Summary
我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。
Abstract
神経変性疾患の発症と進行について理解する多くがあります, 責任を負う基礎となる遺伝子を含む.化学変異原を用いた前方遺伝子スクリーニングは、ヒトと保存された細胞経路を共有するショウジョウバエおよび他のモデル生物の間で変異型を遺伝子にマッピングするための有用な戦略である。目的の変異遺伝子がハエの発達初期の段階で致死的でない場合、クライミングアッセイは、低上昇率などの脳機能低下の表現型指標をスクリーニングするために行うことができる。続いて、脳組織の二次組織学的解析は、神経変性型をスコアリングすることにより遺伝子の神経保護機能を検証するために行うことができる。遺伝子マッピング戦略には、これらの同じアッセイに依存するメオティックおよび欠乏マッピングが含まれており、その後にDNAシーケンシングを行い、目的の遺伝子におけるヌクレオチドの変化の可能性を特定することができます。
Introduction
ニューロンは、ほとんどの部分は有人性のポスト・マイトティックのためのものであり、1、2を分割することができません。ほとんどの動物では、神経保護機構は、特にニューロンが損傷に最も脆弱である老年期に、生物の寿命を通じてこれらの細胞を維持するために存在する。これらのメカニズムの基礎となる遺伝子は、神経変性を示す変異体、前方遺伝プロトコルを使用して、神経保護の喪失のための目の前の指標で同定することができる。エチルメタンスルホン酸エチル(EMS)やN-エチル-N-ニトロスア(ENU)などの化学変異を用いた前方遺伝スクリーンは、それらが誘発するランダムな点突然変異のために特に有用であり、本質的に公平なアプローチをもたらし、光を当てた本質的に公平なアプローチをもたらす真核生物モデル生物3,4,5における多数の遺伝子機能(対照的に、X線変異はDNA切断を作成し、点突然変異6ではなく再配列を引き起こす可能性がある)。
一般的なフルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、その高品質、よくアノテートゲノム配列、高度に発達した遺伝的ツールを持つモデル生物としての長い歴史、そして最も重要な、その共有のために、これらの画面のための理想的な被験者です人間との進化史7,8.このプロトコルの適用性の制限要因は、変異した遺伝子によって引き起こされる早期致死性であり、これは9歳での試験を妨げるだろう。しかし、非致死的変異の場合、負のジオタキシスを利用する登山アッセイは、単純であるが、広範であるが、運動機能障害を定量化する方法10である。十分な運動反応性を示すために、ハエは方向を決定し、その位置を感知し、動きを調整するために神経機能に依存する。したがって、刺激に応答してハエが十分に上昇することができないことは、神経学的欠陥11を示すことができる。特定の欠陥クライミング表現型が同定されると、脳組織の組織学的分析などの二次スクリーンを用いてさらなる試験を行い、クライミング欠陥ハエにおける神経変性を同定するために使用することができる。その後の遺伝子マッピングは、目的の欠陥のある神経保護遺伝子を運ぶ染色体上のゲノム領域を明らかにするために使用することができる。目的の染色体領域を絞り込むため、染色体上に既知の位置を有する支配的なマーカー遺伝子を運ぶ変異型フライラインを用いたマイオティックマッピングを行うことができる。マーカー遺伝子は、2つの遺伝子座間の組み換えの頻度が遺伝子のおおよその位置をマッピングするために使用できる測定可能な距離を提供するように、突然変異の基準点として機能します。最後に、目的の染色体領域にバランスのとれた欠陥を運ぶ線と変異線を交差させるには、その既知の表現型が発現された場合に目的の遺伝子を検証できる補体試験が作成される。同定された遺伝子における多形性ヌクレオチド配列は、おそらくアミノ酸配列の変化をもたらし、遺伝子をシーケンシングし、それをショウジョウバエのゲノム配列と比較することによって評価することができる。目的の遺伝子のその後の特徴付けは、追加の変異性ア列のテスト、突然変異救助実験および追加の文型の検査を含むことができる。
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Protocol
1. ハエの準備と老化
- 遺伝的スクリーンに使用されるショウジョウバエ変異体のコレクションを6を取得または生成します。ここでは、第2染色体にマッピングされ、CyO上でバランスがとれたENU変異線が用いられる。
- トウモロコシ糖蜜培地上で25°C、12時間の光/暗いサイクルに設定されたインキュベーターで実験遺伝子型ラインを増幅します。
- 各実験遺伝子型から成人のエクロションの0〜2日の間に約20ホモ接合子孫を収集します。一貫して男性または女性のハエのいずれかを収集することにより、セックスバイアスを排除します。
- 29°Cで必要に応じてコーンミール糖蜜培地でハエを老化させ、年齢を加えるにつれて新鮮な食べ物にハエを維持するために2〜3日ごとにバイアルを反転させる。ここに表示される画面では、ハエは10-12日間熟成されました。
- 前述の10として2つのバイアルおよびテープを使用してクライミングアッセイ試験室を組み立てる。バイアルは、両方の開いている端に接続する必要があります。定規を使用して、チャンバーの一方の端に 5 cm の線をマークします。
2. プロトコル 1: クライミングアッセイ (Ali et al.10から適応)
