعة من الذكور 10-15 الإناث البكر من خط تحمل علامات والتوازنات للثانية والكروموسومات الثالثة(Sp/CyO; الدكتور / Tm3، sb؛ BL_59967).
- جمع 10-15 الإناث العذراء من F1 من كل صليب مع الأنماط الجينية التالية: +/CyO; UAS-brat/Tm3, sb, +/CyO; wor-G4/Tm3, sb and 867/CyO;+/Tm3,sb and 5 males of each of the jgtypes التالية: +/Sp; UAS-brat/Tm3, sb, +/Sp; wor-G4/Tm3, sb and 867/CyO; +/Dr.
- عبر collelcted +/CyO; UAS-brat/Tm3, sb العذراء الإناث إلى +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb الذكور; في قارورة منفصلة جعل الصليب الثاني مع +/CyO; wor-G4/Tm3, sb العذراء الإناث إلى +/Sp; wor-G4/Tm3, sb الذكور ثم في تقاطع قارورة ثالثة 867/CyO;+/Tm3, sb العذراء الإناث و 867/CyO; +/Dr males.
- من F1 من كل من هذه الصلبان، وجمع كل من الذكور والإناث من الأنماط الجينية التالية: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb من الصليب الأول, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb من الصليب الثاني و 867/CyO; Dr/Tm3,sb من الصليب الثاني.
- إجراء تقاطع النهائي بين الإخوة والأخوات التي تم جمعها من كل ذرية F1 لإنشاء مخزونات متوازنة مزدوجة دائمة لجميع الخطوط الثلاثة.
- الجمع بين UAS-brat وwor-G4 مع طفرة 867.
- جمع عدد كاف (~ 20-30 الذباب) من الإناث العذراء من 867/CyO؛ Dr/Tm3, sb two balanced stock to perform two crosses.
- مكان 10-15 الإناث العذراء مع ~ 5 الذكور من Sp / CyO؛ UAS-brat/Tm3,sb (عبر #1) وفي قارورة ثانية 10-15 الإناث العذراء مع ~ 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3, sb الذكور.
- جمع الإخوة والأخوات من F1 من كل صليب مع الأنماط الجينية التالية: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb من #1 الصليب و867/CyO;wor-G4/Tm3,sb من #2 الصليب. استخدام الذرية F1 التي تم جمعها من كل صليب لإنشاء مخزونات دائمة عن طريق عبور الإخوة والأخوات بينهما.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة الأخيرة، أسهم 867/CyO؛ UAS-brat/Tm3, sb and 867/CyO; wor-G4/Tm3, sb should generated.
- قم بإجراء تجربة الإنقاذ.
- جمع ~ 15-20 الإناث العذراء من 867/CyO؛ wor-G4/Tm3، sb الأسهم وعبورها إلى 5-10 الذكور من المخزون 867/CyO؛ UAS-brat/Tm3,sb. كتحكم, صليب ~15-20 أنثويّة عذراء من ال 867/CyO; [وور-غ4/تم3], [سب] وحوالي 15-20 أنثويّة عذراء من ال 867/CyO; UAS-brat/Tm3، خط SB إلى خط 867/CyO وحدها.
ملاحظة: 867 الذباب تحمل أليل حساسة لدرجة الحرارة من شقي وينبغي أن يؤدي الصليب الإنقاذ في 29 درجة مئوية. - جمع ذرية F1 التالية من كل صليب عن طريق الاختيار الدقيق للموازنات ملحوظ: 867/867؛ wor-G4/UAS-brat (الإنقاذ)، 867/867؛ wor-G4/+ (control) و 867/867؛ UAS-brat/+ (التحكم).
- عمر الذباب على النحو المطلوب في 29 درجة مئوية وإجراء تحليل الأنسجة على العقول للبحث عن التنكب العصبي باستخدام البروتوكول الموصوف في القسم 4 (البروتوكول 3).
