Summary
Этот протокол демонстрирует одновременное обнаружение реактивных видов кислорода (ROS), живых клеток и мертвых клеток в живых первичных культурах из клеток поверхности мыши. 2',7'-Dichlorofluorescececetate, пропидий йодида, и Hoechst окрашивания используются для оценки ROS, мертвых клеток, и живых клеток, соответственно, а затем изображения и анализа.
Abstract
Глазная поверхность подвергается регулярному износу из-за различных факторов окружающей среды. Воздействие УФ-С представляет опасность для здоровья работников. Здесь мы демонстрируем воздействие первичных стволовых клеток с поверхности мышки глазной поверхности на ультрафиолетовое излучение. Формирование реактивных видов кислорода (ROS) является считывателем степени окислительного стресса/повреждения. В экспериментальной обстановке in vitro также важно оценить процент мертвых клеток, генерируемых из-за окислительного стресса. В этой статье мы продемонстрируем 2',7'-Dichlorofluorescececetate (DCFDA) окрашивание УФ-C подвергаются мыши первичных глазных стволовых клеток и их количественной оценки на основе флуоресцентных изображений DCFDA окрашивания. ОКрашивание DCFDA напрямую соответствует поколению ROS. Мы также демонстрируем количественную оценку мертвых и живых клеток путем одновременного окрашивания с пропидий йодид (PI) и Hoechst 3332 соответственно и процент DCFDA (ROS положительные) и PI положительные клетки.
Introduction
Глазная поверхность (ОС) является функциональным устройством, состоящим в основном из внешнего слоя и железистой эпителии роговицы, лахримальной железы, мейбомианской железы, конъюнктивы, части поля крышки глаза и иннервации, которые преобразовывают сигналы1. Прозрачный слой роговицы в форме купола фокусирует свет на сетчатке. Эта васкулярная ткань состоит из клеточных компонентов, таких как эпителиальные клетки, кератоциты, эндотелиальные клетки и ацеллические компоненты, такие как коллаген и гликозаминогликан2. Область осушена слезами, которые также поставляют большую часть питательных веществ. Анатомическое положение ОС заставляет ее находиться в непосредственном контакте с внешней средой, часто подвергая ее различным суровым компонентам, таким как яркий свет, микробы, частицы пыли и химические вещества. Этот фактор предрасполагает ОС к физическим травмам и делает ее подверженной различным заболеваниям.
Оксидативный стресс вызван из-за дисбаланса между производством реактивных видов кислорода (ROS) и эндогенных антиоксидантных защитных механизмов3. ROS классифицируются на реактивные молекулы и свободные радикалы, оба из которых получены из молекулярного кислорода (O2) через митохондриальную окислительную фосфорилатацию4. Первая группа состоит из нерадикальных видов, таких как перекись водорода (H2O2), синглетный кислород (1O2) и последний включает в себя такие виды, как супероксидные анионы (O2-), и гидроксиловые радикалы (З.OH), среди других. Эти молекулы являются побочными продуктами нормальных клеточных процессов и их роли были вовлечены в важные физиологические функции, такие как трансдукция сигнала, экспрессия генов, и принимающей защиты5. Увеличенное производство ROS, как известно, генерируется в ответ на такие факторы, как патогенвторжения, ксенобиотики, и воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения4. Это перепроизводство ROS приводит к окислительному стрессу, что приводит к повреждению молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки и липиды6.
Природный солнечный свет, наиболее преобладающий источник УФ-излучения, состоит из УФ-А (400-320 нм), УФ-В (320-290 нм) и УФ-С (290-200 нм)7. Сообщалось об обратной корреляции между длиной волны и спектральными энергиями. Хотя естественные ультрафиолетовые излучения поглощаются атмосферой, искусственные источники, такие как ртутные лампы и сварочные приборы, испускают и, следовательно, представляют собой профессиональную опасность. Симптомы воздействия на глаза включают фотокератит и фотокератоконъюнктивит8. Производство ROS является одним из основных механизмов нанесения УФ индуцированного клеточного повреждения9. В текущем исследовании, мы демонстрируем обнаружение ROS с помощью 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein диацетат акцентратат (DCFDA) окрашивающий метод в мыши первичных глазных поверхностных клеток / стволовых клеток, подверженных УФ-C. Зеленая флуоресценция была захвачена с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки были противозапятнаны двумя красителем, Hoechst 33342 и красным йодидом propidium, чтобы испачкать живые и мертвые клетки, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперимент проводился на первичных глазных клетках/стволовых клетках, полученных из швейцарского глаза мыши альбиносов. Использование животных для сбора глаз для этого эксперимента было одобрено Институциональным комитетом по этике животных, Енепоя (Считается университетом) (номер одобрения IEAC, 6a/19.10.2016).
1. Подготовка реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Производные первичные клетки/стволовые клетки из поверхности окулярной мыши выходит за рамки этого протокола. Таким образом, мы демонстрируем дозы воздействия УФ-С, препарат реагента для оценки ROS, живых и мертвых клеток и их количественной оценки. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для соответствующих объемов реагентов (10% плода бычьей сыворотки, DCFDA, Hoechst и пропидий йодида фондовых решений, которые будут добавлены для получения окончательного раствора окрашивания).
