Summary
यह प्रोटोकॉल माउस नेत्र सतह कोशिकाओं से लाइव प्राथमिक संस्कृतियों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), लाइव कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं का एक साथ पता लगाने को दर्शाता है। 2',7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसेसेटेट, प्रोपिडियम आयोडाइड और होचस्ट धुंधला का उपयोग क्रमशः आरओएस, मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं का आकलन करने के लिए किया जाता है, जिसके बाद इमेजिंग और विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
नेत्र सतह विभिन्न पर्यावरणीय कारकों के कारण नियमित रूप से पहनने और आंसू के अधीन है। यूवी-सी विकिरण के संपर्क में एक व्यावसायिक स्वास्थ्य खतरा बनता है। यहां, हम माउस नेत्र सतह से यूवी-सी विकिरण के लिए प्राथमिक स्टेम कोशिकाओं के जोखिम को प्रदर्शित करते हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) गठन ऑक्सीडेटिव तनाव/क्षति की सीमा का readout है । एक प्रयोगात्मक इन विट्रो सेटिंग में, ऑक्सीडेटिव तनाव के कारण उत्पन्न मृत कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करना भी आवश्यक है। इस लेख में, हम यूवी-सी के 2',7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसेसेटेट (डीसीएफडीए) को प्रदर्शित करेंगे माउस प्राथमिक नेत्र सतह स्टेम सेल और डीसीएफडीए धुंधला की फ्लोरोसेंट छवियों के आधार पर उनकी मात्रा। DCFDA धुंधला सीधे ROS पीढ़ी से मेल खाती है । हम क्रमशः प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) और होचस्ट 3332 और डीसीएफडीए (आरओएस पॉजिटिव) और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत के साथ एक साथ धुंधला करके मृत और जीवित कोशिकाओं की मात्रा का भी प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
नेत्र सतह (ओएस) मुख्य रूप से कॉर्निया, लैचरीमल ग्रंथि, मेइबोमियन ग्रंथि, कंजक्टिवा, आंखों के ढक्कन मार्जिन और इनरवेशन का हिस्सा है कि1संकेतों को पार करने के बाहरी परत और ग्रंथि एपिथेलिया से बना एक कार्यात्मक इकाई है । पारदर्शी गुंबद के आकार की कॉर्नियल परत रेटिना पर प्रकाश केंद्रित करती है। यह अवास्कुलर ऊतक सेलुलर घटकों जैसे एपिथेलियल कोशिकाओं, केराटोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं और कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लिकन2जैसे एककोशिकुलर घटकों से बना है। क्षेत्र आंसू से सूखा है जो अधिकांश पोषक तत्वों की आपूर्ति भी करता है। ओएस की शारीरिक स्थिति इसे बाहरी वातावरण के साथ सीधे संपर्क में होने के लिए मजबूर करती है, अक्सर इसे उज्ज्वल प्रकाश, रोगाणुओं, धूल कणों और रसायनों जैसे विभिन्न कठोर घटकों से उजागर करती है। यह कारक ओएस को शारीरिक चोटों के लिए संवेदनशील बनाता है और इसे विभिन्न बीमारियों का खतरा बनाता है।
ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और एंडोजेनस एंटीऑक्सीडेंट सुरक्षा तंत्र3के उत्पादन के बीच असंतुलन के कारण होता है। आरओएस को प्रतिक्रियाशील अणुओं और मुक्त कणों में वर्गीकृत किया जाता है, जिनमें से दोनों माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन4के माध्यम से आणविक ऑक्सीजन (ओ2)से प्राप्त होते हैं। पूर्व समूह हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2),सिंगल्ट ऑक्सीजन(1O2)जैसी गैर-कट्टरपंथी प्रजातियों से बना है और बाद में सुपरऑक्साइड anions (O2-),और हाइड्रोक्साइल रेडिकल्स(•ओह), अन्य लोगों के बीच जैसी प्रजातियां शामिल हैं। ये अणु सामान्य सेलुलर