- クライミングアッセイを検証します。本研究では、Elav C155>UAS-TauR406W (低い登山合格率を示す) とElavC155>UAS-GFP (コントロール)とエラブC155>UAS-mCherry(コントロール)が飛ぶ。
- ハエを試験室に一度に1本ずつ反転させ(CO2麻酔を使用しない)、5分間回復できるようにします。異なる日にテストを行う場合は、1 日の同じ時間にアッセイを実行します。本研究では、全てのクライミングアッセイを午後に行い、移動運動12に対する概日効果を制御した。
注:テスト時にハエを直射日光にさらさないようにしてください。これは、彼らの登山能力を妨げるでしょう。 - すべてのハエが下部のアッセイを開始するように、固体表面に置かれたマウスパッド上のチャンバー(マークされた側面を下にマーク)を強制的にタップします。10sの期間にわたってフライ移動を観察します。
- この時間内に5cmラインに到達または通過するハエの数と、テストされたハエの総数を記録します。各試用の間に 1 分間待機してプロトコルを繰り返し、1 行につき最低 3 回の試用反復を行います。
注:本研究では、最初のスクリーニングのために2〜19ハエの間に含まれる各バイアル(オスハエ)と、交差した雌線の変異欠乏分析のための6〜21ハエの間に含まれる各バイアル(セクション5.3)。
3. プロトコル2:さらなる分析のためのショウジョウバエ菌株の選択
- 登山アッセイ データを Microsoft Excel または同様のソフトウェアに入力し、すべてのレプリケートに対する各行の上昇パスレートをパーセンテージで計算します。
-
統計分析を実行して、R ソフトウェア パッケージ13を使用して、すべての行の平均上昇パーセント値から大きく逸脱する変異線を検出します。
- R (変数または係数ごとに列を持つ.csv または .txt ファイル、および特定の値を表す行) 用にキュレーションされたデータ ファイルを読み取ります。
注:ここでは、男性(初期アッセイ)と女性(ライン867が欠損線に交差した行)のデータを2つの列として別々の.xlsxシートに入力し、1つは列の行が変異線を識別し、アッセイが複製された回数と他の行の場所に入力しました。ハエの反復バイアルごとに(パーセンテージとして)平均上昇の成功を表します。 - 次のコードを使用して、データを R に読み込みます。
mali<-read.csv("../male_init.csv")
フェムデフ<-read.csv(../fem_def_cross.csv")
注:パス ディレクトリの ".." は、ユーザーのコンピュータのルート ディレクトリからの絶対パスであり、コンピュータのディレクトリ パスに対して個々のユーザーが指定する必要があります。 - 線形モデリングの実行
- R のlm関数を使用してダミー変数回帰を実行します。変異線の初期解析では、ゼロ平均中心応答変数 (成功率) に対する総平均に対する上昇成功率に対する因子水準効果(変異線)の有意性を評価します。
注:セクション 3.2.3.2 のlm関数呼び出しの最後にある "-1" です。インターセプトを除去し、すべての因子レベルをゼロ平均中心の上昇合格率に対してテストすることができます。 - Rサマリー関数を使用して結果を画面に出力します。
マリ_アノバ<-lm(スケール(マリ$P_サクセス)~マリ$ミュータントライン -1)
要約(マリ_アノバ) - 次の R コードを使用して因子レベルの影響をテストするには、コントロールライン (存在する場合) をベースラインとして使用します。
フェムデフ_アノバ<-lm(フェムデフ$P_サクセス~x)
サマリー(フェムデフ_アノバ)
注:コードの最初の行は、負の制御線が、lm関数の組み込みの t-tests を使用して他のすべての因子水準 (変異行) がテストされるベースラインインターセプトになるように、因子レベルを並べ直します。
- R のlm関数を使用してダミー変数回帰を実行します。変異線の初期解析では、ゼロ平均中心応答変数 (成功率) に対する総平均に対する上昇成功率に対する因子水準効果(変異線)の有意性を評価します。
- R (変数または係数ごとに列を持つ.csv または .txt ファイル、および特定の値を表す行) 用にキュレーションされたデータ ファイルを読み取ります。
- テスト時の年齢に応じて、候補行のしきい値を選択します。閾値を決定するために、野生型と比較して神経変性および低上昇合格率を示す既知の変異体を用いて所望の年齢で予備試験を行い、制御ハエ10。
注:50%未満の合格率は、神経系10におけるヒト神経変性関連遺伝子タウを過剰発現するショウジョウバエラインについて以前に報告されているように、10日前のハエに適していてもよい。古いハエは、移動の減少を示すと予想されるので、より高い通過速度閾値を持つべきであり、したがって、神経変性の増加である。
4. プロトコル3:へろ学分析
- 手袋を着用し、クライミングアッセイに続く外科ブレードで頭部を切断し、4°Cで1.5MLのマイクロ遠心管O/Nでカルノイの固定(100%の6:3:1)の1 mLに穏やかに置くためにペイントブラシを使用します。固定ソリューションでヘッドがシンクされていることを確認します。
- 翌日の固定液を70%EtOHの1 mLに交換し、将来の分析のためにサンプルを4°Cのままに維持します。
注:プロトコルは、この手順で一時停止できます。 - ステップ 4.2 からヘッドを配置します。マイクロバイオプシーカセットあたり最大5個まで。直ちにカセットを70%EtOHで満たされた容器に入れます。頭部の処理とパラフィン埋め込みのための組織学施設に出荷する前に、4 °Cで容器を保管してください。組織処理および埋め込み用の装置が利用可能な場合は、手順 4.4 に従ってください。