- جمع ~ 15-20 الإناث العذراء من 867/CyO؛ wor-G4/Tm3، sb الأسهم وعبورها إلى 5-10 الذكور من المخزون 867/CyO؛ UAS-brat/Tm3,sb. كتحكم, صليب ~15-20 أنثويّة عذراء من ال 867/CyO; [وور-غ4/تم3], [سب] وحوالي 15-20 أنثويّة عذراء من ال 867/CyO; UAS-brat/Tm3، خط SB إلى خط 867/CyO وحدها.
- توازن مزدوج UAS-brat19 ومخزونات بالوطي-Gal4 محددة neuroblast (wor-G4) تحمل المنشآت على الكروموسوم الثالث، فضلا عن خط 867، وهو متحولة لbrat الجينات الموجودة في الثانية الكروموسوم.
- إجراء تحليل تعتمد على العمر من التنكب العصبي في 867 متحولة.
- جمع 867؛pcna-GFP وyw التحكم الذباب، والتي تحمل جين مراسل (pcna-GFP) وقابلة للحياة في 25 درجة مئوية وتظهر على حد سواء أعلى penetrance والتعبيرية أعلى من النمط الظاهري التنبوّل العصبي من 867 وحدها في هذا درجة الحرارة17.
- عمر الذباب يصل إلى 5 و 15 و 25 كما هو موضح في القسم 1.4 وإجراء تحليل الأنسجة اللاحقة باتباع البروتوكول في القسم 4 (البروتوكول 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا aerticle، ونحن نقدم الخطوات المستخدمة لتحديد ورم الدماغ الجينات (شقي) كما تلعب دورا في الحفاظ على سلامة الخلايا العصبية (على سبيل المثال، الحماية العصبية) في الذباب الكبار17; منهجية يمكن استخدامها لتحديد الجينات المشاركة في الحماية العصبية. استخدمنا نهجاً جينياً إلى الأمام (الاستراتيجية مبينة في الشكل 1A)للفرز من خلال مجموعة من الذباب المتحول كيميائياباستخدام اختبار التسلق (يظهر الجهاز المستخدم لهذا الفحص في الشكل 1B). من بين 235 خطوط متجانسة، أظهر حوالي 37٪ من خطوط اختبار معدل تمرير تسلق أقل من 50٪ عند اختبارها في سن 10-12 يوما (الشكل1C). أظهر 58% من الخطوط المختبرة سلوك تسلق مختلف بشكل كبير عندما تمت مقارنة نسبة النجاح في التسلق (CPR) بمتوسط قيمة النسبة المئوية للتسلق لجميع الخطوط المختبرة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (الشكل1D). كشفت الشاشة النسيجية اللاحقة على 51 من الخطوط التي تظهر أدنى معدل تمرير التسلق أن 29 من هذه الخطوط أظهرت مظهرا مرئيا من الثقوب في neuropil الدماغ (تتراوح بين خفيفة إلى شديدة) يدل على تنكس الأعصاب20 ( الشكل2). من بين الخطوط التي تظهر سلوك التسلق المعيبة والتنكس العصبي الحاد، نختار لرسم خريطة الطفرة الكامنة وراء النمط الظاهري في السطر 867 (0٪ CPR وP القيمة = 1.36e-14 على أساس ANOVA في اتجاه واحد). النمط الظاهري للتنكس العصبي في 867 الذباب هو متنحية لأن أدمغة الذباب heterozygous 867 التي تم تجاوزها إلى سلالة نوع البرية قابلة للمقارنة مع هذه من الضوابط (الشكل3A). باستخدام علم الأنسجة، رسم الخرائط meiotic تقع