- Подготовьте стоковое раствор 10 мМ DCFDA путем растворения 25 мг порошка DCFDA в 5,13 мл DMSO. Aliquot 250 qL каждый в янтаре цвета 1,5 мл труб и хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовьте стоковой раствор 10 мг/мл (16,23 мм раствора) Hoechst 33342 путем растворения всего содержимого флакона 25 мг в 2,5 мл деионированной воды. Сделать aliquots 100 qL в янтарных цветных микроцентрифуговых труб и хранить при 2-6 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев. Для более длительного хранения, хранить на -20 градусов по Цельсию.
- Приготовьте бульонный раствор 1 мг/мл пропидия йодида в деионизированной воде, aliquot 1 мл каждый в янтаре цвета 1,5 мл труб, и хранить при 4 градусах Цельсия.
2. Клеточное покрытие и ультрафиолетовая обработка
- Перед покрытием, диссоциировать мышь первичных глазных поверхностных клеток, изолированных в нашей лаборатории (неопубликованные результаты; такие клетки представляют собой смесь роговицы эпителия, стромальные клетки и кератоциты) с помощью мягкого средства диссоциации клеток (Таблица материалов).
- Плита 0,2 х 106 мыши первичных глазных поверхностных клеток в 35 мм 0,2% подвалм мембраны матрицы покрытием клеточной культуры блюд в 2,5 мл полных носителей. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 и увлажненный инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный носитель для культивирования первичных клеток из поверхности окулярной мыши состоит из DMEM высокой глюкозы, содержащей 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 1% пируват натрия, и 0,1% й-меркаптоэтанол. - Прежде чем подвергать клетки различным дозам УФ-С, отбросьте максимальный объем носителей и позвольте лишь тонкому слою носителей (500 евро) оставаться в контакте с клетками, достаточно, чтобы покрыть их.
- Возьмите посуду, по одному в ИСТОЧНИК УФ-С /камеру (нижняя камера гибридизации печи / УФ-кросс-связующим звеном; Таблица материалов). Поместите блюдо в камеру и снимите крышку блюда. Открытое положение крышки блюда гарантирует, что клетки получают максимальную дозу УФ-С во время воздействия УФ-С.
- Выставляем клетки в разные сорта/дозы УФ-С: 1 Дж/м2,100Дж/м2,1000 Дж/м2 и 10 000 Дж/м2.
- После воздействия УФ-С немедленно замените крышку каждого блюда и удалите их из исходной камеры UV-C.
- Принесите каждое из блюд на ламинарный капот воздушного потока и пополнить каждое из блюд с 2 мл свежих полных носителей.
- Инкубировать клетки в течение 3 ч в инкубаторе 37 градусов по ЦельсиюCO 2. Три часа инкубационного после УФ-С воздействия является оптимальным для визуализации и количественной оценки ранних эффектов.
3. Подготовка живых клеток окрашивания средств массовой информации
- Подготовка окрашивания средств массовой информации свежие в течение последних 15 минут 3 h инкубации клеток после УФ-C воздействия.
- Предварительно потеплев 10 мл окрашивания носителей, содержащих 10% FBS-DMEM, дополненного 1% Pen-Strep до 37 градусов по Цельсию.
- Добавить 5 зл и 10 мМ DCFDA; 5 л раствора Hoechst 10 мг/мл и 200 Л l 1 мг/мл пропидий йодида. Окончательные концентрации DCFDA, Hoechst и PI составляют 5 мкм, 5 мкг/мл и 20 мкг/мл, соответственно, в 10 мл окрашивания носителей.
4. DCFDA окрашивание УФ-C подвергаются мыши первичных глазных клеток
- После 3 ч инкубации УФ-С подвергаются мыши первичных глазных клеток в различных дозах, аспирации средств от 35 мм блюд.
- Пополнить с 2 мл свежеприготовленных DCFDA окрашивания средств массовой информации для каждого из блюд мягко со стороны.
- Инкубировать клетки с окрашивающими средствами для 15 мин в темноте в инкубаторе 37 C CO2 для окрашивания живых клеток.
5. Просмотр dcFDA (ROS), Hoechst и PI окрашенных клеток
- После завершения инкубации, отбросить окрашивания средств массовой информации.
- Добавить свежие полные носители в клетки и наблюдать клетки под перевернутым флуоресцентным микроскопом / клеточной imager (Таблица материалов). Фотография нужных полей: ярко-поля, синяя флуоресценция, красная флуоресценция, зеленая флуоресценция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синие флуоресцентно окрашенные клетки являются ядрами, зеленая флуоресценция для ROS генерирующих клеток и красная флуоресценция указывает На. положительных мертвых клеток.