प्रक्रियाओं के उप-उत्पाद हैं और उनकी भूमिकाओं को सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन, जीन अभिव्यक्ति और मेजबान रक्षा5जैसे महत्वपूर्ण शारीरिक कार्यों में फंसाया गया है। आरओएस का एक बढ़ाया उत्पादन रोगजनक आक्रमण, विद्वेष, और अल्ट्रा वायलेट (यूवी) विकिरण4के संपर्क जैसे कारकों के जवाब में उत्पन्न होने के लिए जाना जाता है। आरओएस के इस अतिउत्पादन के परिणामस्वरूप ऑक्सीडेटिव तनाव होता है जो न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और लिपिड6जैसे अणुओं को नुकसान पहुंचाता है।
प्राकृतिक सूरज की रोशनी, यूवी विकिरण का सबसे प्रमुख स्रोत, यूवी-ए (400-320 एनएम), यूवी-बी (320-290 एनएम), और यूवी-सी (290-200 एनएम)7से बना है। तरंगदैर्ध्य और स्पेक्ट्रल ऊर्जा के बीच एक व्युत्क्रम संबंध की सूचना दी गई है । यद्यपि प्राकृतिक यूवी-सी विकिरण वायुमंडल द्वारा अवशोषित होते हैं, लेकिन कृत्रिम स्रोत जैसे पारा लैंप और वेल्डिंग उपकरण उत्सर्जित होते हैं और इसलिए, एक व्यावसायिक खतरा बनता है। आंखों के संपर्क में आने के लक्षणों में फोटोकेराटाइटिस और फोटोकेराटोकॉन्जुक्टिवाइटिस8शामिल हैं । आरओसी का उत्पादन यूवी प्रेरित सेलुलर क्षतिकोदण्ड देने के प्रमुख तंत्रों में से एक है । वर्तमान अध्ययन में, हम यूवी-सी के संपर्क में आने वाले माउस प्राथमिक नेत्र सतह कोशिकाओं/स्टेम कोशिकाओं में 2',7'-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफडीए) धुंधला विधि का उपयोग करके आरओ का पता लगाने का प्रदर्शन करते हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हरी फ्लोरेसेंस पर कब्जा कर लिया गया था। कोशिकाओं को क्रमशः जीवित और मृत कोशिकाओं को दाग देने के लिए दो रंगों, Hoechst ३३३४२ और लाल प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ जवाबी दाग थे ।
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Protocol
यह प्रयोग स्विस एल्बिनो माउस आई से प्राप्त प्राथमिक नेत्र कोशिकाओं/स्टेम कोशिकाओं पर किया गया था । इस प्रयोग के लिए आंखों की कटाई के लिए जानवरों के उपयोग को संस्थागत पशु नैतिक समिति, Yenepoya (विश्वविद्यालय होने के लिए डीम्ड) (IEAC अनुमोदन संख्या, 6a/19.10.2016) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. अभिकर्मकों की तैयारी
नोट: माउस नेत्र सतह से प्राथमिक कोशिकाओं/स्टेम कोशिकाओं का व्युत्पन्न इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है । इसलिए, हम यूवी-सी एक्सपोजर खुराक, आरओएस, लाइव और मृत कोशिकाओं और उनके परिमाणीकरण का आकलन करने के लिए पुनः एजेंट तैयारी प्रदर्शित करते हैं। कृपया अभिकर्मकों की संबंधित मात्रा के लिए तालिका 1 का उल्लेख करें (अंतिम धुंधला समाधान प्राप्त करने के लिए जोड़े जाने वाले 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, डीसीएफडीए, होचस्ट और प्रोपिडियम आयोडाइड स्टॉक समाधान)।
- डीएमएसओ के 5.13 मिलीग्राम में 25 मिलीग्राम डीसीएफडीए पाउडर को भंग कर 10 एमएम डीसीएफडीए का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। अलीकोट 250 माइक्रोन प्रत्येक में एंबर रंग 1.5 mL ट्यूब और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
- 25 मिलीग्राम शीशी की पूरी सामग्री को डिओनाइज्ड पानी में घोलकर 10 मिलीग्राम/एमएल (16.23 एमएम सॉल्यूशन) होचस्ट 33342 का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। एम्बर रंगीन माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में 100 माइक्रोन का एलिकोश बनाएं और 6 महीने तक 2-6 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- डिओनाइज्ड पानी में 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें, एम्बर कलर की 1.5 एमएल ट्यूब्स में 1 एमएल प्रत्येक को एलिकोट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
