Summary
Vi presenterer en protokoll ved hjelp av en frem genetisk tilnærming til skjermen for mutanter stiller neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Det inkorporerer en klatring analysen, histologi analyse, gen kartlegging og DNA-sekvensering til slutt identifisere romanen gener knyttet til prosessen med neuroprotection.
Abstract
Det er mye å forstå om utbruddet og progresjon av nevrodegenerative sykdommer, inkludert underliggende gener ansvarlig. Forward genetisk screening ved hjelp av kjemiske mutagener er en nyttig strategi for kartlegging mutant fenotyper til gener blant Drosophila og andre modell organismer som deler bevarte cellulære veier med mennesker. Hvis mutert genet av interesse er ikke dødelig i tidlige utviklingsmessige stadier av fluer, en klatring analysen kan gjennomføres på skjermen for fenotypiske indikatorer på redusert hjernefunksjon, for eksempel lav klatring priser. Deretter kan sekundær histologiske analyse av hjernevevet utføres for å verifisere nervecellene funksjon av genet ved scoring neurodegeneration fenotyper. Gene kartlegging strategier inkluderer meiotic og mangel kartlegging som er avhengige av de samme analysene kan etterfølges av DNA-sekvensering for å identifisere mulige nukleotid endringer i genet av interesse.
Introduction
Neurons er for det meste post-mitotisk og ute av stand til å dele1,2. I de fleste dyr, nervecellene mekanismer eksisterer for å opprettholde disse cellene i hele organismen levetid, spesielt i alderdommen når neurons er mest sårbare for skader. Gener underliggende disse mekanismene kan identifiseres i mutanter viser neurodegeneration, en fenotypiske indikator for tap av neuroprotection, ved hjelp av en frem genetisk protokoll. Videresende genetisk skjermene benytter kjemikalie mutagener som etanol methanesulfonate (EMS) eller N-etanol-N-nitrosourea (ENU) er spesielt nyttig på grunn av det tilfeldig punkt mutasjoner de indusere, resulterer inne en iboende upartisk adgang det har kaste lyset opp på tallrike gen funksjoner i eukaryote modell organismer3,4,5 (i kontrast, X-ray mutagenese skaper DNA-pauser og kan resultere i omorganisering snarere enn punkt mutasjoner6).
Den vanlige frukten fly Drosophila melanogaster er et ideelt emne for disse skjermene på grunn av sin høye kvalitet, godt kommentert Genova sekvens, sin lange historie som modell organisme med høyt utviklede genetiske verktøy, og mest betydelig, den delte evolusjonær historie med mennesker7,8. En begrensende faktor i anvendelsen av denne protokollen er tidlig dødelighet forårsaket av muterte gener, som ville hindre testing på gamle9år. Men for ikke-dødelige mutasjoner, en klatring analysen, som utnytter negative geotaxis, er en enkel, men omfattende, metode for kvantifisere nedsatt motorfunksjon10. Å vise tilstrekkelig Locomotor reaktivitet, fluer er avhengig av nevrale funksjoner for å bestemme retning, føle sin posisjon, og koordinere bevegelse. Manglende evne til fluer til tilstrekkelig stigning som følge av stimuli kan derfor indikere nevrologiske defekter11. Når en bestemt defekt klatring fenotype er identifisert, ytterligere testing ved hjelp av en sekundær skjerm som histologiske analyse av hjernevevet, kan brukes til å identifisere neurodegeneration i klatring-defekte fluer. Senere gen kartlegging kan deretter brukes til å avdekke den genomisk regionen på kromosom som bærer det defekte nervecellene genet av interesse. For å innskrenke den kromosom regionen av interesse, meiotic kartlegging ved hjelp av mutant fly linjer bærer dominerende markør gener med kjente steder på kromosom kan utføres. Markør gener fungerer som et referansepunkt for mutasjon som frekvensen av rekombinasjon mellom to Loci gir en målbar avstand som kan brukes til å kartlegge omtrentlig plassering av et gen. Til slutt, krysser de muterte linjene med linjer som frakter balanserte mangler på meiotically kartlagt kromosom regionen av interesse, skaper en komplementering test der genet av interesse kan verifiseres hvis dens kjente fenotype uttrykkes5. Polymorfe nukleotid sekvenser i identifiserte genet, muligens resulterer i en endret aminosyre sekvenser, kan evalueres ved sekvensering genet og sammenligne den med Drosophila Genova sekvensen. Senere karakterisering av genet av interesse kan inkludere testing av ytterligere mutant alleler, mutasjon redning eksperimenter og undersøkelse av ytterligere fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og aldring av fluer
- Skaff eller Generer6 en samling av Drosophila mutanter som skal brukes for den genetiske skjermen. Her brukes ENU-mutagenized linjer som er tilordnet til det andre kromosom og balansert over CyO .
- Forsterke eksperimentelle genotype linjer i en inkubator satt ved 25 ° c, 12 h lys/mørk syklus på cornmeal-sirup medium.
- Samle rundt 20 homozygote avkom mellom 0-2 dager med voksen eclosion fra hver eksperimentelle genotype. Eliminer sex bias ved konsekvent å samle enten mannlige eller kvinnelige fluer.
- Alder fluene på cornmeal-sirup medium som ønsket ved 29 ° c, snu hetteglassene hver 2-3 dager for å opprettholde fluene på fersk mat som de eldes. I skjermbildet som presenteres her, fluer var alderen for 10-12 dager.