- マイクロトーム断面化のためのパラフィンにヘッドを埋め込む:
- 表1に示す順序で自動組織処理機のプログラム設定に従って、頭部を脱水し、透明にし、浸透させる。
- パラフィン埋め込みステーションを使用して60°Cで加熱されたパラフィンを使用してカセットに適合する金属ベース金型にサンプルを転送します。
- 細かい鉗子を使用してベース金型の頭部(上部に向かう前形)を向け、セクション後の脳組織の適切な視覚化を可能にする。これは、60°Cでパラフィンを再加熱し、必要に応じてヘッドを再配置することによって行うことができます。
注:金型は使い捨てベース金型に置き換えることができます。 - 対応するベース金型の上部にカセットを配置し、パラフィン埋め込みステーション(4°C)の冷蔵側に穏やかに移動します。ブロックが硬化するまで待ってから、ステーションから取り外します。
- カセットから金型をそっと解離して金型を形成するブロックを取り外します。
- 断面前に各パラフィンブロックをトリムして、断面するサーフェスを最小限に抑えます。
- 各ブロックの5μmのセクションをカットするようにマイクロトームを設定します。
- 組織を含むパラフィンリボンを加熱水浴(35°C)に最大5分間置きます。
- 加熱された水浴にポリリジンコーティングされたスライド(組織を保持するのに役立ちます)を浸し、木製のアプリケーターを使用してスライドに断面リボンを配置します。スライドは室温で空気乾燥O/Nをしてみましょう。
- スライドウォーマーを使用して63 °Cで15分間スライドを加熱します。
- スライド染色ラックにスライドを置き、次の手順に従ってヒュームフードの下にヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色します。
- ラックをHistochoice(キシレンの非毒性置換、サンプルからパラフィンを除去するのに役立ちます)に5分間置きます。
- ヒストチョイスで満たされた容器にラックを5分間移します。
- 100% EtOH 1 で満たされたコンテナーにラックを 5 分間転送します。
- ラックを 100% EtOH 2 で 5 分間充填したコンテナーに転送します。
- 95% EtOH で満たされたコンテナーにラックを 3 分間転送します。
- 70% EtOH で満たされたコンテナーにラックを 3 分間転送します。
- 蒸留H2 Oで満たされた容器にラックを5分間移します。
- ハリス・ヘマトキシリンで満たされた容器にラックを2〜5分間移します。
- ヘマトキシリン溶液からラックを取り出し、水道水の下に10分間置きます。
- 短いダンクを行うことによって蒸留水で満たされた容器にラックを転送します。
- エオシンで満たされた容器にラックを1-2分間移します。
- 短いダンクを行うことによって、95%EtOHで満たされた容器にラックを転送します。
- ラックを 95% EtOH で満たされたコンテナーに 5 分間転送します。
- ラックを 100% EtOH で満たされたコンテナーに 5 分間転送します。
- ラックを 100% EtOH で満たされたコンテナーに 5 分間転送します。
- すべてのスライドが取り付けられるまで、ヒストチョイス(またはキシレン)で満たされた容器にラックを5~10分間移します。
- スライドとカバースリップ(24 mm x 60 mm)を取り付けます。鉗子を使用して、Histochoiceまたはキシレン溶液からスライドを取り出し、その上に取り付け媒体の薄いストリップを作ります。気泡の形成を避けるために、カバースリップを上にそっと置きます。
- 取り付けられたスライドの取り付け媒体は、分析の前にヒュームフードの下でO/Nを硬化させます。
- 染色したスライドを室温で箱に保管してください。
- 小顕微鏡下で20倍の倍率でスライド上のすべてのシリアルセクションを見て神経変性を定量します。3つの連続したセクションに現れる真空の大きさと数の定性的なメモを取って、脳全体を調べます。
- イメージングソフトウェアを搭載した光顕微鏡を用いて、ほぼ中脳の代表的な脳切片の画像を取得する。
5. プロトコル4:劣性ムタント表現型の遺伝子マッピング
- 候補線を野生型カントンS(BL_ 9517)または別の野生型または同種化株(例えば、オレゴンR(BL_2376)、w 1118(BL_5905)またはyw(BL_6599)に交差して、表現型が支配的であるか否かを判断する。 劣性。
注:この手順の結果は、マッピングの次の手順をガイドします。表現型が劣性である場合は、欠乏マッピングを実行できます。- ペイントブラシを使用して、目的の変異線(5オス)とカントンSライン(10-15処女雌)の食品含有バイアルCO2-麻酔ハエに置くことによって十字架を作ります。バイアルを25°Cに置きます。
- ヘテロジゴウスF1子孫を収集し、クライミングと階層学実験を繰り返します。
- 得られた結果を対照線のみとホモ接合変異体と比較する。不調表現型の良好な徴候は、ヘテロジゴス変異体が野生のタイプハエと同様の表現型を示す場合である。
- wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL_3227) または既知の主要マーカーに関連する同等の株を使用して、2番目の染色体上の突然変異の位置を大まかに推定するメオティックマッピングを実行します。細胞学的な場所。この場合、変異は以前に第2染色体上に位置することが知られていた。
