Summary
El análisis de la hemolinfa de garrapata representa una importante fuente de información sobre cómo algunos patógenos causan enfermedades y cómo las garrapatas responden inmunológicamente a esta infección. El presente estudio demuestra cómo inocular propágulos fúngicos y recolectar hemolinfa de las hembras engorgadas de rhipicephalus microplus .
Abstract
Las garrapatas son ectoparásitos hematóviles obligados y rhipicephalus microplus tiene una gran importancia en la medicina veterinaria porque causa anemia, pérdida de peso, depreciación del cuero de los animales y también puede actuar como un vector de varios patógenos. Debido a los costos exorbitantes para controlar estos parásitos, daños al medio ambiente causados por el uso inadecuado de acaricidas químicos, y el aumento de la resistencia contra los parasiticidas tradicionales, control alternativo de las garrapatas, mediante el uso de hongos entomopatógenos, por ejemplo, se ha considerado un enfoque interesante. Sin embargo, pocos estudios han demostrado cómo el sistema inmunológico de la garrapata actúa para luchar contra estos entomopatógenos. Por lo tanto, este protocolo demuestra dos métodos utilizados para la inoculación de entomopatógenos en hembras engorgadas y dos técnicas utilizadas para la recolección de hemológeno y la cosecha de hemocitos. La inoculación de patógenos en la inserción de la pierna en el cuerpo de la hembra de la garrapata permite la evaluación de los parámetros biológicos de las hembras a diferencia de la inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum, que con frecuencia daña el órgano de Genéu. La colección de hemolinfa dorsal produjo una recuperación de mayor volumen que la recogida a través de las piernas. Algunas limitaciones de la recolección y procesamiento de hemolinfa de garrapata incluyen i) altas tasas de alteración de los hemocitos, II) contaminación de la hemolafila con alteraciones en el intestino medio, y III) baja recuperación del volumen de hemolh. Cuando la hemolinfa se recoge a través del corte de la pierna, la hemoléh tarda en acumularse en la abertura de la pierna, favoreciendo el proceso de coagulación. Además, se obtienen menos hemocitos en la colección a través de la pierna en comparación con la colección dorsal, a pesar de que el primer método se considera más fácil de realizar. La comprensión de la respuesta inmune en las garrapatas mediadas por agentes entomopatógenos ayuda a revelar su patogénesis y desarrollar nuevos objetivos para el control de la garrapata. Los procesos de inoculación aquí descritos requieren muy bajos recursos tecnológicos y se pueden utilizar no sólo para exponer las garrapatas a microorganismos patógenos. Del mismo modo, la colección de la hemolafila de garrapata puede representar el primer paso para muchos estudios fisiológicos.
Introduction
La garrapata del ganado, rhipicephalus microplus, es un ectoparásito hematófago con un enorme impacto negativo en el ganado en las zonas tropicales. Esta garrapata es el vector de agentes patógenos como Babesia bovis, Babesia bigemina, y ANAPLASMA MARGINALE que, combinados con el daño de hemofeeding directo, pueden reducir la producción de leche y carne, causar anemia y finalmente la muerte. Las pérdidas causadas por este ectoparásito se calcularon en 3,24 mil millones dólares anualmente en Brasil1. Se exigen métodos sostenibles y el uso de agentes entomopatógenos se considera una alternativa prometedora para reducir el uso de acaricidas químicos2,3,4.
Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium spp., son enemigos naturales de los artrópodos, incluidas las garrapatas, y algunos aislados pueden utilizarse como biocontroladores. Estos patógenos infectan activamente al huésped a través de la cutícula y colonizan su cuerpo2,5,6. A medida que la infección se desarrolla, las respuestas celulares y humorales son mediadas por el sistema inmunológico de la garrapata. El análisis de la garrapata hemolinfa se divulga como una herramienta útil para evaluar las respuestas inmunitarias después del reto con patógenos7,8.