- Sett sammen en klatring analysen testing kammer med to hetteglass og tape som tidligere beskrevet10. Hetteglassene skal kobles til begge de åpne endene. Bruk en linjal for å markere en 5 cm linje i den ene enden av kammeret.
2. protokoll 1: klatring analysen (tilpasset fra Ali et al.10)
- Valider klatre analysen. I denne studien, teste klatring analysen basert på tidligere beskrevet metodikk av Ali et al.10, bruker ELAVC155> UAS-tauR406W (stiller lavere klatring pass priser) og ElavC155> UAS-GFP ( kontroll) og ElavC155≫ UAS-mCherry (kontroll) fluer.
- Vend fluene inn i et testkammer, en linje om gangen (ikke bruk CO2 anestesi) og tillate dem å utvinne i 5 min. Hvis testing er gjort på forskjellige dager, utføre analysen på samme tid av dagen. I denne studien ble alle klatre analysene utført på ettermiddagen for å kontrollere for døgn effekter på bevegelse12.
Merk: Unngå å utsette fluene for direkte sollys ved testing; Dette vil forstyrre deres evne til å klatre. - Makt trykk kammeret (merket side ned) på en musematte plassert på en solid overflate 3 ganger slik at alle fluer begynne analysen nederst. Observer flue bevegelse over en periode på 10 s.
- Record antall fluer som kommer eller passerer 5 cm linje innenfor denne tiden, samt det totale antall fluer testet. Gjenta protokollen, venter 1 min mellom hver prøve, for minimum 3 prøve replikerer per linje.
Merk: I denne studien inneholdt hvert hetteglass mellom 2 og 19 fluer for den første screening (mannlige fluer) og mellom 6 og 21 fluer for mutant mangel analyse av kryssende kvinnelige linjer (§ 5,3.).
3. protokoll 2: valg av Drosophila -stammer for videre analyse
- Angi klatring analysen data i Microsoft Excel eller lignende programvare og beregne klatring pass rate for hver linje over alle replikerer som en prosentandel.
-
Utføre statistisk analyse for å oppdage mutant linjer som avviker vesentlig fra gjennomsnittlig klatring prosentverdien av alle linjer ved hjelp av R programvarepakke13.
- Lese inne datafil-størrelse vurdert for R (. CSV eller. txt fil-størrelse med en søylen for hver variabel eller faktoren, og rekkene representerer det spesifikk verdier).
Merk: Her, data for menn (første analysen) og kvinner (linje 867 krysset til mangel linjer) ble inngått separat. xlsx ark som to kolonner, en der radene i kolonnen identifisere mutant linje og hvor mange ganger analysen ble kopiert og den andre der rader representerer gjennomsnittlig klatring suksess (i prosent) for hver gjenskape hetteglass med fluer. - Les dataene til R ved hjelp av følgende kode:
Mali <-Read. csv (".. /male_init.csv")
femdef <-Read. csv (".. /fem_def_cross.csv")
Merk: Den ".." i banen katalogene er absolutte stier fra rotkatalogen på brukerens datamaskin, og må angis av den enkelte bruker for sin datamaskin katalog baner. - Utfør lineær modellering
- Utfør dummy variabel regresjon med lm -funksjonen i R. For den første analysen av mutant linjer, evaluere betydningen av faktor nivå effekter (mutant linjer) på prosent klatring suksess mot den store gjennomsnittet for en null bety sentrert svar variabel (prosent suksess).
Merk: "-1" på slutten av lm -3.2.3.2 i avsnitt. fjerner skjæringspunktet og tillater oss å teste alle faktor nivåer mot null bety sentrert gjennomsnitt av prosent klatring pass rate. - Skriv ut resultatene på skjermen ved hjelp av funksjonen R Summary :
mali_anova <-lm (skala (Mali $ P_Success) ~ Mali $ Mutant_line-1)
oppsummering (mali_anova) - Bruke kontroll linjer (hvis de finnes) som grunnlinje for test faktor nivå effekter mot å bruke følgende R-kode: x <-relevel (femdef $ Mutant_line, ref = "a867_plus")
femdef_anova <-lm (femdef $ P_success ~ x)
oppsummering (femdef_anova)
Merk: Den første kodelinjen omorganiserer faktor nivåene slik at den negative kontroll linjen blir grunnlinje skjæringspunktet som alle andre faktor nivåer (muterte linjer) testes mot med de innebygde t-testene i lm -funksjonen.
- Utfør dummy variabel regresjon med lm -funksjonen i R. For den første analysen av mutant linjer, evaluere betydningen av faktor nivå effekter (mutant linjer) på prosent klatring suksess mot den store gjennomsnittet for en null bety sentrert svar variabel (prosent suksess).
- Lese inne datafil-størrelse vurdert for R (. CSV eller. txt fil-størrelse med en søylen for hver variabel eller faktoren, og rekkene representerer det spesifikk verdier).
- Velg en terskel for kandidat linjer avhengig av alder på tidspunktet for testingen. For å bestemme terskelen, utføre en foreløpig test på ønsket alder ved hjelp av kjente mutanter som viser neurodegeneration og lav klatring pass priser i forhold til vill type, har kontroll fluer10.
Merk: En bestått sats under 50% kan være hensiktsmessig for 10 dager gamle fluer som tidligere rapportert for Drosophila linjer overexpressing den menneskelige neurodegeneration-relaterte genet tau i nervesystemet10. Eldre fluer bør ha en høyere bestått rate terskel siden de forventes å vise redusert bevegelse, og dermed økt neurodegeneration.