- ペイントブラシを使用して、目的の変異線(5オス)とwgSp-1 J1 L2ピン1/CyOライン(10メス)の食品含有バイアルCO2-麻酔ハエに入れることによって十字架を作ります。バイアルを25°Cに置きます。
注:この十字架の目的は、新しい突然変異とマーカー染色体で染色体を運ぶヘテロザイゴウス雌を生成することです, これは、meiosisの間に再結合します 6,14.女性のF1子孫は、男性では組み換えが起こらないため、男性ではなく選択される。 - 新しい突然変異とマーカー染色体で染色体を運ぶ少なくとも15人の処女女性の子孫を収集し、別の目に見える支配的なマーカー(例えば、CyO/sna Sco(BL_2555)または)を運ぶバランスのとれたラインから5人の男性にそれらを渡します。等価)。
- ステップ5.2.2でScoまたはCyOのいずれかを運ぶヘテロジゴウス男性の子孫と、クロスから潜在的に再結合された染色体を収集します。そして、変異した染色体を運ぶストックから処女の女性にそれらを個別に交尾します。
- ステップ5.2.3で説明されている最後の十字架から子孫を収集します。そして29°Cでハエを熟成する(この研究ではハエを10〜14日間熟成した)。
- 頭部を収集し、プロトコル3に記載されているように、精片学的分析を実行し、ステップ4.11で説明されているように神経病理学の程度を決定するために脳セクションを持つスライドを見ます。血管学解析は、翼15の流体蓄積を引き起こすJammed(J)のような登山アッセイに影響を与える可能性のある表現型による移動解析ではなく行われる。
- ペイントブラシを使用して、目的の変異線(5オス)とwgSp-1 J1 L2ピン1/CyOライン(10メス)の食品含有バイアルCO2-麻酔ハエに入れることによって十字架を作ります。バイアルを25°Cに置きます。
- 染色体の狭い領域に欠乏マッピングを実行し、登山アッセイを使用して劣性変異の位置を絞り込みます。各欠乏線は、染色体の異なる領域の欠失を有し、それらを補体試験に使用することを可能にする。
- メオティック マッピングで識別された領域にまたがる大きな欠陥から始め、より小さな欠陥を使用してさらに絞り込むことができます。欠乏分析によって複数の候補遺伝子が生じる場合は、RNA干渉(RNAi)株を使用して標的にすることをお勧めします。
- 第2染色体(本研究ではDK2L)に対するショウジョウバエ欠乏キット16からのクロスラインと、関心のある表現型の非補体を探す(本研究では、合格率8.5%に相当する上昇合格率)ホモ接合飛行は、正のコントロールとして使用されるライン867から飛ぶ)。
- セクション4(プロトコル3)に記載されているように、神経変性表現型を、遺伝子学的検証を用いて確認する。
6. プロトコル5:DNAシーケンシングと解析
注:ENU変異は点突然変異11を導入することを留意してください。
- 目的領域のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅のためのブラット遺伝子のエキソンコード領域を横切る前方および逆プライマー配列を設計する(ライン867の場合には3,247 bpの大きさのDNA断片が増幅される)シーケンス17)。
-
単一のハエからDNAを抽出する 18:
- スキッシングバッファーの50 μLを含む0.5mLマイクロ遠心管(10 mM Tris-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM NaCl、および200 μg/mLプロテインナーゼK;酵素は、各使用前に凍結ストックから新鮮に希釈する必要があります) P000
- 37 °Cで30分間インキュベート
- チューブを95°Cに2分間置いてプロテアーネセKを不活性化します。
注:抽出されたDNAは、数ヶ月間4°Cで保存することができる。
- 高忠実度のDNAタクポリメラーゼを用いてPCR反応を行う(本研究で用いられる試薬および熱循環条件は、それぞれ表2および表3に示す)メーカーの指示に従って、PCR製品を1に実行する。エチジウム臭化物の非毒性の代替であるインビトロゲンSYBR安全DNAゲル染色を含む%アガロースゲル。
- ゲルから正しいサイズのバンドをメスで切除し、メーカーの指示に従ってウィザードSVゲルおよびPCRクリーンアップシステム(Promega)または同等のキットを使用してPCR製品を浄化します。
- 可能であれば、対象地域全体をカバーするためにDNAシーケンシングに使用される前方および逆プライマーを設計します。前のステップからゲル精製DNAを配列し、点の突然変異を同定する。自動蛍光サンガーシーケンシングの高精度は、最大700bpで実現可能です。
注:Ex Taqポリメラーゼ(TaKaRa)は、ゲノムDNAテンプレートから最大20kbのサイズのPCR製品を増幅するために使用することができます。 -
Aプラスミドエディタ(ApE、M.ウェイン・デイビス)または類似のソフトウェアを使用して得られたDNA配列を分析し、それらを整列させ、参照株の同じゲノム領域の配列決定後に得られた配列と比較することによって(例えば、もともと変異化された)ライン)。
- ApE でシーケンス ファイルを開きます。参考までに、FlybaseからFASTA形式でダウンロードされたブラット遺伝子のゲノムコンセンサス配列を含むApEファイル、または遺伝的背景制御のシーケンスの結果を含むファイル(例えば、もともと変異したショウジョウバエ)ライン)。