La respuesta inmunitaria de los artrópodos se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral consiste en procesos de hemaglutinación y producción de proteínas/péptidos antimicrobianos, mientras que la respuesta inmunitaria celular se realiza a través de los hemocitos. Estas células están presentes en la hemolinfa de todos los artrópodos y se reportan para desarrollar un papel expresivo en los estudios que implican la respuesta inmune innata9, ya que está directamente relacionado con los procesos de phagocitosis y encapsulación. En consecuencia, los estudios sobre los hemocitos pueden ayudar a investigar la vía de la muerte y comprender procesos como la autofagia, la apoptosis y la necrosis. En algunos invertebrados como bivalvos, la colección de los hemocitos se enfrenta a limitaciones como la alteración celular, el volumen bajo de hemolécula obtenida y la baja concentración de células recuperadas10. Con mucha frecuencia, dependiendo de la metodología aplicada, se obtiene una concentración reducida de células, afectando directamente a la cuantificación y análisis de las células.
El número de hemocitos circulantes en la hemolafila es variable entre los diferentes artrópodos y puede cambiar en la misma especie debido a diferentes etapas fisiológicas como el sexo, la edad, y la etapa de desarrollo del artrópodo11. Los hemocitos también se pueden encontrar adherida a algunos órganos y se liberan en la circulación justo después del proceso de infección11. Sin embargo, la mayoría de los estudios informaron utilizar insectos, mientras que las garrapatas siguen siendo menos exploradas con respecto a su fisiología y patología. A pesar de la inoculación de patógenos y la recolección de hemolinfa en garrapatas son técnicas menos utilizadas, el establecimiento de métodos estándar ayuda al desarrollo de estudios más precisos.
El objetivo del presente estudio fue comparar los métodos más utilizados para la recolección de hemolinfa y la inoculación de patógenos en garrapatas R. microplus , evaluando la eficacia de la adquisición de hemolágenos y la concentración de hemocitos.
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Protocol
Las garrapatas utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de una colonia artificial, mantenida en la Universidad Federal rural de Río de Janeiro, que los métodos han sido aprobados por el Comité de ética para el uso de animales vertebrados (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Marque las hembras engorgadas
- Después de la recolección de garrapatas, lavar las hembras engorgadas con agua del grifo y sumergir en 0,5% (v/v) solución de hipoclorito sódico durante 3 min en un recipiente de vaso de vidrio 500 mL, para la higiene de cutícula (figura 1), luego secar todas las hembras usando toallas de papel estériles (figura 2).
- Divida las hembras en grupos ponderados homogéneos (con 20 hembras cada uno): un grupo sin tratamiento, un grupo de control inoculado con 5 μL de 0,1% de solución acuosa de monooleato de polioxietileno sorbitán (v/v), y un grupo infectado inoculado con 5 μL a 1,0 x 10 7 blastosporos ml-1.
Nota: solo se utilizaron garrapatas no tratadas para la concentración de volumen y hemocitos. Se realizaron tres réplicas de cada grupo.
2. la inoculación de patógenos entre el Scutum Logistic y el capitulum
Nota: en el presente estudio se utilizaron como ejemplo suspensiones fúngicas entomopatógenas.
- Suspender las blastosporas fúngicas en 1 mL de una solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v) y ajustarse a una concentración final de 1,0 x 107 Blastosporos ml-1. Añadir una alícuota de 5 μL de la suspensión de Metarhizium blastosporos (figura 3) a la superficie de una película plástica de parafina.
Nota: la suspensión de Metarhizium blastosporos se ajustó utilizando la cámara de Neubauer. Para acelerar el proceso de inoculación, se pueden añadir múltiples burbujas a la superficie de película de parafina plástica, cada burbuja correspondiente a 5 μL. - Utilice una jeringa de insulina ultra fina de 1 mL y una aguja de 0,3 mm para tirar de la suspensión e inocularla en la garrapata. Recuerde sacar todo el aire de la jeringa antes de usarlo.
- Inocular 5 μL de suspensión fúngica en la garrapata hembra entre el Scutum Logistic y el capitulum. Inocular a las hembras del grupo de control con 5 μL de solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v) sin hongos.