4. protokoll 3: histologi analyse
- Iført hansker, Sever fly hoder med et kirurgisk blad etter klatring analysen og bruke en pensel til å forsiktig plassere dem i 1 mL Carnoy ' s bindemiddel (6:3:1 av 100% EtOH: kloroform: isbre eddiksyre) i en 1,5 mL mikro sentrifugerør O/N ved 4 ° c. Pass på at hodene synker i bindemiddel løsningen.
- Erstatt den bindemiddel løsningen dagen etter med 1 mL 70% EtOH og oppretthold prøvene fortsatt ved 4 ° c for fremtidig analyse.
Merk: Protokollen kan være midlertidig stanset på dette trinnet. - Plasser hodene fra trinn 4,2. maksimalt fem per microbiopsy kassett. Plasser kassettene umiddelbart i en beholder fylt med 70% EtOH. Oppbevar beholderen ved 4 ° c før forsendelse til et histologi anlegg for prosessering og parafin innebygging av hodene. Hvis utstyr for behandling av vev og innebygging er tilgjengelig, følger du trinn 4,4.
- Bygg inn hodene i parafin for mikrotomen snitting:
- Følg programmet innstillingene for en automatisert vev-prosessering maskin i den rekkefølgen som presenteres i tabell 1 til tørke, klar og infiltrere med parafin hodene.
- Overfør prøvene til metall base formene som passer til kassetten ved hjelp av parafin som varmes opp ved 60 ° c ved hjelp av en para fin bygge stasjon.
- Orientere hodene (Antero-bakre orientering mot toppen) i basen mold ved hjelp av fine tang for å tillate riktig visualisering av hjernevevet etter snitting. Dette kan gjøres ved å oppvarming parafin ved 60 ° c og flytte hodene om nødvendig.
Merk: Metall muggsopp kan erstattes av en gangs base muggsopp. - Plasser kassetten på toppen av den tilsvarende base formen, og Flytt disse forsiktig til den avkjølte siden av para fin bygge stasjonen (4 ° c). Vent til blokken stivner før du fjerner den fra stasjonen.
- Fjern blokken danner mold ved forsiktig dissociating mold fra kassetten.
- Trim hver para fin blokk før snitting for å minimere overflaten som skal delt.
- Sett mikrotomen til å kutte 5 μm deler av hver blokk.
- Plasser delt para fin bånd som inneholder vevet i et oppvarmet vannbad (35 ° c) i maksimalt 5 min.
- Dypp en Poly-lysin belagt lysbilde (bidrar til å beholde vevet) i oppvarmet vannbad, plassere delt bånd på lysbildet ved hjelp av tre applikatorer. La lysbildene lufttørke O/N ved romtemperatur.
- Varm opp lysbildene i 15 min ved 63 ° c med et lysbilde varmere.
- Plasser lysbildene på et lysbilde med farge stativ og beis med hematoksylin og eosin (H & E) under en avtrekks hette ved å respektere følgende trinn.
- Plasser stativet i Histochoice (ikke giftig erstatning av xylen, som bidrar til å fjerne parafin fra prøven) i 5 min.
- Overfør stativet i en beholder fylt med Histochoice i 5 min.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 100% EtOH 1 i 5 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 100% EtOH 2 i 5 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 95% EtOH i 3 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 70% EtOH i 3 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med destillert H2O i 5 min.
- Overfør stativet i en beholder fylt med Harris Hematoksylin i 2-5 min.
- Ta stativet ut av Hematoksylin løsningen og plasser den under rennende vann fra springen i 10 min.
- Overfør stativet i en beholder fylt med destillert vann ved å gjøre en kort dunk.
- Overfør stativet i en beholder fylt med Eosin for 1-2 min.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 95% EtOH ved å gjøre en kort dunk.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 95% EtOH i 5 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 100% EtOH i 5 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med 100% EtOH i 5 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fylt med Histochoice (eller xylen) i 5-10 min. til alle lysbildene er montert.
- Monter skyve-og dekkglass (24 mm x 60 mm i størrelse). Bruke tang, ta lysbildet ut av Histochoice eller xylen løsning og lage en tynn stripe av montering medium på toppen av det. Forsiktig plassere dekkglass på toppen, prøver å unngå dannelse av bobler.
- La monterings mediet på monterte sklier herde O/N under avtrekks panseret før analyse.
- Lagre fargede lysbilder i en boks ved romtemperatur.
- Kvantifisere neurodegeneration ved å se på alle serielle seksjoner på lysbildet ved 20x forstørrelse under et lett mikroskop. Undersøk hele hjernen og ta kvalitative noter av størrelse og antall vakuoler som vises i tre påfølgende seksjoner.
- Få bilder av representative hjernen seksjoner på omtrent midten av hjernen ved hjelp av et lett mikroskop utstyrt med tenkelig programvare.
5. protokoll 4: gen kartlegging av Resessivt Mmutant fenotype
- Parre ut kandidat linjen til en vill type CantonS (BL_ 9517) eller en annen vill type eller isogenized stamme (f.eks. OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) eller yw (BL_ 6599) for å avgjøre om fenotype er dominerende eller resessivt.
Merk: resultatene fra dette trinnet vil lede de neste trinnene i kartleggingen. Hvis fenotype er resessivt, så mangel kartlegging kan utføres.- Bruk en pensel, lage et kryss ved å plassere i en mat-inneholdende hetteglass CO2-anesthetized fluer i mutant linjen av interesse (5 hanner) og CantonS linje (10-15 jomfru kvinner). Plasser hetteglasset ved 25 ° c.