- [ツール]に移動し、シーケンスを整列します。コンピュータのマウスを使用して、比較するすべてのシーケンスを選択します。ドロップ メニューでこの配置に使用する参照シーケンスを示すことを忘れないでください。
- 基準配列と比較してヌクレオチドの変化がないか、配列領域を調べる。必要に応じて、[テキスト] をクリックしてコンピュータ上の位置合わせを.rtf 形式で保存し、 をクリックします。
注:突然変異が同定されなかった場合、DNAシーケンシングおよび解析プロトコルは、遺伝子の非コード領域を含むように設計されたプライマーで繰り返されます。
7. プロトコル6:候補遺伝子機能のさらなる解析
- 神経芽細胞で救助実験を行い、遺伝子ブラットが神経変性表現型の原因であるかどうかを判断する。
- UASブラット19と神経芽症特異的なworniu-Gal4(wor-G4)のストックと、第2染色体に位置する遺伝子ブラットの変異体である867ラインのダブルバランス染色 体。
- UAS-Brat、wor-G4、867ラインから3つの異なる食品含有バイアル5オスに配置することにより、3つの別々の十字架を作り、2番目のマーカーとバランサーを運ぶラインから男性10-15処女女性の各セットに追加しますそして第三染色体(Sp/CyO;博士/Tm3,sb;BL_59967)。
- 次のジェノタイプを持つ各十字架のF1から10-15処女雌を収集します: +/CyO;UASブラット/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3,sbおよび867/CyO;+/Tm3,sbおよび5人の男性の各ゲノムタイプ: +/Sp;UASブラット/Tm3,sb, +/Sp;wor-G4/Tm3,sbおよび867/CyO; +/Dr.
- クロスコレルクト+/CyO;UASブラット/Tm3、sb処女女性に+/Sp;UASブラット/Tm3、sb男性;別のバイアルで+/CyO;wor-G4 /Tm3、sb処女女性を+/Sp;wor-G4/Tm3、sbオス、次に3番目のバイアルクロス867/CyO;+/Tm3、sbバージンメスと867/CyO;+/Dr男性にします。
- これらの各十字架のF1から、次のゲノムの男性と女性の両方を収集します: Sp/CyO;UASブラット/Tm3,sb最初の十字架から, Sp/CyO; wor-G4/Tm3, 2番目のクロスからsbと867/CyO;Dr/Tm3,sb 2番目の十字架から
- 各F1子孫から収集された兄弟姉妹の間で最終的なクロスを実行し、3つのラインすべてに対して恒久的なダブルバランス株を確立します。
- UASブラットとwor-G4を867変異と組み合わせます。
- 867/CyOから処女雌の十分な数(〜20-30ハエ)を収集します。 Dr/Tm3,sbダブルバランスストックは、2つの十字架を実行します。
- Sp/CyOから約5人の男性と10-15処女の女性を配置します。UASブラット/Tm3、sb(クロス#1)と第2バイアルで〜5 Sp/CyO;wor-G4/Tm3、sbオス。
- 以下の種型を持つ各十字架のF1から兄弟姉妹を収集します:867/CyO;UASブラット/Tm3,クロス#1と867/CyO;wor-G4/Tm3,sbクロス#2からsb。各十字架から集めたF1子孫を使用して、兄弟姉妹を交わして永久的な株式を確立します。
注:この最後のステップに続いて、867/CyOの株式。UASブラット/Tm3、sbおよび867/CyO;wor-G4/Tm3、sbを生成する必要があります。
- 救助実験を実行します。
- 867/CyOから〜15-20処女の女性を収集し、wor-G4/Tm3、sbストックと株式867/CyOから5-10オスにそれらを渡ります。 UASブラット/Tm3,sb.コントロールとして、867/CyOからクロス〜15-20処女女性;wor-G4/Tm3、sbと867/CyOから〜15-20処女女性;UASブラット/Tm3、867/CyOラインのみにsbライン。
注:867ハエはブラットの温度感受性対立遺伝子を運び、救助十字架は29 °Cで行われるべきである。 - マークされたバランサーを慎重に選択することにより、各クロスから次のF1子孫を収集します: 867/867; wor-G4/UASブラット(レスキュー), 867/867; wor-G4/+ (コントロール) と867/867;UASブラット/+(コントロール)。
- 29 °Cでハエを必要に応じて老化させ、セクション4(プロトコル3)に記載のプロトコルを使用して神経変性を探すために脳の内訳分析を行います。
- 867/CyOから〜15-20処女の女性を収集し、wor-G4/Tm3、sbストックと株式867/CyOから5-10オスにそれらを渡ります。 UASブラット/Tm3,sb.コントロールとして、867/CyOからクロス〜15-20処女女性;wor-G4/Tm3、sbと867/CyOから〜15-20処女女性;UASブラット/Tm3、867/CyOラインのみにsbライン。
- UASブラット19と神経芽症特異的なworniu-Gal4(wor-G4)のストックと、第2染色体に位置する遺伝子ブラットの変異体である867ラインのダブルバランス染色 体。
- 867変異体における神経変性の年齢依存分析を行う。
- レポーター遺伝子(pcna-GFP)を運び、25°Cで生存可能であり、867単独で867よりも高い浸透性と高い表現性の両方を示す867;pcna-GFPおよびywコントロールハエを収集します。気温17.