2. सेल चढ़ाना और यूवी-सी विकिरण उपचार
- चढ़ाना से पहले, हमारी प्रयोगशाला में अलग माउस प्राथमिक नेत्र सतह कोशिकाओं को अलग कर ते हैं (अप्रकाशित परिणाम; ऐसी कोशिकाएं कॉर्नियल एपिथेलियल, स्ट्रोमल कोशिकाओं और केराटोसाइट्स) का एक मिश्रण हैं, जो एक सौम्य कोशिका विच्छेदन एजेंट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करते हैं।
- प्लेट 0.2 x 106 माउस प्राथमिक नेत्र सतह कोशिकाओं में 35 मिमी 0.2% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित सेल संस्कृति व्यंजन पूर्ण मीडिया के 2.5 mL में। एक 5% सीओ2 और आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
नोट: माउस नेत्र सतह से प्राथमिक कोशिकाओं को संबनाने के लिए पूर्ण मीडिया में डीएमईएम उच्च ग्लूकोज शामिल है जिसमें 20% एफबीएस, 1% पेन-स्ट्रेप, 1% ग्लूटामैक्स, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 1% सोडियम पायरुवेट, और 0.1%-मर्काप्टोथेनॉल शामिल हैं। - यूवी-सी की विभिन्न खुराकों के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से पहले, मीडिया की अधिकतम मात्रा को त्यागें और केवल मीडिया की एक पतली परत (~ 500 माइक्रोन) को कोशिकाओं के संपर्क में रहने की अनुमति दें, बस उन्हें कवर करने के लिए पर्याप्त है।
- व्यंजन ले लो, यूवी-सी स्रोत के लिए एक समय में एक/कक्ष (एक संकरण ओवन के निचले चैंबर/ सामग्री की तालिका)। डिश को चैंबर में रखें और डिश के ढक्कन को हटा दें। डिश की खुली ढक्कन की स्थिति यह सुनिश्चित करती है कि कोशिकाओं को यूवी-सी एक्सपोजर के दौरान अधिकतम यूवी-सी खुराक प्राप्त होती है।
- यूवी-सी के विभिन्न ग्रेड/डोज के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करें: 1 J/m2,100J/m2,१,००० J/m2 और १०,००० J/m2।
- यूवी-सी एक्सपोजर के बाद, प्रत्येक व्यंजन के ढक्कन को तुरंत बदलें और उन्हें यूवी-सी स्रोत कक्ष से हटा दें।
- लैमिनार एयर फ्लो हुड के लिए प्रत्येक व्यंजन लाएं और ताजा पूर्ण मीडिया के 2 mL के साथ प्रत्येक व्यंजन को ऊपर करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में 3 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। यूवी-सी एक्सपोजर के बाद तीन घंटे के ऊष्मायन शुरुआती प्रभावों की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए इष्टतम है।
3. लाइव सेल धुंधला मीडिया की तैयारी
- यूवी-सी एक्सपोजर के बाद 3 एच सेल इनक्यूबेशन पोस्ट के पिछले 15 मिन के दौरान धुंधला मीडिया ताजा तैयार करें।
- धुंधला मीडिया के पूर्व गर्म 10 mL जिसमें 10% एफबीएस-डीएमईएम 1% पेन-स्ट्रेप से 37 डिग्री सेल्सियस तक पूरक है।
- 10 एमएम डीसीएफडीए के 5 माइक्रोन जोड़ें; 10 मिलीग्राम/एमएल होचस्ट सॉल्यूशन का 5 माइक्रोन और 1 एमजी/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड का २०० माइक्रोन । डीसीएफडीए, Hoechst और PI की अंतिम सांद्रता क्रमशः 5 μM, 5 μg/mL और 20 μg/mL, धुंधला मीडिया के 10 mL में हैं ।
4. यूवी-सी उजागर माउस प्राथमिक नेत्र कोशिकाओं के DCFDA धुंधला
- यूवी-सी के ऊष्मायन के 3 घंटे के बाद विभिन्न खुराकों पर माउस प्राथमिक नेत्र कोशिकाओं को उजागर किया, 35 मिमी व्यंजनों से मीडिया को एस्पिरेट करें।
- पक्षों से धीरे से व्यंजन ों में से प्रत्येक के लिए हौसले से तैयार DCFDA धुंधला मीडिया के 2 mL के साथ भरपाई ।