- Samle heterozygot F1 avkom og gjenta klatring og histologi eksperimenter.
- Sammenlign oppnådde resultatene til kontroll linjen alene og til homozygote mutanter. En god indikasjon på resessivt fenotype vil være hvis heterozygot mutanter utstillingen lignende fenotyper som vill type fluer.
- Utfør meiotic kartlegging til grovt anslå plasseringen av mutasjonen på det andre kromosom ved hjelp av WGSP-1 J1 L2 PIN1/CyO (BL_3227) eller en tilsvarende stamme med tilhørende dominerende markører på kjente cytologisk plassering. I dette tilfellet var mutasjonen tidligere kjent for å være plassert på det andre kromosom.
- Ved hjelp av en pensel, lage et kryss ved å plassere i en mat-inneholdende hetteglass CO2-anesthetized fluer i mutant linjen av interesse (5 hanner) og WGSP-1 J1 L2 PIN1/CyO linje (10 kvinner). Plasser hetteglasset ved 25 ° c.
Merk: Målet med dette korset er å generere heterozygot hunner som bærer kromosom med den nye mutasjonen og markør-kromosom, som vil recombine under meiose6,14. Kvinne F1 avkom er valgt i stedet for menn siden rekombinasjon ikke forekommer hos menn. - Samle minst 15 jomfru kvinnelige avkom bærer kromosom med den nye mutasjonen og markør kromosom og krysse dem til 5 hanner fra en balansert linje som bærer en annen synlig dominerende markør (f. eks CyO/SNASCO (BL_2555) eller tilsvarende).
- Samle heterozygot mannlig avkom bærer enten SCO eller CyO og potensielt saman kromosom fra korset i trinn 5.2.2. og individuelt kompis dem til jomfru kvinner fra aksjen bærer mutert kromosom.
- Samle avkom fra siste kryss beskrevet i trinn 5.2.3. og alder fluene på 29 ° c (i denne studien fluene var alderen for 10-14 dager).
- Samle hoder, utføre histologi analyse som beskrevet i protokoll 3 og se på lysbildene med hjernen seksjoner for å fastslå graden av neuropatology som beskrevet i trinn 4,11. Histologi analyse utføres i stedet for bevegelse analyse på grunn av fenotyper som kan påvirke klatring analysen, som fastkjørte (J), som forårsaker væske buildup i vingene15.
- Ved hjelp av en pensel, lage et kryss ved å plassere i en mat-inneholdende hetteglass CO2-anesthetized fluer i mutant linjen av interesse (5 hanner) og WGSP-1 J1 L2 PIN1/CyO linje (10 kvinner). Plasser hetteglasset ved 25 ° c.
- Utføre mangel kartlegging på smalere område av kromosom å avgrense plasseringen av resessivt mutasjon bruker klatring analysen. Hver mangel linje har en sletting av ulike regionen av kromosomer, slik at de kan brukes til komplementering testing.
- Start med store mangler som spenner over regionen identifisert i meiotic kartlegging, som deretter kan ytterligere begrenses ned ved bruk av mindre mangler. Hvis mangelen analysen resulterer i mer enn én kandidat genet, bruk av RNA forstyrrelser (RNAi) aksjer anbefales å målrette dem.
- Kryss linjer fra Drosophila -mangel Kit16 for det andre kromosom (DK2L i denne studien) og se etter ikke-komplementering av fenotype av interesse (i denne studien: klatring pass rate på 8,5% som tilsvarer pass rate av homozygote fluer fra linje 867 brukes som positiv kontroll).
- Bekreft neurodegeneration fenotype ved hjelp av histologi verifisering som beskrevet i avsnitt 4 (protokoll 3).
6. protokoll 5: sekvensering og analyse av DNA
Merk: Husk at ENU mutagenese introduserer punkt mutasjoner11.
- Design fremover og bakover primer sekvenser flankerer den ekson-regionen av ungen genet for forsterkning av polymerase kjedere reaksjon (PCR) av regionen av interesse (i tilfelle av linje 867 en DNA fragment av størrelsen på 3 247 BP forsterkes for sekvensering17).
-
Ekstrakt DNA fra en enkelt fly18 :
- Squish forsiktig i et 0,5 mL mikro sentrifugerør inneholdende 50 μL av squishing buffer (10 mM Tris-CL pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl og 200 μg/mL proteinase K; enzymet må fortynnes friskt fra en frossen lager før hver bruk) ved hjelp av en P100 eller P200 Pipet spiss.
- Ruge for 30 min ved 37 ° c
- Deaktiver proteinase K ved å plassere røret ved 95 ° c i 2 minutter.
Merk: Det utpakkede DNA kan oppbevares ved 4 ° c i flere måneder.
- Utfør PCR-reaksjonen ved hjelp av et høyverdig DNA-Taq polymerase (reagenser og termiske sykkelforhold som brukes i denne studien, vises i henholdsvis tabell 2 og tabell 3) ved å respektere PRODUSENTENS instruksjoner og kjøre PCR-produktet på en 1 % agarose gel inneholder Invitrogen SYBR safe DNA gel stain, som er et ikke-giftig alternativ av Etidiumbromid bromide.