الطفرة في المواقع الخلوية 31-51، بين علامات phenotypic J (التشويش)و L (لوب) على كروموسوم Drosophila الثاني. باستخدام اختبار التسلق، رسم خرائط نقص بين المواقع الخلوية 31 و 51 مع خطوط من مجموعة نقص دروسوفيلا للكروموسوم 2L (DK2L)16 رسم خريطة الطفرة في منطقة تشمل 118 الجينات (الشكل3B; حيث 867/+ بمثابة السيطرة على التحليل الإحصائي). فحص النمط الظاهري للدماغ من 867 متحولة عبرت إلى خطوط نقص إضافية (الشكل3C)أكد أن الطفرة الواردة في منطقة الجينوم التي تشمل الشقيالجينات . يمكن العثور على قائمة كاملة بجميع الجينات الإضافية الواردة في هذه الحذفات في Flybase بالنقر على الرابط المقترن بالجزء المحذوف (على سبيل المثال، لDf(2L)ED1272 الجزء المحذوف هو 37C5-38A2). استنادا ً إلى الملاحظات السابقة التي تفيد بأن المتحولين الشقيين لديهم خلايا زائدة في عقولهم21، وهو النمط الظاهري الذي لوحظ أيضاً في 867 متحولاً، تم اختيار الشقي لتحليل تسلسل الحمض النووي. تحديد تسلسل سنجر لجين الشقي الذي يحتوي على منطقة الترميز الطارد للانبعاثات تغير G/A nucleotide في الموقع 37,739 من الجين (الشكل4A)،مما يؤدي إلى الجلايسين إلى حمض الجلوتاميك (G/E) تغيير في الموقف 470 من بروتين برات17 (الشكل4باء). وتؤكد تجارب الإنقاذ أن برات يلعب دوراً وقائياً عصبياً، حيث أن التعبير المفرط للجين الوظيفي في خط 867 يقمع النمط الظاهري للتوليد العصبي (الشكل5A). وعلاوة على ذلك، فإن النمط الظاهري في 867 متحولة تزداد سوءا مع مرور الوقت، مما يشير إلى أن الشقي يلعب دورا يعتمد على العمر في الحماية العصبية17 (الشكل5B).
الشكل 1 إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات الجديدة محصنة. (أ) استراتيجية الشاشة. (ب) تسلق جهاز اختبار الفحص. (ج) نتائج التسلق من قبل الذكور من 235 خطوط متجانسة ENU-mutagenized. يمثل المخطط الدائري نسب خطوط الطيران المختبرة التي تقع في 4 مجموعات من معدلات تمرير التسلق: 0٪، 1-20٪، 21-50٪، و 51-100٪. (D) النتائج من 1 طريقة ANOVA التحليل الإحصائي الذي تم مقارنة خطوط متحولة إلى متوسط ارتفاع قيمة النسبة المئوية لجميع خطوط اختبارها. يمثل الرقم لفئتي قيمة P: P < 0.05 (تغيير كبير) و P > 0.05 (غير تغيير كبير).
الشكل 2 شاشة الأنسجة الثانوية. H & E ملطخة أقسام منتصف الدماغ توضح، من اليسار إلى اليمين، لا تنكس عصبي، تنكس عصبي معتدل، وتأكيد تنكس الأعصاب. وقد أعيد اختبار ما مجموعه 51 خطا ً متجانساً من قبل علم الأنسجة بعد تحديد المرشحين الذين يستخدمون اختبار التسلق. تشير الأسهم إلى الثقوب في الدماغ التي تدل على تنكس الأعصاب. وتُظهر المنطقة التي تحيط بها الخطوط المنقطة التحلل العصبي الشديد الذي لوحظ في السطر 867.