- लाइव सेल धुंधला करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में अंधेरे में 15 मिन के लिए धुंधला मीडिया के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
5. DCFDA (ROS), Hoechst और PI दाग कोशिकाओं को देखने
- ऊष्मायन के पूरा होने के बाद धुंधला मीडिया को त्याग दें।
- कोशिकाओं में ताजा पूर्ण मीडिया जोड़ें और एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप/सेल इमेजर(सामग्री की तालिका)के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें । वांछित क्षेत्रों की तस्वीर: उज्ज्वल क्षेत्र, नीले फ्लोरेसेंस, लाल फ्लोरेसेंस, हरी फ्लोरेसेंस।
नोट: नीले फ्लोरोसेंटी दाग कोशिकाओं नाभिक हैं, हरी फ्लोरेसेंसोस ओएस पैदा करने वाली कोशिकाओं के लिए है और लाल फ्लोरेसेंस पीआई सकारात्मक मृत कोशिकाओं को इंगित करता है।
6. इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके दाग कोशिकाओं (Hoechst-ब्लू, पीआई-डेड और ग्रीन-रोस) का परिमाणीकरण
- उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप/सेल इमेजर के तहत कैप्चर की गई छवियों को क्वांटिफिकेशन के लिए इमेजजे को निर्यात करें ।
- प्रत्येक चैनल (यानी, नीले (नाभिक/Hoechst), हरे (ROS), लाल (मृत/PI पॉजिटिव)) का उपयोग करके, गिनती के लिए प्रत्येक चैनल (यानी, नीला (नाभिक/Hoechst), हरे (ROS), लाल (मृत/PI पॉजिटिव)) का उपयोग करके प्रत्येक छवियों को एक बार में खोलें। अउजागर नियंत्रण से शुरू करें और क्रमिक रूप से 1, 100, 1,000 और 10,000जे/एम-2पर जाएं।
- प्रत्येक क्षेत्र के लिए सॉफ्टवेयर मेनू में एक क्रॉस के रूप में चिह्नित सेल गिनती उपकरण का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें [ब्लू पॉजिटिव (Hoechst सकारात्मक; नाभिक), लाल सकारात्मक (पीआई सकारात्मक; मृत कोशिकाएं); प्रत्येक के अनुरूप छवियों में से प्रत्येक में ग्रीन पॉजिटिव (आरओएस)] उपचार.
- प्रत्येक फ़ील्ड में प्रत्येक विशिष्ट संकेतों पर क्लिक करके गणना करें। उदाहरण के लिए, नीले/Hoechst दाग नाभिक पर क्लिक करने से किसी दिए गए क्षेत्र में नाभिक की कुल संख्या मिल जाएगी ।
- यूवी क्षति द्वारा सेल मृत्यु के प्रतिशत के रूप में परिणामों की गणना करें (Hoechst सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या से विभाजित पीआई सकारात्मक कोशिकाओं x 100 की संख्या) और यूवी क्षति द्वारा आरओएस उत्पादन का प्रतिशत (डीसीएफडीए सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या एक्स 100 Hoechst सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या से विभाजित)।
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Representative Results
डीसीएफडीए एक बेरंग रंग है जो कोशिकाओं में आरओएस का पता लगाने के लिए संकेतक के रूप में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरेसिन का रासायनिक रूप से कम रूप है। यह डाइ कोशिकाओं के अंदर फंस जाता है और आसानी से फ्लोरोसेंट डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन (डीसीएफ) के लिए ऑक्सीकृत हो जाता है, जो हरे रंग की फ्लोरेसेंस का उत्सर्जन करता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इस फ्लोरेसेंस का पता लगाया जा सकता है। कोशिकाओं की कल्पना की जा सकती है और इस प्रकार आरओएस संचय के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है: (i) ओएस के बिना लाइव कोशिकाएं उच्च नीले फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करती हैं; (ii) ओएस संचय के साथ लाइव कोशिकाएं कम हरे रंग की फ्लोरेसेंस के साथ उच्च नीले फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करती हैं; और (iii) आरओएस संचय के साथ मृत कोशिकाएं उच्च लाल और उच्च हरे रंग की फ्लोरेसेंस के साथ कम नीले रंग की फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करती हैं।