- Avgift bandet av riktig størrelse fra gelen med en skalpell og renser PCR-produktet ved hjelp av Wizard SV gel og PCR Clean-up system (Promega) eller tilsvarende Kit, ved å respektere produsentens instruksjoner.
- Design forover og bakover primere som skal brukes til DNA-sekvensering for å dekke hele regionen av interesse, hvis mulig. Sekvens av gel-renset DNA fra forrige trinn for å identifisere punkt mutasjoner. Høy nøyaktighet i automatiserte fluorescerende sanger sekvensering kan oppnås for opptil 700 BP.
Merk: Ex Taq polymerase (TaKaRa) kan brukes til å forsterke PCR-produkter fra genomisk DNA-maler opptil 20 kB med størrelse. -
Analyser innhentet DNA-sekvenser ved hjelp av A plasmider Editor (ApE, av M. Wayne Davis) eller lignende programvare ved å justere dem og sammenligne dem til sekvenser innhentet etter sekvensering av samme genomisk regionen av en referanse stamme (f. eks opprinnelig mutagenized linje).
- Åpne sekvensering filer med ApE. Som referanse, bruk en ApE-fil som inneholder genomisk konsensus sekvensen av ungen genet lastet ned i en FASTA format fra flybase, eller en fil som inneholder resultater for sekvensen av genetisk bakgrunn kontroll (f. eks opprinnelig mutagenized Drosophila linje).
- Gå til verktøy, og Juster deretter sekvenser. Velg alle sekvensene du vil sammenligne, ved hjelp av datamaskinens mus. Husk å angi referanse sekvensen som brukes for denne justeringen, i slipp menyen.
- Inspiser det sekvensielle området for nukleotid endringer i sammenligning med referanse sekvensen. Hvis ønskelig, lagre justeringen på datamaskinen i RTF-format ved å klikke på tekst, og deretter Lagre.
Merk: Hvis ingen mutasjoner ble identifisert, DNA sekvensering og analyse protokollen vil bli gjentatt med primere utformet for å inkludere ikke-koding regioner av genet.
7. protokoll 6: videre analyse av kandidat gen funksjon
- Utfør rednings eksperimenter i neuroblasts for å avgjøre om genet ungen er ansvarlig for neurodegeneration fenotype.
- Dobbelt balanse en UAS-ungen19 og en neuroblast-spesifikke worniu-Gal4 (de er-G4) aksjer bærer konstruksjoner på det tredje kromosom, samt 867-linjen, som er mutant for genet ungen ligger på den andre Kromosom.
- Lag tre separate kors ved å plassere i tre forskjellige mat-inneholdende hetteglass 5 menn fra UAS-ungen, og 867 og legge til i hvert sett av menn 10-15 jomfru kvinner fra en linje bærer markører og Fordelinger for andre og tredje kromosomer (SP/CyO; Dr/Tm3, SB; BL_59967).
- Samle 10-15 jomfru kvinner fra F1 av hvert kors med følgende genotyper: +/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB, +/CyO; Tm3, SB og 867/CyO; +/Tm3, SB og 5 menn av hver av de følgende genotyper: +/SP; UAS-ungen/Tm3, SB, +/SP; Tm3, SB og 867/CyO; +/Dr.
- Kryss collelcted +/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB jomfru kvinner til +/SP; UAS-ungen/Tm3, SB menn; i et separat hetteglass gjør et andre kors med +/CyO;/Tm3, SB Virgin hunner til +/SP; Tm3, SB hanner og deretter i et tredje hetteglass kryss 867/CyO; +/Tm3, SB Virgin hunner og 867/CyO; +/Dr hanner.
- Fra F1 av hver av disse krysser, samle både menn og kvinner av følgende genotyper: SP/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB fra første kryss, SP/CyO; i-G4/Tm3, SB fra andre kors og 867/CyO; Dr/Tm3, SB fra andre korset.
- Utfør et siste kryss mellom brødre og søstre samlet inn fra hver F1 avkom å etablere permanent dobbelt balansert aksjer for alle tre linjer.
- Kombiner UAS-ungen og ha -G4 med 867 mutasjon.
- Samle tilstrekkelig antall (~ 20-30 fluer) av jomfru kvinner fra 867/CyO; Dr/Tm3, SB dobbelt balansert lager til å utføre to kors.
- Plasser 10-15 jomfru hunner med ~ 5 hanner fra SP/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB (cross #1) og i et andre hetteglass 10-15 jomfru hunner med ~ 5 SP/CyO; Tm3, SB hanner.
- Samle brødre og søstre fra F1 av hvert kors med følgende genotyper: 867/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB fra kryss #1 og 867/CyO; i-G4/Tm3, SB fra Cross #2. Bruk samlet F1-avkom fra hvert kryss for å etablere permanente aksjer ved å krysse brødre og søstre mellom dem.
Merk: Etter dette siste trinnet, aksjer for 867/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB og 867/CyO; Tm3, SB skal genereres.
- Utfør redningsforsøket.
- Samle ~ 15-20 jomfru kvinner fra 867/CyO; Tm3, SB Stock og krysse dem til 5-10 menn fra aksjen 867/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB. Som kontroll, kryss ~ 15-20 jomfru kvinner fra 867/CyO; i-G4/Tm3, SB og ~ 15-20 jomfru kvinner fra 867/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB linje til 867/CyO linje alene.