الشكل 3 تحديد الجين الواقي للأعصاب: محمد الدوسري بعد رسم خرائط نقص باستخدام التسلق. (أ) تظهر صور تمثيلية لأقسام الدماغ المتوسط ملطخة H&E من 18-20 يوما ث1118 (التحكم)، heterozygous 867 (867/+)وhomozygous 867 الذباب متحولة. (ب) خط نقص Df(2L)ED1272 (BL_24116) لا يكمل النمط الظاهري 867 متحولة (الرسم البياني الأسود) على أساس التسلق. يظهر التحقق النسيجي أن خط Df(2L)ED1272 لا يكمل النمط الظاهري 867 التنبّر العصبي، في حين أن Df(2L)ED1315 (BL_9269) لا. يمثل الرسم البياني متوسط والانحراف المعياري من 5 تجارب تسلق لكل خط. تشير العلامات النجمية إلى أهمية استنادًا إلى ANOVA أحادية الاتجاه، حيث تمت مقارنة متوسط قيمة النسبة المئوية لكل خط بالقيمة المتوسطة للنسبة المئوية للخط 867/+ (الرسم البياني الأخضر). * P < 0.05, ** P < 0.01 و ***P < 0.001. (C) التمثيل التخطيطي لخطوط نقص إضافية تظهر عدم استكمال النمط الظاهري 867 من قبل علم الأنسجة. وقد تم تعديل هذا الرقم من Loewen وآخرون17; مقال نشر تحت رخصة المشاع الإبداعي إسناد 4.0 الدولية.
الشكل 4 نقطة طفرة في: محمد الدوسري الجينات يؤدي إلى تغيير الأحماض الأمينية في مجال لفائف لفائف من البروتين برات. (أ) نموذج الجينات الشقي والتمهيديات المستخدمة لتضخيم وتسلسل منطقة الترميز. (B) تسلسل الحمض النووي من locus شقي يحدد تغيير النيوكليوتيد الذي يؤدي إلى تغيير الأحماض الأمينية في مجال لفائف ملفوف من البروتين برات. وقد تم تعديل هذا الرقم من Loewen وآخرون17; مقال نشر تحت رخصة المشاع الإبداعي إسناد 4.0 الدولية.
الشكل 5 مزيد من التحليل: محمد الدوسري المسوخ يؤكد دورها في محصنة في دروسوفيلا. (أ) باستخدام نظام Gal-4>UAS22 ، فإن التعبير الخاص بالانفجار العصبي لجين الشقي الوظيفي ينقذ النمط الظاهري العصبي في 867 متحولاً. (ب) لوحظ التنكب العصبي المعتمد على العمر في 867 متحولا يحملون مراسل الجينات pcna-GFP. [برت] يماثل[شس] إلى الاسم من ال [برت] [ألّل] في خطّ 867, أيّ كان عيّنت [تشيزهد] ([شس]). تظهر هي أقسام الدماغ المتوسط الملطخة بـ H&E من yw (control) وhomozygous bratchs; pcna-GFP الذباب من الأعمار المشار إليها. وقد تم تعديل هذا الرقم من Loewen وآخرون17; مقال نشر تحت رخصة المشاع الإبداعي إسناد 4.0 الدولية.
| محطه | الوقت | درجه الحراره | فراغ / الضغط | حل |
| 1 | لا تأخير سريع بداية | |||
| 2 | قباله | قباله | قباله | |
| 3 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | 80% EtOH |
| 4 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | 95% EtOH |
| 5 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | 100٪ EtOH |
| 6 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | 100٪ EtOH |
| 7 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | 100٪ EtOH |
| 8 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | الإكسيلين |
| 9 | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | الإكسيلين |
| 10 سنوات | : 15 | 37 درجة مئوية | ON/ON | الإكسيلين |
| 11 | : 30 | 58 درجة مئوية | ON/ON | البارافين |
| 12 | : 15 | 58 درجة مئوية | ON/ON | البارافين |
| 13 | قباله | 58 درجة مئوية | قباله | البارافين |
| 14 سنة | : 15 | 58 درجة مئوية | ON/ON | البارافين |
الجدول 1: إعدادات البرنامج الموصى بها لمعالج الأنسجة التلقائي. يمكن استخدام الخطوات في الترتيب المذكور هنا مع معالج الأنسجة الآلي للرؤوس الثابتة.