Nota: un pequeño volumen de hemolinfa puede estar presente en el agujero después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no vacunar el aire.
3. inoculación de hongos entomopatógenos entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata
- Inocular las hembras con suspensión fúngica (5 μL a 1,0 x 107 blastosporos ml-1) entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra, utilizando una jeringa de insulina ultra fina de 1 ml acoplada a una aguja de 0,3 mm. Vacunar a las hembras del grupo de control con 5 μL de solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v).
Nota: cuando se realiza la inoculación de Metarhizium blastosporos entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, puede presentarse un pequeño volumen de hemolinfa en el Tigh después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no vacunar el aire.
4. colección de hemolinfa dorsal
- Utilice la parte de goma de un conjunto de infusión alada, un tubo capilar de 0,3 mm y una punta filtrada para realizar la colección de hemolingh.
- Interrumpir la cutícula dorsal femenina con una aguja de 0,3 mm.
- Después de la interrupción, aplique una presión suave en la parte anterior del cuerpo de la garrapata. Observe un líquido casi transparente tirando del sitio de interrupción. Recoja la hemolinfa chupando el líquido a través de la punta del filtro acoplado a la parte de goma de un conjunto de infusión alada, y un tubo capilar de 0,3 mm.
Nota: no presione el cuerpo de la garrapata difícilmente durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el intestino medio y contaminar la hemolymph. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el fluido sin contaminar.
5. colección hemolymph de la pata de la garrapata
- Inmovilizar la garrapata, cortar un trozo de una pata delantera con un par de tijeras.
Nota: una o más patas se pueden cortar, así como, la misma pierna se puede cortar más de una vez. - Aplique una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observar una burbuja líquida transparente que aparece en el sitio de corte y recogerla con el tubo capilar, como se describe en el paso 4,3.
Nota: no presione el cuerpo de la garrapata difícilmente durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el intestino medio y contaminar la hemolymph. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el fluido sin contaminar.
6. procesamiento de hemolymph
- Tras la recolección de hemolinfa, deposite en microtubos de 1,5 ml previamente rellenos con 30 μl de Cóctel proteasa y 82 μl de tampón salino. Mantenga los microtubos en hielo a lo largo de la colección de hemolinfa.
- Centrifugadora de muestras (500 x g durante 3 min a 4 ° c). Se formará un pellet blando de hemocitos después de la centrifugación de hemolafila.
Nota: para la cuantificación de la hemolésica, cuantificar el volumen hemolúh obtenido contando el volumen total dentro del microtubo y descontando el volumen de Cóctel de proteasa y tampón salino. - Retire con cuidado el sobrenadante (hemolymph libre de células). Resuspende suavemente las células en, por ejemplo, la cultura L-15 de Leibovitz ajustada a pH 7,0-7.2. Cuantificar los hemocitos colocando 10 μL de hemocitos resuspendido en una cámara Neubauer.
7. preparación de la diapositiva de muestreo de hemocitos
- Corta la pata delantera de la garrapata con un par de tijeras.
- Aplique una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observe una burbuja líquida transparente que aparece en el sitio de corte.
- Aplicar las gotas de hemolinfa directamente en las diapositivas de microscopio limpias, después de eso, utilizar métodos apropiados para manchar las células.
- Para manchar los hemocitos con Giemsa, secar al aire la hemolésica en la corredera durante 30 min, fijarla a temperatura ambiente con metanol durante 3 min, y mancha en la solución de Giemsa (relación 1:9 de la solución tampón de Sorensen, pH 7,2) durante 30 min a temperatura ambiente. Lave las diapositivas con agua corriente para eliminar el exceso de tinte, secar al aire la diapositiva y evaluar las células a 400x en un microscopio óptico.