Merk: 867 fluer bære en temperatur følsom allel av ungen og rednings korset bør utføres ved 29 ° c. - Samle følgende F1-avkom fra hvert kors ved å nøye velge bort markerte fordelinger: 867/867; i arbeidet-G4/UAS-ungen (redning), 867/867; arbeidet-G4/+ (kontroll) og 867/867; UAS-ungen/+ (kontroll).
- Alder fluene som ønsket ved 29 ° c og utføre histologi analyse på hjernen for å se etter neurodegeneration ved hjelp av protokollen som er beskrevet i avsnitt 4 (protokoll 3).
- Samle ~ 15-20 jomfru kvinner fra 867/CyO; Tm3, SB Stock og krysse dem til 5-10 menn fra aksjen 867/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB. Som kontroll, kryss ~ 15-20 jomfru kvinner fra 867/CyO; i-G4/Tm3, SB og ~ 15-20 jomfru kvinner fra 867/CyO; UAS-ungen/Tm3, SB linje til 867/CyO linje alene.
- Dobbelt balanse en UAS-ungen19 og en neuroblast-spesifikke worniu-Gal4 (de er-G4) aksjer bærer konstruksjoner på det tredje kromosom, samt 867-linjen, som er mutant for genet ungen ligger på den andre Kromosom.
- Utføre alders avhengig analyse av neurodegeneration i 867 mutanter.
- Samle 867; pcna-GFP og yw kontroll fluer, som bærer et reporter gen (pcna-GFP) og er levedyktig ved 25 ° c og viser både høyere penetrans og høyere ekspressivitet av neurodegeneration fenotype enn 867 alene på dette temperatur17.
- Alder fluene opp til 5, 15 og 25 som beskrevet i § 1,4 og utføre påfølgende histologi analyse ved å følge protokollen i § 4 (protokoll 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne aerticle presenterer vi trinnene som brukes for å identifisere genet hjernesvulst (ungen) som spiller en rolle i vedlikehold av neuronal integritet (f. eks, neuroprotection) i voksen fluer17; en metodikk som kan brukes til å identifisere gener som er involvert i neuroprotection. Vi brukte en frem genetisk tilnærming (strategien er skissert i figur 1a) til skjermen gjennom en samling av kjemisk mutagenized fluer ved hjelp av en klatring analysen (apparatet brukes til denne analysen er vist i figur 1B). Blant 235 homozygote linjer, viste ca 37% av testede linjer en klatring pass rate under 50% når testet i en alder av 10-12 dager (figur 1C). 58% av testede linjer viste signifikant forskjellig klatring atferd når deres prosent klatring pass rate (HLR) ble sammenlignet med gjennomsnittlig klatring prosentverdi av alle testede linjer ved hjelp av enveis ANOVA (figur 1d). Påfølgende histologiske skjermen på 51 av linjene viser lavest klatring pass rate avslørte at 29 av disse linjene viste synlig utseende av hull i hjernen neuropil (alt fra mild til alvorlig) indikasjon på neurodegeneration20 ( Figur 2). Blant linjene som viser defekt klatring atferd og alvorlig neurodegeneration, velger vi å kartlegge mutasjon underliggende fenotype i linje 867 (0% HLR og P verdi = 1.36 e-14 basert på enveis ANOVA). Neurodegeneration fenotype i 867 fluer er resessivt fordi hjernen til heterozygot 867 fluer som har blitt outcrossed til en vill type stamme kan sammenlignes med disse kontrollene (figur 3a). Ved hjelp av histologi, meiotic kartlegging ligger mutasjonen i 31-51 cytologisk steder, mellom fenotypiske markører J (fastkjørte) og L (flik) på det andre Drosophila kromosom. Ved hjelp av klatring analysen, mangel kartlegging mellom cytologisk steder 31 og 51 med linjer fra Drosophila -mangel Kit for kromosom 2L (DK2L)16 kartlagt mutasjonen i en region som omfatter 118 gener (figur 3b; hvor 867/+ fungerer som kontroll for statistisk analyse). Undersøke hjernen fenotype av 867 mutanter krysset til flere mangel linjer (figur 3c) bekreftet at mutasjonen er inneholdt i en region av de Genova som inkluderer genet ungen. En fullstendig liste over alle ytterligere gener som finnes i disse slettinger kan bli funnet i flybase ved å klikke på linken knyttet til det slettede segmentet (f. eks for DF (2L) ED1272 det slettede segmentet er 37C5-38A2). Basert på tidligere observasjoner som unge mutanter har statist celler i hjernen21, en fenotype også observert i 867 mutanter, ble ungen valgt for DNA-sekvensering analyse. Sanger sekvensering av ungen genet inneholder ekson-regionen identifisert G/A nukleotid endring i posisjon 37 739 av genet (figur 4a), som fører til Glycine til Glutaminsyre syre (G/E) endring i posisjon 470 av ungen protein17 (Figur 4b). Rednings eksperimenter bekrefter at ungen spiller en nervecellene rolle, ettersom overuttrykte av det funksjonelle genet på 867-linjen undertrykker neurodegeneration fenotype (figur 5a). Videre fenotype i 867 mutanter forverres over tid, noe som tyder på at ungen spiller en alder-avhengige rolle i neuroprotection17 (figur 5B).
Figur 1 : Forward genetisk skjerm for å identifisere romanen nervecellene gener. (A) skjerm strategi. (B) klatring analysen testing apparater. (C) klatring analysen resultater for menn fra 235 homozygote ENU-mutagenized linjer. Sektordiagram representerer proporsjonene testet fly linjer som faller inn i 4 grupper av klatring pass priser: 0%, 1-20%, 21-50%, og 51-100%. (D) resultater fra 1 måte Anova statistisk analyse der mutant linjer ble sammenlignet med gjennomsnittlig klatring prosentverdi av alle testede linjer. Representert er tallet for to P verdi Kategorier: P < 0,05 (signifikant endring) og P > 0,05 (ikke signifikant endring).