| كاشف | حجم (ميكرولتر) |
| 10x إكستاك العازلة (ملغ2 + زائد) (20 MM) | 2.5 |
| التمهيدي إلى الأمام (10 درجة مئوية) | 2.5 |
| التمهيدي العكسي (10 درجة مئوية) | 2.5 |
| 2.5 مليون متر مربع | 2 |
| قالب الحمض النووي | 2 |
| تاكارا إكس تي كيو (5 U/μL) | 0.25 |
| المياه الخالية من النوكل | 13.25 |
| مجموع حجم | 25 |
الجدول 2: الكواشف المستخدمة لرد فعل PCR. الكواشف والمجلدات ذات الصلة المستخدمة في رد فعل PCR لتضخيم منطقة الترميزbrat.
| خطوه | درجه الحراره | الوقت |
| 35 دورة | 95 درجة مئوية | 15 s |
| 55 درجة مئوية | 45 s | |
| 72 درجة مئوية | 3 دقائق 10 s | |
| عقد | 4 درجة مئوية | ∞ |
الجدول 3: ظروف ركوب الدراجات الحرارية المستخدمة لPCR. يمكن استخدام الخطوات في الترتيب المذكور هنا لبرمجة دورة حرارية باستخدام مزيج التفاعل الموضح في الجدول2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكانت الشاشات الوراثية الأمامية في دروسوفيلا نهجا فعالا لتحديد الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الحماية العصبية المعتمدة على العمر5،23،24، 25.باستخدام هذه الاستراتيجية، كنا ناجحين في تحديد brat كجين جديد محصن17.
وتشمل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التوجه السليم للرؤساء (على النحو المبين في القسم 4-4-3) لتحليل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن علامات الخط المستخدمة لرسم الخرائط meiotic لا تتداخل مع النمط الظاهري للطفرة الجديدة (في هذه الدراسة: التنكّان العصبي). أوصينا بإجراء اختبار أولي للتأكد من أن العلامات المختارة لا تسبب التنكب العصبي الخاص بها. على سبيل المثال، التشويش (J) يسبب بثور الجناح التي يمكن أن تتداخل مع التسلق كما هو الحال بالنسبة للبروتين السلائف الأميلويد (APP) - الإفراط في التعبير عن الذباب التي لديها أيضا أجنحة نفطة26. الفص (L) يؤدي إلى انخفاض في حجم العين. ومع ذلك، نحن لا نلاحظ انحطاط الدماغ المركزي ويمكن استخدام هذه العلامة لرسم خريطة تنكس الأعصاب في الدماغ المركزي. دبوس وSternoplural (Sp) هي أيضا مناسبة للاستخدام، كما عقول الذباب تحمل هذه العلامات هي مماثلة لعقول الضوابط نوع البرية.
أحد عيوب المنهجية الوراثية المستقبلية في الذباب هو طول الوقت اللازم لتضييق المناطق من الحمض النووي إلى جين الفائدة3،5. ومن شأن استخدام استراتيجيات رسم الخرائط المحسنة27 إلى جانب توافر الجيل التالي من تكنولوجيات التسلسل 28 أن يتيح التعرف على الطفرات المرتبطة بالأنماط الظاهرية ذات الأهمية. يمكن أن تكون الشاشات الوراثية الأمامية كثيفة العمالة. على سبيل المثال، تأكيد الأنسجة، الذي يُفحص مباشرة لتنكس الأعصاب في الدماغ، وحده يتطلب قدراً كبيراً من الوقت. ومع ذلك، فإن هذا النهج سيكون أكثر صعوبة وتكلفة بكثير لأداء في نماذج الثدييات، لا يسمح بالضرورة دراسات وراثية واسعة النطاق. شاشات الطفرات الكيميائية مفيدة لأن تحديد الطفرات نقطة يمكن أن توفر معلومات حاسمة حول وظيفة منتجات الجينات المتضررة. تحديد طفرة نقطة تسبب تغيير الأحماض الأمينية في مجال محفوظ ة من بروتين برات (الشكل 4B) يوضح أهمية مجال لفائف لفائف هذا البروتين TRIM-NHL في الحماية العصبية18. اختبار