Summary
このプロトコルは、マウスの眼表面細胞からの活性一次培養における活性酸素種(ROS)、生細胞、および死細胞の同時検出を実証する。2',7'-ジクロロフルオレセインセテート、ヨウ化プロピジウム、ヘーチスト染色を用いてROS、死細胞、生細胞をそれぞれ評価し、続いてイメージングと分析を行います。
Abstract
眼表面は、様々な環境要因により定期的な消耗を受ける。UV-C放射線への暴露は、労働衛生上の危険を構成する。ここでは、マウスの眼面からUV-C線への一次幹細胞の被曝を実証する。活性酸素種(ROS)形成は、酸化的ストレス/損傷の程度の読み出しです。実験的なインビトロ設定では、酸化ストレスのために生成された死細胞の割合を評価することも不可欠です。この記事では、UV-C曝露マウス一次眼表面幹細胞の2',7'-ジクロロフルオレシンセインテアト(DCFDA)染色とDCFDA染色の蛍光画像に基づく定量を紹介します。DCFDA 染色は直接 ROS 生成に対応します。また、ヨウ化プロピジウム(PI)とヘーヒト3332との同時染色とDCFDA(ROS陽性)およびPI陽性細胞の割合を同時に染色することにより、死細胞と生細胞の定量化を実証した。
Introduction
眼表面(OS)は、角膜の外層及び腺上皮を主成分とする機能ユニットであり、涙腺、筋膜腺、結膜、眼瞼のマージン及び信号を変換するインナーベーションの一部である1。透明ドーム型の角膜層は、光をレーティナに焦点を当てています。この血管組織は、上皮細胞、角質細胞、及び内皮細胞およびコラーゲンおよびグリコサミノグリカンなどの細胞内皮細胞および細胞成分2などの細胞成分から構成される。この地域は、栄養素のほとんどを供給する涙によって排出されます。OSの解剖学的位置は、外部環境に直接接触することを余びれにし、明るい光、微生物、塵の粒子および化学薬品のようなさまざまな粗い部品にそれをしばしば露出させる。この要因は、物理的な傷害にOSを素因とし、それが様々な病気になりやすいです。
酸化ストレスは、活性酸素種(ROS)の生成と内因性抗酸化防御機構3との間の不一平衡に起因する。ROSは反応性分子とフリーラジカルに分類され、いずれもミトコンドリア酸化リン酸化4を介して分子酸素(O2)に由来する。前者の群は、過酸化水素(H2O2)、一重酸素(1O2)などの非ラジカル種から構成され、後者はスーパーオキシドアニオン(O2-)、およびヒドロキシルラジカル(•OH)などの種を含む。これらの分子は、正常な細胞プロセスの副産物であり、その役割は、シグナル伝達、遺伝子発現、および宿主防御5などの重要な生理機能に関与している。ROSの産生の増強は、病原体侵入、異種生物、紫外線(UV)放射線への曝露などの因子に応答して生成されることが知られている4。このROSの過剰産生は、核酸、タンパク質、脂質などの分子の損傷につながる酸化ストレスをもたらす6。
UV 放射の最も主要な光源である自然光は、UV-A (400 ~320 nm)、UV-B (320 ~290 nm)、UV-C (290~200 nm)7で構成されています。波長とスペクトルエネルギーの逆相関が報告されている。自然UV-C放射は大気に吸収されますが、水銀灯や溶接器具などの人工的な光源が放出され、したがって、職業上の危険を構成します。眼への暴露の症状は、光角膜炎および光角結膜炎8を含む。ROSの産生は、UV誘導細胞損傷9を与える主要なメカニズムの1つである。今回の研究では、UV-Cに曝露されたマウスの一次眼表面細胞/幹細胞における2',7'-ジクロロジハイドロフルオレセインダイアセテート(DCFDA)染色法を用いてROSの検出を実証した。緑色蛍光を蛍光顕微鏡を用いて捕捉した。細胞は、ヘエヒト33342および赤色のヨウ化プロピジウムの2つの染料でカウンター染色し、それぞれ生細胞および死細胞を染色した。
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Protocol
実験は、スイスのアルビノマウスアイに由来する一次眼細胞/幹細胞に対して行った。この実験のための目を収穫するための動物の使用は、制度動物倫理委員会、イェネポヤ(大学とみなされる)によって承認されました(IEAC承認番号、6a /19.10.2016)。
1. 試薬の調製