यूवी-सी के 1 J/m2 के संपर्क में कोशिकाओं और कोशिकाओं को नियंत्रित DCFDA/ROS और PI सकारात्मक कोशिकाओं का प्रदर्शन नहीं किया । यूवी-सी अनएक्सपोज्ड नियंत्रण ने परमाणु धुंधला ही दिखाया जैसा कि Hoechst धुंधला(चित्रा 1)द्वारा संकेत दिया गया है । हालांकि, यूवी-सी अनएक्सपोज्ड कंट्रोल सेल(चित्रा 1)में कोई पीआई या डीसीएफडीए सकारात्मक कोशिकाएं नहीं देखी गईं।
यूवी-सी के १०० J/m2 के संपर्क में कोशिकाओं कम ROS और PI सकारात्मक कोशिकाओं का प्रदर्शन किया । 100 जे/एम2 की खुराक पर यूवी-सी के संपर्क में आने पर माउस नेत्र सतह से प्राथमिक कोशिकाओं ने डीसीएफडीए और पीआई के लगभग 5% सह-धुंधला दिखाया, जिससे, 5% कोशिकाओं में आरओ और सेल डेथ के गठन का संकेत है(चित्रा 1)।
यूवी-सी के 1,000 जे/एम2 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने 60%-70% आरओएस और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। 1,000 जे/एम2 की खुराक पर यूवी-सी के संपर्क में आने पर माउस नेत्र सतह से प्राथमिक कोशिकाओं ने डीसीएफडीए और पीआई के लगभग 70% सह-धुंधला दिखाया, जिससे 70% कोशिकाओं में आरओ और सेल मृत्यु के गठन का संकेत मिलता है(चित्रा 1)।
यूवी-सी के 10,000 जे/एम2 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने 100% आरओएस पॉजिटिव कोशिकाओं और ~ 100% सेल डेथ का प्रदर्शन किया। माउस नेत्र प्राथमिक कोशिकाओं के संपर्क में आने पर उच्चतम यूवी-सी खुराक (10,000 जे/एम2)के परिणामस्वरूप 100% कोशिका मृत्यु (पीआई पॉजिटिव कोशिकाएं) और आरओएस गठन (डीसीएफडीए धुंधला) हुआ, जिससे इस विशेष यूवी-सी खुराक(चित्रा 1)की उच्चतम घातकता का संकेत मिलता है।
यूवी-सी विकिरण के 1 J/m2 के साथ इलाज कोशिकाओं को ROS का कोई संचय नहीं दिखा था और इस खुराक में जीवित कोशिकाओं का प्रतिशत नियंत्रण कोशिकाओं के साथ तुलनीय था । कोशिकाओं ने १०० J/m2पर सेल डेथ और आरओएस संचय की एक महत्वपूर्ण राशि का प्रदर्शन किया । यूवी-सी विकिरण के १०,००० जे/एम2 के साथ इलाज कोशिकाओं में आरओएस संचय और सेल मौत की उच्चतम राशि देखी गई ।
मात्रानिर्धारित परिणाम (धारा 6.3 के तहत दिए गए सूत्रों के अनुसार आरओएस जनरेशन का प्रतिशत और सेल डेथ का प्रतिशत) को बार ग्राफ(चित्रा 2)के रूप में प्लॉट किया गया था। एक्स-एक्सिस यूवी-सी खुराक का प्रतिनिधित्व करता है जबकि वाई-एक्सिस कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। हरे रंग की पट्टी आरओएस के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है, और लाल सलाखों यूवी-सी विकिरण(चित्रा 2)की विभिन्न खुराकों पर सेल मौत का प्रतिनिधित्व करते हैं। आरयूवी-सी खुराक में आरओएस और मृत कोशिकाओं का प्रतिशत 0%, 0%, 10%, ७०% और १००% के आदेश का था: उजागर नियंत्रण, 1 J/m2,१०० J/m2,१,००० J/m2 और १०,००० J/m2,क्रमशः(चित्रा 2)।