- セクション1.4に記載されているように、ハエを5、15、25まで年齢を付け、セクション4(プロトコル3)のプロトコルに従ってその後のヒスロジー分析を実行します。
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Representative Results
このエアチクルでは、成人ハエにおける神経完全性の維持(例えば、神経保護)の維持に役割を果たす遺伝子脳腫瘍(ブラット)を同定するために用いられるステップを提示する17;神経保護に関与する遺伝子を同定するために使用できる方法論。我々は、前方遺伝的アプローチ(図1Aに概説されている戦略)を用いて、クライミングアッセイを用いて化学的に変異したハエのコレクションをスクリーニングした(このアッセイに使用される装置は図1Bに示されている)。235本のホモ接合線のうち、試験されたラインの約37%が10-12日齢で試験した場合、50%以下の上昇合格率を示した(図1C)。テストされたラインの58%は、一方通行のANOVA(図1D)を使用して、テストされたすべてのラインの平均上昇率値と比較した場合、有意に異なる上昇挙動を示しました。最も低い上昇パス率を示すラインの51のその後の組織学的スクリーンは、これらの線の29が神経変性を示す脳神経ピル(軽度から重度の至るまで)の穴の目に見える外観を示したことを明らかにした(図2)欠陥のある登山行動と重度の神経変性を示すラインの中で、867行目(0%CPRおよびP値=1.36e-14)の表現型の根底にある変異を一方通行のANOVAに基づいてマッピングすることを選択します。867ハエの神経変性表現型は、野生型株に交差したヘテロジゴウス867ハエの脳がこれらコントロールに匹敵するので、劣性である(図3A)。組織学を用いて、マイオティックマッピングは、2番目のショウジョフィラ染色体上のPhenotypicマーカーJ(ジャム)とL(ローブ)の間の31〜51細胞学的位置に変異を位置した。 クライミングアッセイを用いて、染色体2L(DK2L)16のショウジョウバエ欠乏キットの線を用いた細胞学的位置31と51の間の欠乏マッピングは、118遺伝子を包含する領域における変異をマッピングした(図3B;ここで 867/+ は統計分析の制御として機能します)。867変異体の脳表現型を調べると、追加の欠損線(図3C)に交差し、遺伝子ブラットを含むゲノムの領域に変異が含まれていることを確認した。これらの欠損に含まれるすべての追加遺伝子の完全なリストは、削除されたセグメントに関連付けられたリンクをクリックすることでFlybaseで見つけることができます(例えば、Df(2L)ED1272の場合、削除されたセグメントは37C5-38A2です)。ブラット変異体が脳21に超分子細胞を持っているという以前の観察に基づいて、867の変異体でも観察された表現型は、DNAシーケンシング分析のためにブラットが選択された。エキソンコード領域を含むブラット遺伝子のサンガーシーケンシングは、遺伝子の位置37,739位(図4A)でG/Aヌクレオチド変化を同定し、ブラットタンパク質17の位置でグリシンからグルタミン酸(G/E)に変化させる(図4B)。救助実験は、867行の機能性遺伝子の過剰発現が神経変性表現型を抑制するように、ブラットが神経保護的役割を果たしていることを確認する(図5A)。さらに、867変異体の表現型は時間の経過とともに悪化し、ブラットが神経保護17において年齢依存的な役割を果たしていることを示唆している(図5B)。
図 1:新しい神経保護遺伝子を同定するための前方遺伝スクリーン。(A) 画面戦略。(B) 登山アッセイ試験装置。(C) 235のホモ接性ENU変異線から男性のための登山アッセイ結果。円グラフは、登山合格率の4つのグループに分類されるテストされたフライラインの比率を表します:0%、1-20%、21-50%、および51-100%。(D) 変異線をテスト済みラインの平均上昇率値と比較した 1 ウェイ分散分析の結果。表される数値は、P < 0.05 (大幅な変更) と P > 0.05 (有意な変更ではない) の 2 つの P 値カテゴリの数値です。
図 2:二次的な精科スクリーン。H&E染色された中脳セクションは、左から右へ、神経変性、軽度の神経変性、および確認された神経変性を示す。登山アッセイを用いて候補者を同定した後、合計51本のホモ接性線が職学によって再試験された。矢印は、神経変性を示す脳の穴を示します。点線で囲まれた領域は、867行目で観察された重度の神経逸脱を示す。