注: マウスの眼表面からの主細胞/幹細胞の導出は、このプロトコルの範囲を超えています。したがって、UV-C曝露量、ROSを評価するための試薬調製、生細胞および死細胞およびそれらの定量を実証する。試薬の各容積については表1を参照してください(最終染色液を得るために添加される10%ウシ胎児血清、DCFDA、ヘキストおよびプロピジウムヨウ化ストック溶液)。
- DMSOの5.13 mLでDCFDA粉末の25 mgを溶解することにより、10 mM DCFDAのストック溶液を調製します。アリク250 μLは、アンバー色1.5mLチューブにそれぞれ250μL、-20°Cで保存します。
- 25 mg バイアルの内容物全体を 2.5 mL の脱イオン水に溶解して、10 mg/mL (16.23 mM 溶液) Hoechst 33342 のストック溶液を調製します。アンバー色のマイクロ遠心チューブに100μLのアリコートを作り、最大6ヶ月間2〜6°Cで保管してください。長期保存のために、-20 °Cで保管してください。
- 1 mg/mLのヨウ化プロピジウムを脱イオン水にストック液を調製し、アリコート1mLをアンバー色の1.5mLチューブにそれぞれ、4°Cで保存する。
2. 細胞めっきおよびUV-C放射線処理
- めっき前に、我々の研究室で単離されたマウスの一次眼表面細胞(未発表の結果;そのような細胞は、穏やかな細胞解離剤(材料表)を用いて角膜上皮、間質細胞および角質細胞の混合物である。
- プレート0.2 x 106マウスの一次眼表面細胞を35mm 0.2%基調膜マトリックスコーティングした細胞培養皿で2.5mLの完全培地。5%CO2と加湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートする。
注:マウス眼表面から一次細胞を培養するための完全な培地は、20%FBS、1%ペンストレップ、1%グルタマックス、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%のピルビン酸ナトリウム、および0.1%-βメルカプトエタノールを含むDMEM高グルコースで構成されています。 - 細胞を様々な用量のUV-Cに曝露する前に、最大量の媒体を廃棄し、薄い層の培地(約500μL)のみが細胞と接触し続け、それらを覆うのに十分です。
- UV-Cソース/チャンバー(ハイブリダイゼーションオーブン/UVクロスリンカーの下部室)に一度に1つずつ、皿を取ります。資料の表)。皿をチャンバーに入れ、皿の蓋を取り外します。皿の開いたふたの位置は細胞がUV-C露光の間に最大UV-C線量を受け取ること保障する。
- 細胞をUV-Cの異なるグレード/用量に曝露する:1 J/m 2、100J/m2、1,000 J/m 2および10,000 J/m2。
- UV-C露光後、すぐに各皿の蓋を交換し、UV-Cソースチャンバーからそれらを取り外します。
- 各料理を層流フードに持ち込み、2 mLの新鮮な完全なメディアで各料理を上にします。
- 37 °CCO2インキュベーターで3時間細胞をインキュベートする。UV-C曝露後の3時間のインキュベーションは、初期の効果を視覚化して定量化するのに最適です。
3. 生細胞染色媒体の調製
- 3時間の細胞インキュベーションポストUV-C露光の最後の15分の間に新鮮な染色媒体を準備します。
- 10% FBS-DMEMを含む染色媒体のプレウォーム10 mLは、37°Cに1%ペンストレップで補足した。
- 10 mM DCFDA の 5 μL を追加します。5 mg/mL ヘクスト溶液の 5 μL と 200 μL の 1 mg/mL ヨウ化プロピジウム.DCFDA、Hoechst、および PI の最終濃度は、10 mL の染色媒体でそれぞれ 5 μM、5 μg/mL、20 μg/mL です。
4. UV-C曝露マウス主眼球のDCFDA染色
- UV-C曝露マウスの主眼球細胞を様々な用量で3時間インキュベートした後、培地を35mmの皿から吸引した。
- 各皿に2mLの作製DCFDA染色媒体をそっと補って補充してください。
- 37°CのCO2インキュベーターで暗闇の中で15分間染色培地を用いて細胞をインキュベートし、生細胞染色を行います。
DCFDA(ROS)、ホーハスト細胞、PI染色細胞の観察
- インキュベーション終了後、染色媒体を廃棄する。
- 細胞に新鮮な完全な媒体を追加し、反転蛍光顕微鏡/細胞のイメージャー(材料のテーブル)の下で細胞を観察します。希望のフィールドを撮影: 明視野, 青色蛍光, 赤蛍光, 緑色蛍光.