चित्रा 1: माउस नेत्र सतह प्राथमिक यूवी-सी (अनएक्सपोज्ड नियंत्रण, 1, 100, 1,000, 10,000, 10,000 J/m2)की विभिन्न खुराकों के संपर्क में आने वाले माउस नेत्र सतह प्राथमिक कोशिकाओं की समग्र लाइव-सेल छवियां। इन छवियों को विभिन्न फिल्टर के तहत कैप्चर किया गया था: उज्ज्वल क्षेत्र (सेल आकृति विज्ञान के लिए), नीला (Hoechst परमाणु दाग), हरे (ROS पीढ़ी) और लाल (प्रोपिडियम आयोडाइड दाग मृत कोशिकाओं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: यूवी-सी विकिरण की विभिन्न खुराकों के लिए प्राथमिक माउस नेत्र सतह कोशिकाओं के जोखिम पर आरओएस पीढ़ी के प्रतिशत और मृत कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना के बाद प्राप्त मात्राकरण परिणामों को दिखाने वाले बार ग्राफ। एक्स-एक्सिस यूवी-सी खुराक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि वाई-एक्सिस कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| घटक | आयतन |
| डीएमईएम युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम | 9790 μL |
| डीसीएफडीए स्टॉक समाधान | 5 माइक्रोन |
| Hoechst 33342 स्टॉक समाधान | 5 माइक्रोन |
| प्रोपिडियम आयोडाइड स्टॉक समाधान | 200 माइक्रोन |
तालिका 1: धुंधला समाधान की तैयारी के लिए आवश्यक अभिकर्मक।
| समस्या | संभावित कारण | समस्या निवारण | टिप्पणियाँ |
| नहीं या बहुत कम ROS या PI सकारात्मक कोशिकाओं दाग रहे है जब कोशिकाओं को उच्च से उच्चतम यूवी खुराक के साथ इलाज किया गया | i. एक पुराने धुंधला समाधान का उपयोग करें। | i. हौसले से तैयार धुंधला समाधान का प्रयोग करें। | i.पहले तैयार धुंधला समाधान कोशिकाओं के अनुचित धुंधला हो जाता है। |
| ii. अतिसंवर्ती संस्कृति पकवान जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं द्वारा यूवीसी क्षति का बचाव होता है। | ii.प्रत्येक 35 मिमी सेल संस्कृति डिश में केवल 0.2 मिलियन कोशिकाओं को प्लेट करें और कभी भी कोशिकाओं को यूवीसी खुराक को उजागर करने से पहले 12 घंटे से अधिक समय तक बढ़ने की अनुमति न दें। | ii.ओवरकॉन्फ्लोरेंट कोशिकाएं यूवीसी क्षति से उबार सकती हैं, और इसलिए कोई या थोड़ा आरओ सिक कोशिकाओं की कल्पना नहीं की जाएगी। |
तालिका 2: समस्या निवारण।
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Discussion
यहां वर्णित डीसीएफडीए धुंधला विधि यूवी-सी विकिरण के साथ इलाज माउस प्राथमिक नेत्र लाइव कोशिकाओं में आरओ एस के दृश्य सक्षम बनाता है । इस धुंधला विधि का एक लाभ यह है कि यह शोधकर्ताओं को लाइव कोशिकाओं पर यूवी-सी (3 घंटे बाद यूवीसी एक्सपोजर) के तत्काल प्रभावों का अध्ययन करने और आरओएस सकारात्मक के प्रतिशत के साथ-साथ मृत कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए उनकी एक साथ गणना का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, जैसा कि लाइव कोशिकाओं पर धुंधला विधि का उपयोग किया जाता है, कोशिकाओं को यूवी-सी विकिरण के विलंबित प्रभावों के अध्ययन के लिए लंबे समय (कई दिनों) के लिए एक ही मीडिया में आगे इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। इसलिए, यह धुंधला विधि आरओएस पीढ़ी (हरे) की कल्पना करना संभव बनाती है और साथ ही एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत जीवित कोशिकाओं में लाइव, अपोप्टिक और मृत कोशिका आबादी को अलग करती है। हालांकि, कुछ परिस्थितियों में, आरओएस सकारात्मक और पीआई सकारात्मक कोशिकाओं को प्राप्त करने की प्रत्याशा के बावजूद, दृश्य विफल हो सकता है। ऐसे उदाहरणों के लिए, समस्या निवारण का सुझाव दिया जाता है(तालिका 2)।
इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को सही तरीके से किया जाना चाहिए। इष्टतम परिणाम विशिष्ट यूवी-सी खुराक प्रेरित डीएनए क्षति के सटीक readout के रूप में उत्पन्न हरे फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जित/ROS के संबंध का संकेत देते हैं । दूसरे शब्दों में, इस कदम को अंजाम देने के लिए यूवी-सी एक्सपोजर के दौरान कोशिकाओं के संपर्क में आने वाले मीडिया की मात्रा इतनी नहीं होनी चाहिए कि यूवी-सी खुराक आवश्यक क्षति को प्रकाश में लाने में विफल रहती है । इसलिए, मीडिया की न्यूनतम मात्रा रखना आवश्यक है, प्रति 35 मिमी डिश 500 माइक्रोन कहते हैं, सभी निर्दिष्ट खुराकों पर यूवी-सी एक्सपोजर के दौरान कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त है। दूसरे, मीडिया की मात्रा इतनी कम नहीं होनी चाहिए कि यूवी-सी एक्सपोजर के दौरान कोशिकाएं सूख जाएं । अंत में, यूवी-सी के लिए कोशिकाओं के जोखिम के तुरंत बाद, कोशिकाओं को किसी भी नुकसान और आरओएस पीढ़ी से बचने के लिए इष्टतम मात्रा (2 mL कहो) के लिए ताजा मीडिया के साथ सबसे ऊपर होना चाहिए।
इस तकनीक की एक सीमा आरओबी का प्रकार उत्पन्न है। यूवी-सी खुराक पर्वतमाला के जवाब में विशिष्ट आरओएस प्रकार का पता लगाने के लिए अन्य अतिरिक्त परखों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। इस तरह के रूपों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेलर हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल(• ओह),इंट्रासेलर सुपरऑक्साइड रेडिकल्स, इंट्रासेलर रिएक्टिव नाइट्रोजन प्रजाति, माइटोकॉन्ड्रियल हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स, माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड का आकलन शामिल है। इस तकनीक की एक अन्य सीमा 10 जे/एम2 से नीचे की खुराक पर प्रतिशत आरओएस पीढ़ी की पता लगाने की क्षमता और 10,000 जे/एम2से ऊपर है। जाहिर है, कोई ROS सकारात्मक कोशिकाओं दिखाई दे रहे थे जब प्राथमिक कोशिकाओं/माउस नेत्र सतह से स्टेम कोशिकाओं यूवी सी खुराक से कम 10 J/m2को उजागर किया गया । इसके विपरीत, १००% ROS सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाई दे रहे थे जब कोशिकाओं को १०,००० J/m2से ऊपर यूवी सी खुराक के संपर्क में थे । इसलिए, अन्य परख (जैसे, एंजाइम विश्लेषण, ऑक्सीडेटिव तनाव मार्कर जैसे 8-हाइड्रोक्सीडिऑक्सीगुआनोसिन (8-ओएचडीजी) (डीएनए क्षति मार्कर), और विभिन्न खुराकों पर डीएनए क्षति प्रोटीन का पश्चिमी दाग विश्लेषण) विभिन्न स्तरों पर सेलुलर/आणविक क्षति की सीमा/प्रकार को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है । इस तकनीक की तीसरी सीमा विभिन्न सेल प्रकारों में उत्पन्न आरओसी के लिए यूवी-सी खुराक का संबंध है। इसे मान्य करने की जरूरत है।
वर्तमान में, डीसीएफडीए किट या तो माइक्रोस्कोपी या प्रवाह साइटोमेट्री10,11का उपयोग कर आरओएस का पता लगाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । हालांकि, इस तरह के किट महंगे हैं और संसाधन प्रतिबंधित देशों में अनुसंधान प्रयोगशालाओं द्वारा वहन नहीं किया जा सकता है । इसलिए, यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से बेचे जाने वाले तरीकों के समान दक्षता के साथ बहुत उपयोगी है। दूसरे, हमने डीसीएफडीए/आरओएस पीढ़ी के साथ प्रोपिडियम आयोडाइड डेड सेल दाग को शामिल किया है । इसलिए, इस विधि का उपयोग करके आरओएस सकारात्मक और मृत कोशिकाओं की लाइव सेल निगरानी एक साथ की जा सकती है।
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Disclosures
लेखकों को लेख को प्रायोजित करने के लिए बायो-रेड लेबोरेटरीज इंडिया प्राइवेट लिमिटेड से फंडिंग सपोर्ट मिला ।
Acknowledgments
लेखक ढांचागत सुविधाओं के लिए येनेपोया रिसर्च सेंटर, येनेपोया (डीम्ड टू डीम्ड टू यूनिवर्सिटी) से समर्थन स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
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