図 3: 神経保護遺伝子の同定ブラット登山アッセイを用いた欠陥マッピングに従う。(A) 示すのは、18~20日前のW 1118(対照)、ヘテロ接性867(867/+)およびホモ接性変異ハエのH&E染色中脳切片の代表的な画像である。(B) 欠乏線Df(2L)ED1272(BL_24116)は、登山アッセイに基づく867変異型表現型(黒ヒストグラム)を補完しない。組織学的検証では、Df(2L)ED1272ラインは867の神経変性表現型を補完しないのに対し、Df(2L)ED1315(BL_9269)は補完しない。グラフは、各線の5つの上昇試験の平均と標準偏差を表します。アスタリスクは、各ラインの平均上昇パーセント値がライン 867/+ (緑のヒストグラム) の平均上昇パーセント値と比較された一方通行分散分析に基づく有意性を示します。* P < 0.05, ** P < 0.01 および ***P < 0.001.(C) 867表現型の非補体を示す追加欠損線の概略図。この数字はLoewen et al.17から変更されています。クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション4.0国際ライセンスに基づいて掲載された記事。
図 4: 点の突然変異ブラット遺伝子は、ブラットタンパク質のコイルコイルドメインのアミノ酸変化につながります。(A)コード領域の増幅およびシーケンシングに使用されるブラット遺伝子モデルおよびプライマー。(B)ブラット遺伝子座のDNAシーケンシングは、ブラットタンパク質のコイルコイルドメインにおけるアミノ酸変化につながるヌクレオチド変化を識別する。この数字はLoewen et al.17から変更されています。クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション4.0国際ライセンスに基づいて掲載された記事。
図 5: のさらなる分析ブラット突然変異体は、その神経保護の役割を確認します。ショウジョウバエ.(A) Gal-4>UAS系22を用いて、機能性ブラット遺伝子の神経芽細胞特異的発現は、867変異体における神経変性表現型を救出する。(B)加齢依存性神経変性は、レポーター遺伝子pcna-GFPを運ぶ867変異体で観察される。ブラットchsは、チーズヘッド(chs)と名付けられた867行のブラット対立遺伝子の名前に対応しています。示された年齢のyw(コントロール)およびホモ接質ブラットchs;pcna-GFPハエの代表的なH&E染色された中脳セクションが示された。この数字はLoewen et al.17から変更されています。クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション4.0国際ライセンスに基づいて掲載された記事。
| 駅 | 時間 | 温度 | 真空/圧力 | ソリューション |
| 1 | 遅延クイックスタートなし | |||
| 2 | オフ | オフ | オフ | |
| 3 | : 15 | 37 °C | オン/オン | 80%エトウ |
| 4 | : 15 | 37 °C | オン/オン | 95% エトウ |
| 5 | : 15 | 37 °C | オン/オン | 100% エトウ |
| 6 | : 15 | 37 °C | オン/オン | 100% エトウ |
| 7 | : 15 | 37 °C | オン/オン | 100% エトウ |
| 8 | : 15 | 37 °C | オン/オン | ザイレンス |
| 9 | : 15 | 37 °C | オン/オン | ザイレンス |
| 10歳 | : 15 | 37 °C | オン/オン | ザイレンス |
| 11歳 | : 30 | 58 °C | オン/オン | パラフィン |
| 12歳 | : 15 | 58 °C | オン/オン | パラフィン |
| 13歳 | オフ | 58 °C | オフ | パラフィン |
| 14歳 | : 15 | 58 °C | オン/オン | パラフィン |
表 1:自動組織プロセッサの推奨プログラム設定。ここに記載されている順序のステップは固定頭部のための自動化されたティッシュプロセッサと使用することができる。
| 試薬 | 体積(μL) |
| 10x ExTaq バッファ (Mg2+プラス) (20 mM) | 2.5年 |
| フォワードプライマー (10 μM) | 2.5年 |
| リバースプライマー(10 μM) | 2.5年 |
| 2.5 mM dNTP | 2 |
| テンプレート DNA | 2 |
| タカラエクスTq (5 U/μL) | 0.25分 |
| ヌクレス料フリー水 | 13.25ドル |
| 総ボリューム | 25名 |
表 2:PCR反応に使用される試薬。試薬およびPCR反応に使用されるそれぞれの容積は、ブラット-コード領域を増幅する。
| ステップ | 温度 | 時間 |
| 35サイクル | 95 °C | 15 s |
| 55 °C | 45 s | |
| 72 °C | 3 分 10 s | |
| 保持 | 4 °C | ∞ |
表 3:PCRに使用される熱循環条件。ここに示す順序のステップは、表2に示す反応ミックスを使用してサーマルサイクラーをプログラムするために使用することができる。
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Discussion
ショウジョウバエにおける前方遺伝スクリーンは、加齢依存性神経保護5、23、24、および、異なる生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定するための効果的なアプローチであった。25.この戦略を用いて、我々は新しい神経保護遺伝子17としてブラットを同定することに成功した。