Figur 2 : Sekundær histologi skjerm. H & E-beiset mid-hjerne seksjoner illustrerer, fra venstre til høyre, ingen neurodegeneration, milde neurodegeneration, og bekreftet neurodegeneration. Totalt 51 homozygote linjer ble testes av histologi etter identifisering av kandidater bruker klatring analysen. Pilene indikerer hullene i hjernen indikasjon på neurodegeneration. Regionen som er omgitt av de prikkede linjene, viser de alvorlige neurodegenration som er observert i linje 867.
Figur 3 : Identifisering av nervecellene genet ungen følgende mangel kartlegging ved hjelp av klatring analysen. (A) vist er representative bilder av H & E-beiset midten av hjernen deler av 18-20 dager gamle w1118 (kontroll), heterozygot 867 (867/+) og homozygote 867 mutant fluer. (B) mangelen linje DF (2L) ED1272 (BL_24116) ikke utfyller 867 mutant fenotype (svart histogram) basert på klatring analysen. Histologiske verifisering viser at DF (2L) ED1272 linjen ikke utfyller 867 neurodegeneration fenotype, mens DF (2L) ED1315 (BL_9269) gjør. Graf representerer gjennomsnittet og standardavviket på 5 klatre forsøk for hver linje. Stjernene angir betydningen basert på enveis ANOVA, der gjennomsnittlig klatre prosentverdi av hver linje ble sammenlignet med gjennomsnittlig klatre prosentverdi på linje 867/+ (grønt histogram). * P < 0,05, * * P < 0,01 og * * * P < 0,001. (C) skjematisk fremstilling av ytterligere mangel linjer som viser ikke-komplementering av 867 fenotype av histologi. Dette tallet har blitt modifisert fra Loewen et al.17; en artikkel publisert under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figur 4 : Punkt mutasjon i ungen Gene fører til en aminosyre endring i spiral-coil domene av ungen protein. (A) ungen gen modell og primere brukes til forsterkning og sekvensering av kodingen regionen. (B) DNA sekvensering av ungen geometriske navn identifiserer en nukleotid endring som fører til en aminosyre endring i spiral coil domenet til ungen protein. Dette tallet har blitt modifisert fra Loewen et al.17; en artikkel publisert under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figur 5 : Videre analyse av ungen mutanter bekrefter sin nervecellene rolle i Drosophila. (A) ved hjelp av gal-4 > UAS-systemet22 , neuroblast-spesifikke uttrykk for den funksjonelle ungen genet redder neurodegeneration fenotype i 867 mutanter. (B) alders avhengig neurodegeneration er observert i 867 mutanter bærer et reporter gen pcna-GFP. ungenCHS tilsvarer navnet på den unge allel i linje 867, som ble kalt ostehue (CHS). Vist er representative H & E-beiset mellomhjernen deler av yw (kontroll) og homozygote ungenCHS; pcna-GFP fluer i angitt aldre. Dette tallet har blitt modifisert fra Loewen et al.17; en artikkel publisert under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
| Stasjon | Tid | Temperatur | Vakuum/trykk | Løsning |
| 1 | INGEN FORSINKELSE-QUICK START | |||
| 2 | Av | Av | Av | |
| 3 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | 80% EtOH |
| 4 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | 95% EtOH |
| 5 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | 100% EtOH |
| 6 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | 100% EtOH |
| 7 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | 100% EtOH |
| 8 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | Xylenes |
| 9 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | Xylenes |
| 10 | : 15 | 37 ° c | PÅ/AV | Xylenes |
| 11 | : 30 | 58 ° c | PÅ/AV | Parafin |
| 12 | : 15 | 58 ° c | PÅ/AV | Parafin |
| 13 | Av | 58 ° c | Av | Parafin |
| 14 | : 15 | 58 ° c | PÅ/AV | Parafin |
Tabell 1: Anbefalte programinnstillinger for automatisert vevs prosessor. Trinnene i rekkefølgen som er oppført her, kan brukes med en automatisert vev prosessor for faste hoder.
| Reagens | Volum (μL) |
| 10x ExTaq buffer (mg2 + pluss) (20 mm) | 2,5 |
| Forover primer (10 μM) | 2,5 |
| Omvendt primer (10 μM) | 2,5 |
| 2,5 mM dNTPs | 2 |
| Mal DNA | 2 |
| TaKaRa ex-tq (5 U/μL) | 0,25 |
| Nuklease-fritt vann | 13,25 |
| Totalt volum | 25 |
Tabell 2: Reagenser som brukes til PCR-reaksjon. Reagenser og respektive volumer som brukes i PCR-reaksjonen for å forsterke den ungekodings regionen.
| Trinn | Temperatur | Tid |
| 35 sykluser | 95 ° c | 15 s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 72 ° c | 3 min 10 s | |
| Holde | 4 ° c | ∞ |
Tabell 3: Termiske sykkelforhold som brukes for PCR. Trinnene i rekkefølgen som er oppført her, kan brukes til å programmere en termisk cycler ved hjelp av reaksjonsblandingen som vises i tabell2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forward genetiske skjermer i Drosophila har vært en effektiv tilnærming for å identifisere gener involvert i ulike biologiske prosesser, inkludert alder-avhengige neuroprotection5,23,24, 25. ved hjelp av denne strategien, var vi lykkes i å identifisere ungen som en roman nervecellene genet17.