التسلق، الذي يقيس السلوك الحركي، هو بالتأكيد مفيد من خلال السماح بإجراء اختبار سريع لأعداد كبيرة من الذباب للعيوب في التنقل، وينظر أيضا في كثير من الأحيان في تنكس الأعصاب البشرية25. ويمكن أيضا إجراء هذا التقييم في إعداد شاشة أخرى مثل نطاق الجينوم في الجسم الحي لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) الذي يمكن استخدامه لتحديد الجينات الواقية من الأعصاب. على الرغم من أننا خفضت المسافة بين الجزء السفلي من غرفة الاختبار وخط يمر من 8 سم10 إلى 5 سم لتحديد معدل مرور أكثر صرامة في هذه الدراسة، وانخفاض معدلات التسلق لا تعكس التنكّال العصبي لعدد كبير من الخطوط. قد يصبح التنكّد العصبي واضحًا بعد ظهور العيوب السلوكية، مما يعني أن الذباب قد يحتاج إلى أن يعمر لفترة أطول قبل ظهور الفراغات. وهناك احتمال آخر هو أن العيوب الحركية التي نلاحظها في خطوط معينة ليست بسبب الأداء العصبي المعيبة ولكن بدلا من ذلك إلى ضعف العضلات أو عدم اللياقة العامة أكثر من الذباب. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن نفتقد المرشحين المحتملين، حيث لا تظهر عيوب التسلق في سن أصغر (على سبيل المثال، 10 أيام من العمر) بل تصبح بارزة في وقت لاحق من الحياة. ومن المؤكد أن استراتيجية الفحص هذه يمكن تطبيقها لتحديد الجينات المعتمدة على العمر، وبالتالي القضاء على الجينات المرتبطة بالعيوب المحتملة في التطور العصبي. يمكن تعديل البروتوكول المعروض هنا اعتماداً على الاحتمال المطلوب لخطوط المرشحين لاحتواء الجين المتحول الذي ينطوي عليه الحماية العصبية. تخفيض عتبة معدل النجاح مباشرة هو وسيلة أخرى لتحقيق نفس النتيجة. ومن الناحية النظرية، فإن هؤلاء المرشحين سوف يظهرون قدرا أكبر من التنكال العصبي، مما يمكن أن يوفر الوقت والموارد أثناء التأكيد ورسم الخرائط.
بشكل عام، يصف البروتوكول طريقة مباشرة لفحص التنكّد العصبي ومن ثم تحديد المرشحين للجينات الواقية من الأعصاب. هذا النهج الوراثي لا يقتصر على السلوك والاختبارات النسيجية الموصوفة هنا، ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص الأنماط الظاهرية الأخرى مثل درجة الحرارة الحساسة (TS) الشلل، ووضع البيض أو الأنماط الظاهرية الخصوبة، على سبيل المثال لا الحصر. على سبيل المثال، من المعروف أن المسوخ المحفزة Drosophila ts غنية لتنكس الأعصاب29 ويمكن أن تمثل مصدرا إضافيا لتحديد الجينات العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن ممتنون بشكل خاص للدكتور باري غانتزكي، في مختبر الذي تم إجراء الشاشة الوراثية، مما يسمح بتحديد وتوصيف brat كجين محصن. نشكر الدكتور ستيفن روبينو على التكرم بتوفير مجموعة من الذباب ENU-mutagenized المستخدمة في الشاشة الوراثية المعروضة في هذه المقالة. نشكر أعضاء مختبر غانيتزكي، والدكتورغريس بوخوف فالك وديفيد واسارمان على المناقشات المفيدة طوال مدة هذا المشروع، لينغ لينغ هو وبوب كريبر على المساعدة التقنية، والدكتور آكي إيكيدا على استخدام مرفقه الصغير في جامعة ويسكونسن والدكتور كيم لاكي ومرفق التحليل البصري في جامعة ألاباما.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al.
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).