注:青色蛍光染色された細胞は核であり、緑色蛍光はROS生成細胞用であり、赤色蛍光はPI陽性死細胞を示す。
6. イメージング技術を用いた染色細胞(ホーチストブルー、PIデッド、グリーン-ROS)の定量化
- 反転蛍光顕微鏡/細胞イメージャーの下で撮影した画像を、定量化のためにImageJにエクスポートします。
- 各チャンネル(すなわち、青(nuclei/Hoechst)、緑(ROS)、赤(Dead/PI陽性))を使用して、カウントのために各画像を1つずつ開きます。非露出制御から開始し、1、100、1,000、10,000 J/m-2に順次移動します。
- 各フィールドのソフトウェアメニューで十字架としてマークされたセルカウントツールを使用してセルを数える [青陽性 (Hoechst 陽性; 核), 赤陽性 (PI 陽性; 死細胞); 緑色陽性 (ROS)] 各画像に対応する各画像で、治療。
- 各フィールドの各特定のシグナルをクリックしてカウントします。たとえば、青/Hoechst染色された核をクリックすると、所定のフィールド内の核の総数が得されます。
- 結果を、UV損傷による細胞死の割合(PI陽性細胞数x100をホーハスト陽性細胞数で割った数)と、ROS産生の割合をUV損傷(DCFDA陽性細胞数x100)で計算する。
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Representative Results
DCFDAは、細胞内のROSを検出するための指標として使用されるフルオレセインの化学的に還元された形態である無色色の色素である。この色素は細胞内に閉じ込められ、緑色蛍光を発する蛍光ジクロロジハイドロフルオレセイン(DCF)に容易に酸化されます。この蛍光は蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。細胞は、次のようにROS蓄積と可視化し、相関することができます:(i)ROSのない生細胞は、高い青色蛍光を放出する。(ii) ROS蓄積を有する生細胞は、低緑色蛍光で高い青色蛍光を発する。ROS蓄積を有する(iii)死細胞は、高い赤色および高緑色蛍光を有する低青色蛍光を発する。
コントロール細胞および細胞をUV-Cの1J/m2に曝露した細胞は、DCFDA/ROSおよびPI陽性細胞を示さなかった。UV-Cの非露光制御は、ホーハスト染色によって示される核染色のみを示した(図1)。しかし、UV-C非露光対照細胞にはPIまたはDCFDA陽性細胞は見られなかった(図1)。
UV-Cの100J/m2に曝露された細胞は、低いROSおよびPI陽性細胞を示した。100J/m2の用量でUV-Cに曝露したマウスの眼表面から原発細胞は、DCFDAとPIの約5%の共染色を示し、それによって、細胞の5%におけるROSおよび細胞死の形成を示す(図1)。
UV-Cの1,000J/m2に曝露された細胞は、60%~70%のROSおよびPI陽性細胞を示した。1,000 J/m2の用量でUV-Cに曝露したマウスの眼表面から原発細胞は、DCFDAとPIの約70%の共染色を示し、それによって、細胞の70%におけるROSおよび細胞死の形成を示す(図1)。
UV-Cの10,000J/m2に曝露された細胞は、100%ROS陽性細胞および〜100%細胞死を示した。最も高いUV-C用量(10,000J/m2)をマウス眼科初等細胞に曝露した場合、100%細胞死(PI陽性細胞)およびROS形成(DCFDA染色)をもたらし、それにより、この特定のUV-C用量の最高致死率を示す(図1)。
UV-C照射の1J/m2で処理された細胞はROSの蓄積を示さなかったし、この用量の生細胞の割合は対照細胞のそれと同等であった。細胞は100 J/m2でかなりの量の細胞死およびROS蓄積を示した。10,000 J/m2のUV-C放射線で処理された細胞において、最も高い量のROS蓄積および細胞死が観察された。
定量化結果(セクション6.3に示された式に従ったROS発生の割合および細胞死の割合)を棒グラフの形でプロットした(図2)。X軸はUV-C線量を表し、Y軸は細胞のパーセンテージを表します。緑色のバーは ROS のパーセンテージを表し、赤いバーは異なる UV-C 放射線での細胞死を表します (図 2)。ROSおよび死細胞の割合は、UV-C用量で0%、0%、10%、70%、および100%のオーダーであった:非露出対照、1 J/m 2、100 J/m2、10,000J/m2、それぞれ10,000 J/m2、(図2)。
図1:様々な用量のUV-Cに曝露されたマウス眼面一次細胞の合成生細胞画像(非露光対照、1、100、1,000、10,000J/m2)。これらの画像は、明視野(細胞形態)、青色(ヘーチスト核染色)、緑(ROS生成)および赤色(ヨウ化プロピジウム染色死細胞)の異なるフィルターの下で撮影された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バラグラフは、主マウス眼表面細胞を様々な線量のUV-C放射線に曝露した際のROS発生の割合および死細胞の割合を計算した後に得られた定量結果を示す。X軸はUV-C線量を表し、Y軸は細胞の割合を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | ボリューム |
| DMEMを含む10%胎児ウシ血清 | 9790 μL |
| DCFDA ストックソリューション | 5 μL |