このプロトコルの重要なステップの1つは、ヒスロジー分析のためのヘッドの適切な向き(セクション4.4.3.で説明されているように)を含みます。さらに、マイオティックマッピングに使用される線のマーカーは、新しい変異の表現型を妨げるべきではない(本研究:神経変性)。我々は、選択されたマーカーが自分自身の神経変性を引き起こさないことを確認するために、最初のテストをお勧めします。例えば、Jammed(J)は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)が羽ばたき翼26を有するハエを過剰発現する場合と同様に、登山を妨げる可能性のある翼水疱を引き起こす。ローブ(L)は、目のサイズの減少につながります;しかし、我々は中央脳変性を観察せず、このマーカーは、中央脳神経変性をマッピングするために使用することができます。これらのマーカーを運ぶハエの脳は野生のタイプコントロールの脳に匹敵するので、ピンとSternoplural(Sp)も使用するのに適しています。
ハエにおける前方遺伝的方法論の欠点の1つは、DNAの領域を対象遺伝子3,5に狭くするのに必要な時間の長さである。改善されたマッピング戦略27の使用と次世代シーケンシング技術28の利用可能性は、関心のあるフェノタイプに関連する変異の同定をさらに容易にする必要がある。前方遺伝スクリーンは労働集約的な場合があります。例えば、脳内の神経変性を直接アッセイする精力学の確認は、それだけでかなりの時間を必要とする。しかし、このアプローチは、哺乳類モデルで実行することははるかに困難で高価であり、必ずしも広範な遺伝子研究を可能にするとは限りません。化学変異スクリーンは、点の突然変異の同定が影響を受ける遺伝子の製品の機能に関する重要な情報を提供する可能性があるため、有利である。ブラットタンパク質の保存ドメインにおけるアミノ酸変化を引き起こす点変異の同定(図4B)は、神経保護18におけるこのTRIM-NHLタンパク質のコイルコイルドメインの重要性を示す。ローコモーター挙動を測定するクライミングアッセイは、移動性の欠陥に対して多数のハエを迅速にテストすることができ、ヒトの神経変性25にもしばしば見られることによって、確かに有利である。このアッセイは、神経保護遺伝子の同定に使用できる生体内RNA干渉(RNAi)スクリーンにおけるゲノムワイドなどの別のスクリーン設定でも行うことができる。本研究では、試験室の底部と通過線との距離を8cm10cmから5cmに減らしたが、低い上昇率は多数のラインに対する神経変性を反映しなかった。神経変性は行動上の欠陥の発症後に明らかになることがあり、ハエは空洞が現れる前に長く老化する必要があるかもしれない。もう一つの可能性は、我々が特定のラインで観察するロコ運動欠陥は、欠陥のある神経機能によるものではなく、むしろ筋肉の衰弱またはハエのより一般的な不適格によるものである。さらに、登山の欠陥が若い年齢(例えば10歳)で現れるのではなく、むしろ人生の後半に顕著になる潜在的な候補者を失っている可能性があります。このスクリーニング戦略は、確かに年齢依存性遺伝子を同定するために適用され、神経発達の潜在的な欠陥に関連する遺伝子を排除することができる。ここで提示されるプロトコルは、神経保護に関与する変異遺伝子を含む候補線の所望の確率に応じて調整することができる。合格率しきい値を直接下げることは、同じ結果を得るもう 1 つの手段です。これらの候補は、理論的には、確認とマッピング中に時間とリソースを節約することができ、より大きな神経変性を示すだろう。
一般に、プロトコルは、神経変性をスクリーニングし、その後神経保護遺伝子候補を同定する簡単な方法を説明する。この遺伝的アプローチは、ここで説明する挙動および組織学的アッセイに限定されず、温度感受性(ts)麻痺、卵産卵または不妊表現型のような他の表現型をスクリーニングするためにも使用され、いくつかのことを引用する。例えば、ショウジョウバエts麻痺変異体は、神経変性29のために濃縮することが知られており、神経保護遺伝子の同定のための追加の供給源を表すことができる。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
私たちは、遺伝的スクリーンが行われた研究室で、神経保護遺伝子としてのブラットの同定と特徴付けを可能にしたバリー・ガネツキー博士に特に感謝しています。私たちは、この記事で提示された遺伝的スクリーンで使用されるENU変異ハエのコレクションを親切に提供してくれたスティーブン・ロビナウ博士に感謝します。ガネツキー研究所のメンバー、グレース・ボーコフ・ファルク博士、デビッド・ワッサーマン博士に感謝申し上げます。ウィスコンシン大学、キム・ラッキー博士、アラバマ大学光学分析施設
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
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