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Representative Results
En este artículo se aborda la inoculación y los métodos de recolección de hemolinfa aplicados a las garrapatas. Después de la inoculación entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un poco de líquido (hemolymph) puede ser secretada durante el proceso; sin embargo, es importante notar que cuando la inoculación está terminada, no hay líquido o tejidos presentes en la punta de la aguja o en el sitio de inoculación, asegurando que la suspensión fúngica fue completamente inoculada. Cuando el proceso de inoculación se realizó correctamente, la inserción de la aguja no causó la muerte de las hembras de garrapatas. Por otro lado, las garrapatas murieron aproximadamente 48 h después de la inoculación del hongo entomopatógeno. La inoculación entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata puede dañar los órganos internos de la garrapata como el intestino medio y los túbulos Malpighian, mientras que el daño al órgano de gene puede ocurrir durante la inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum.
Cuando el intestino medio de la garrapata es interrumpido por la aguja durante la colección de hemolinfa dorsal, el fluido obtenido es de color rojo, no incoloro. Esto indica una colección de hemolinfa incorrecta. En estos casos, la hemolinfa se desechará ya que está contaminada con contenido intestinal.
La colección hemolinfa correcta es crucial para llevar a cabo adecuadamente los experimentos y obtener resultados fiables. Cuando se recogió hemolinfa de las patas de la garrapata cortada (n = 20 garrapatas con un peso homogéneo), el volumen obtenido fue inferior a la hemolafila total obtenida de la colección dorsal (n = 20 garrapatas de peso homogéneo) (figura 4). Se sugiere que, debido al bajo volumen de cada gota que saca de la pata cortada, la coagulación de la hemolúh puede estar presente con frecuencia durante este proceso de recolección de hemolinfa. Esto puede interferir negativamente en la adquisición y clasificación de los hemocitos (figura 5 y figura 6). A pesar del mayor volumen de logro de la hemolymph, la colección dorsal se considera más difícil de realizar.
Figura 1 : Garrapatas ' higienización de cutícula. Las hembras de rhipicephalus microplus se lavaron con agua del grifo y se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (v/v) durante 3 min en un recipiente de vaso de vidrio de 500 ml. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ticks ' secado de cutícula. Las hembras de Rizpicephalus microplus se secaron con toallas de papel estériles. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Metarhizium blastosporas. Propaluges fúngicos utilizados en la inoculación de garrapatas. Barra de escala = 50 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Gráfico representativo que demuestra el volumen de hemolúh obtenido con cada método colectón. Rhipicephalus microplus hemolinfa volumen obtenido después de la colección dorsal o de la pierna. Para cada método se utilizaron un grupo de 20 garrapatas con pesaje homogéneo. Estas garrapatas no fueron inoculadas previamente. Los valores medio ± desviación estándar seguida para la misma letra no difieren estadísticamente después de la prueba de análisis de varianza (ANOVA) (P ≥ 0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Concentración de hemocitos obtenida con cada método de recolección de hemolinfa. Concentración de hemocitos de rhipicephalus microplus obtenida después de la resuspensión en el medio de cultivo L-15 de Leibovitz después de la recolección dorsal o de la pierna. Los valores medio ± desviación estándar seguida para la misma letra no difieren estadísticamente después de la prueba de Kruskal-Wallis (P ≥ 0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Los hemocitos encontrados en Rhipicephalus microplus mancha hemolinfa. Los hemocitos R. microplus fueron manchados por Giemsa. Las flechas negras indican las diferentes células en la hemolymph de la garrapata. Barra de escala = 100 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La inoculación de patógenos es útil cuando el estudio tiene como objetivo investigar la acción in vivo de microorganismos en modelos de artrópodos experimentales porque asegura que el patógeno está dentro del huésped. La técnica también se puede aplicar para inocular moléculas como la interferencia de ARN (ARNi). La inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum se considera más fácil de llevar a cabo, pero con frecuencia daña el órgano de Genée deteriorar la viabilidad de los óvulos12,13. El órgano de genéin está anatómicamente localizado cerca de la parte anterior del capitum, y es un órgano importante para la oviposición14de la garrapata. En consecuencia, la inoculación entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra es más apropiada si el estudio requiere la observación de los parámetros biológicos de las hembras ya que el órgano de Genéno se lesiona. A pesar del método de inoculación entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la garrapata se considera más difícil y fácilmente dañar o exponer los órganos internos de la garrapata, como el intestino medio y los túbulos Malpighian, cuando se realiza bien, no va a interrumpir estos órganos.