| Hoechst 33342 株式ソリューション | 5 μL |
| ヨウ化プロピジウムストック溶液 | 200 μL |
表1:染色液の調製に必要な試薬。
| 問題 | 考えられる理由 | トラブルシューティング | コメント |
| 細胞が高~高いUV線量で処理されたときに、ROSまたはPI陽性細胞が染色されないか、またはごくわずかな | i. 古い染色液の使用。 | i. 作り出した染色液を使用します。 | i. 以前に調製した染色液は、細胞の不適切な染色につながります。 |
| ii. 細胞によるUVC損傷の救済をもたらすオーバーコンフルエント培養皿。 | ii. 35mm細胞培養皿にわずか0.2万個の細胞をプレートし、UVC線量に曝露する前に細胞が12時間以上成長することを決して許さない。 | ii. オーバーコンフルエント細胞はUVC損傷を救うことができるので、ROSおよびPI陽性細胞は視覚化されない。 |
表 2: トラブルシューティング
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Discussion
ここで説明するDCFDA染色法により、UV-C線で処理されたマウスの一次眼の生細胞におけるROSの可視化が可能になります。この染色方法の利点は、研究者が生きた細胞に対するUV-C(UVC暴露後3時間)の即時効果と、ROS陽性の割合と死んだ細胞の割合に対する同時列挙を研究できることです。また、染色法が生細胞に用いられているように、細胞は、UV-C放射線の遅延効果の研究のためにより長い時間(数日間)同一の培地中で更にインキュベートすることができる。したがって、この染色法により、ROS生成(緑色)を可視化し、同時に生細胞内の生細胞、アポトーシスおよび死細胞集団を反転蛍光顕微鏡下で区別することが可能になります。しかし、特定の状況下では、ROS陽性およびPI陽性細胞を得ることを期待しているにもかかわらず、視覚化は失敗する可能性があります。そのような場合は、トラブルシューティングを推奨します (表 2)。
このプロトコルは、最適な結果を得るために正確に行われなければなりません。最適な結果は、特定のUV-C線量誘発DNA損傷の正確な読み出しとして生成された緑色蛍光シグナルの相関関係を示す。つまり、この工程を実施するために、UV-C曝露中に細胞と接触する媒体の体積は、UV-C線量が必要な損傷を引き起こすのにそれほど多くはないべきである。したがって、35mm皿当たり500μLの媒体を最小限に抑え、UV-C曝露中に細胞を全量で覆うだけで十分である。第二に、培地の量は、UV-C曝露中に細胞が乾燥するほど少なくすべきではありません。最後に、細胞をUV-Cに曝露した直後に、細胞は、損傷およびROS生成をさらに回避するために、新鮮な媒体を最適な体積(例えば2 mL)にトッピングする必要があります。
この手法の 1 つの制限は、生成される ROS のタイプです。他の追加のアッセイは、UV-C線量範囲に応答して特定のROSタイプを検出するために行われなければならない。このようなアッセイには、市販のキットを用いた細胞内ヒドロキシルラジカル(•OH)、細胞内超酸化物ラジカル、細胞内反応性窒素種、ミトコンドリアヒドロキシルラジカル、ミトコンドリアスーパーオキシド、および生細胞中の過酸化水素の評価が含まれる。この技術のもう一つの制限は、10 J/m2未満および10,000 J/m2を超える用量でのROS生成のパーセンテージの検出可能性である。明らかに、マウスの眼表面から主細胞/幹細胞を10J/m2未満のUV-C線量にさらした場合、ROS陽性細胞は見えませんでした。それどころか、100%ROS陽性細胞は、細胞が10,000 J/m2を超えるUV-C線量にさらされたときに見えた。したがって、他のアッセイ(例えば、酵素分析、8-ヒドロキシエオキシグアノシン(8-OHdG)などの酸化ストレスマーカーの測定(DNA損傷マーカー)、および様々な用量でのDNA損傷タンパク質のウェスタンブロット分析は、様々なレベルでの細胞/分子損傷の程度/タイプを理解するのに有用である。この技術の第3の制限は、様々な細胞タイプにわたって生成されたROSへのUV-C用量の相関である。これを検証する必要があります。
現在、DCFDAキットは、顕微鏡法またはフローサイトメトリー10、11のいずれかを用いてROS検出用に市販されている。しかし、このようなキットは高価であり、資源制限国の研究所では手に入りません。したがって、このプロトコルは、商業的に販売された方法に似た効率で非常に有用です。第二に、我々は、DCFDA/ROS生成と共にヨウ化プロピジウム死細胞染色を組み込んだ。したがって、ROS陽性および死細胞の生細胞モニタリングは、この方法を用いて同時に行うことができる。
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Disclosures
著者は、この記事のスポンサーのためにバイオ・ラッド・ラボラトリーズ・インディア・プライベート・リミテッドから資金援助を受けました。
Acknowledgments
著者らは、インフラ施設に対するイェネポヤ研究センター、イェネポヤ(大学とみなされる)からの支援を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
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