Et kritisk trinn i denne protokollen innebærer riktig orientering av hodene (som beskrevet i Seksjon 4.4.3.) for histologi analyse. I tillegg bør markører av linjen som brukes for meiotic kartlegging ikke forstyrre fenotype av den nye mutasjonen (i denne studien: neurodegeneration). Vi anbefaler en første test for å bekrefte at de valgte markører ikke forårsaker neurodegeneration av sine egne. For eksempel fastkjørte (J) årsaker vinge blemmer som kunne forstyrre klatring som tilfellet er for amyloid forløper PROTEIN (App)-overexpressing fluer som også har blemmer vinger26. Flik (L) fører til reduksjon i øyet størrelse; men vi observerer ikke sentrale hjernen degenerasjon og denne markøren kan brukes til å kartlegge sentrale hjernen neurodegeneration. PIN og Sternoplural (SP) er også hensiktsmessig å bruke, som hjernen av fluer bærer disse markørene er sammenlignbare med hjerner av vill type kontroller.
En ulempe ved den videre genetiske metodikken i fluer er hvor lang tid som kreves for å smale områder av DNA til genet av interesse3,5. Bruk av forbedrede kartlegging strategier27 sammen med tilgjengeligheten av neste generasjons sekvensering teknologier 28 bør tillate enda enklere identifisering av mutasjoner forbundet med fenotyper av interesse. Forward genetiske skjermer kan være arbeidskrevende. For eksempel, histologi bekreftelse, som analyser direkte for neurodegeneration i hjernen, krever alene en betydelig mengde tid. Imidlertid vil denne tilnærmingen være mye vanskeligere og dyrere å utføre i pattedyr modeller, ikke nødvendigvis tillater omfattende genetiske studier. Kjemiske mutagenese skjermer er fordelaktig fordi identifisering av punkt mutasjoner kan gi viktig informasjon om funksjonen av berørte gener ' produkter. Identifisering av et punkt mutasjon forårsaker en aminosyre endring i et bevart domene av ungen protein (figur 4b) illustrerer viktigheten av den spiral-coil domene av denne trim-NHL protein i neuroprotection18. Den klatring analysen, som måler Locomotor atferd, er absolutt en fordel ved å tillate rask testing av et stort antall fluer for defekter i mobilitet, også ofte sett i menneskelig neurodegeneration25. Denne analysen kan også utføres i en annen skjerminnstilling som for eksempel Genova-Wide in vivo RNA interferens (RNAi)-skjerm som kan brukes til å identifisere nervecellene gener. Selv om vi redusert avstanden mellom bunnen av testkammeret og bestått linje fra 8 cm10 til 5 cm for å sette en strengere bestått rate i dagens studie, lav klatring priser ikke speilet neurodegeneration for stort antall linjer. Neurodegeneration kan bli tydelig etter utbruddet av atferds feil, noe som betyr at fluer må være eldre lenger før vakuoler vises. En annen mulighet er at Locomotor defekter vi observerer i visse linjer er ikke på grunn av defekt nevrologisk funksjon, men heller til muskelsvakhet eller mer generell uskikkethet av fluene. I tillegg er det mulig at vi mangler potensielle kandidater, der klatring defekter ikke manifestere seg i yngre alder (for eksempel 10 dager gamle), men heller bli fremtredende senere i livet. Dette screening strategien kan sikkert brukes til å identifisere alder-avhengige gener, og dermed eliminere gener forbundet med potensielle defekter av Neural utvikling. Protokollen som presenteres her kan justeres avhengig av ønsket sannsynlighet for at kandidat linjer skal inneholde det muterte genet som er involvert i neuroprotection. Senke bestått rate terskelen direkte er en annen måte å oppnå samme resultat. Disse kandidatene vil teoretisk sett vise større neurodegeneration, noe som kan spare tid og ressurser under bekreftelse og kartlegging.
Generelt beskriver protokollen en grei måte å skjermen for neurodegeneration og senere identifisere nervecellene gen kandidater. Denne genetiske tilnærmingen er ikke begrenset til atferd og histologiske analyser beskrevet her, og kan også brukes til skjermen for andre fenotyper som temperaturfølsomme (TS) lammelse, egglegging eller fruktbarhet fenotyper, bare for å sitere noen. For eksempel er Drosophila TS-paralytisk mutanter kjent for å være beriket for neurodegeneration29 og kan representere en ekstra kilde for identifisering av nervecellene gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er spesielt takknemlige for Dr. Barry Ganetzky, i Who ' s Lab den genetiske skjermen ble utført, slik at identifisering og karakterisering av ungen som en nervecellene genet. Vi takker Dr. Steven Robinow for vennlig å gi samlingen av ENU-mutagenized fluer brukes i den genetiske skjermen presentert i denne artikkelen. Vi takker medlemmene av Ganetzky Lab, DRS. Grace Boekhoff-Falk og David Wassarman for nyttige diskusjoner gjennom hele prosjektets varighet, Ling Ling Ho og Bob Kreber for teknisk assistanse, Dr. Aki Ikeda for bruk av hans mikrotomen anlegget på University of Wisconsin og Dr. Kim Lackey og den optiske analyse Facility ved University of Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al.
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).