El análisis de hemolymph es esencial para entender el sistema inmunológico del artrópodo, así como para entender la patogénesis15,16. En consecuencia, el tick hemolinfa se puede utilizar para revelar la fisiología de la garrapata, asegurar la infectividad de garrapatas, entender las interacciones entre garrapatas y patógenos, y las respuestas inmunes celulares y humorales9,17,18.
La colección hemolinfa tick a través del corte de la pierna se reporta en varios estudios19,20,21. A pesar de que este método es simple, con no o muy baja contaminación hemolémática, se considera contraproducente para los estudios que requieren altas concentraciones de hemocitos o grandes volúmenes de hemolinfa. Por otro lado, la correcta ejecución de la colección de hemolingh a través de la región dorsal de hembras engorgadas no es fácil de lograr ya que el intestino ocupa casi todo el cuerpo de la garrapata y la ruptura con la aguja causa la contaminación por hemolingh. La contaminación debida a la alteración intestinal también se puede observar cuando la garrapata está infectada naturalmente con altas cargas de hemoparásitos (a saber, Babesia spp.), o en los pasos finales del proceso de muerte causados por entomopatógenos8. En estos casos, la hemolinfa se descartará, ya que los hemocitos y los análisis de plasma pueden verse afectados.
La velocidad de centrifugación de las muestras de hemolégica para la recolección de hemocitos también es importante y influye directamente en la concentración de los hemocitos, ya que las altas velocidades de campo centrífugo relativo (RCF) contribuyen a: i) Pellet difícil de resuspend, II) células disrupción, y III) la Desgranulación de los hemocitos. El pellet de células ideal es un pellet blando fácil de resuspend. Por este motivo, se utilizó la centrifugación a 500 x g durante tres minutos a 4 ° c8 . En el presente estudio, los hemocitos se resuspendieron en un medio de cultivo y no en solución salina amortiguada por fosfato (PBS) porque el medio de cultivo favorece una mejor viabilidad celular.
Los métodos presentados aquí pueden enfrentar limitaciones cuando se aplican a las etapas inmaduras (larva y Ninfa) de las garrapatas o adultos no alimentados. El método de inoculación, por ejemplo, sólo se aplica para las hembras adultas engorgadas porque el tamaño de la aguja dañará las etapas inmaduras y posiblemente las garrapatas adultas sin alimentar. Para inocular estas etapas, se utilizará un microinyector. Del mismo modo, la recolección de hemolinfa a través de la región dorsal es más eficaz cuando se aplica a las garrapatas enginadas, mientras que la colección de hemolinfa cortando las piernas se puede utilizar en estudios con garrapatas adultas no alimentados o etapas inmaduras. A pesar de esto, nuestro objetivo aquí era mostrar métodos que requieren recursos tecnológicos muy bajos. Además, la técnica de centrifugación debe realizarse a baja fuerza de centrifugación porque la fuerza alta o el tiempo de centrifugado prolongado pueden dañar las células.
Los métodos divulgados aquí pueden ser utilizados como pautas para estudios que involucran la inoculación de entomopatógenos en garrapatas y la recolección de hemolymph/hemocitos. Las técnicas presentadas aquí requieren recursos tecnológicos muy bajos y son pasos clásicos para estudios sobre fisiología de garrapatas, patología y respuesta inmunitaria de garrapatas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado en parte por el Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior (CAPES) de Brasil, código de finanzas 001. La CAPES proporcionó una beca de doctorado para A.F. Marciano. Agradecemos al Consejo Nacional de desarrollo científico y tecnológico (CNPq) de Brasil por proporcionar una beca de doctorado para J. Fiorotti. Esta investigación también fue apoyada por becas de la Fundación Carlos Chagas Filho para la investigación del estado de Río de Janeiro (FAPERJ) y CNPq. V.R.E.P. Bittencourt es un investigador CNPq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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