6. Количественная оценка окрашенных клеток (Hoechst-Blue, PI-Dead и Green-ROS) с использованием методов визуализации
- Экспорт изображения, полученные под перевернутым флуоресцентным микроскопом/изображением ячейки, на ImageJ для количественной оценки.
- Откройте каждое из изображений по одному, используя каждый канал (т.е. синий (Nuclei/Hoechst), зеленый (ROS), красный (Мертвый/PI положительный)) последовательно, для подсчета. Начните с неэкспонированного управления и последовательно перейдите на 1, 100, 1000 и 10000 J/m-2.
- Подсчитайте ячейки с помощью инструмента подсчета ячеек, отмеченного как крест в меню программного обеспечения для каждого из полей (Hoechst positive; ядра), красный положительный (PI положительный; мертвые клетки); зеленый положительный (ROS) в каждом из изображений, соответствующих каждому из изображений Процедуры.
- Считайте, нажав на каждый из конкретных сигналов в каждом из полей. Например, нажатие на синие/Hoechst окрашенные ядра даст общее количество ядер в данном поле.
- Рассчитайте результаты как процент клеточной смерти от ПОВРЕЖДЕНИЯ УФ (количество положительных ячеек PI x 100, разделенных на количество положительных клеток Hoechst) и процент производства ROS по УФ-повреждению (количество положительных клеток DCFDA x 100 делится на количество положительных клеток Hoechst).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DCFDA является бесцветный краситель, который является химически уменьшенной формой флуоресцеина, используемой в качестве индикатора для обнаружения ROS в клетках. Этот краситель попадает в ловушку внутри клеток и легко окисляется до флуоресцентного дихлородигидрофторцеи (DCF), который испускает зеленую флуоресценцию. Эта флуоресценция может быть обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки могут быть визуализированы и коррелируют с накоплением ROS следующим образом: (i) живые клетки без ROS испускают высокую синюю флуоресценцию; ii) живые клетки с накоплением ROS испускают высокую синюю флуоресценцию с низкой зеленой флуоресценцией; и (iii) мертвые клетки с накоплением ROS испускают низкую синюю флуоресценцию с высокой красной и высокой зеленой флуоресценцией.
Контрольные клетки и клетки, подвергшиеся воздействию 1 J/m2 УФ-С, не выставляли положительных клеток DCFDA/ROS и PI. УФ-C unexposed управления показали ядерное окрашивание только как указано на Hoechst окрашивания(рисунок 1). Тем не менее, не PI или DCFDA положительные клетки были замечены в УФ-C неэкспонированных контрольных ячеек(Рисунок 1).
Клетки, подвергшиеся воздействию 100 J/m2 УФ-С, продемонстрировали низкие положительные клетки ROS и PI. Первичные клетки из поверхности мышки глазприятных при воздействии УФ-С в дозе 100 J/m2 показали около 5% совместного окрашивания DCFDA и PI, тем самым, что указывает на образование ROS и клеточной смерти в 5% клеток (Рисунок 1).
Клетки, подвергшиеся воздействию 1000 J/m2 УФ-С, продемонстрировали 60%-70% положительных клеток ROS и PI. Первичные клетки из мыши глазной поверхности при воздействии УФ-С в дозе 1000 J/m2 показали около 70% совместного окрашивания DCFDA и PI, тем самым, что указывает на образование ROS и клеточной смерти в 70% клеток (Рисунок 1).
Клетки, подвергшиеся воздействию 10 000 J/m2 УФ-С, продемонстрировали 100% положительные клетки ROS и гибель клеток на 100%. Самая высокая доза УФ-С (10 000 Дж/м2)при воздействии на мышь глазных первичных клеток привела к 100% клеточной смерти (PI положительные клетки) и ROS образования (DCFDA окрашивания), тем самым указывая на самую высокую летальность этой конкретной УФ-C дозы (Рисунок 1).
Клетки, обработанные 1 J/m2 излучения УФ-С, не показали накопления ROS, и процент живых клеток в этой дозе был сопоставим с долей контрольных клеток. Клетки продемонстрировали значительное количество клеточной смерти и накопления ROS на 100 J/m2. Наибольшее количество накопления ROS и клеточной смерти наблюдалось в клетках, обработанных 10 000 J/m2 излучения УФ-С.
Количественные результаты (процент ы генерации ROS и процент ы гибели клеток в соответствии с формулами, приведенными в разделе 6.3), были составлены в виде графика бара(рисунок 2). X-ось представляет дозы УФ-С, в то время как Y-оси представляет процент клеток. Зеленый бар представляет процент ROS, а красные полоски представляют гибель клеток в различных дозах УФ-С излучения(рисунок 2). Процент ROS и мертвых клеток составлял порядка 0%, 0%, 0%, 10%, 70% и 100% в дозах УФ-С: неэкспонированный контроль, 1 J/m2,100 J/m2, 1000 J/m2 и 10 000 J/m2, соответственно(рисунок 2).
Рисунок 1: Композитные изображения живых клеток первичных клеток поверхности мыши, подвергающихся воздействию различных доз УФ-С (Unexposed control, 1, 100, 1000, 10 000 J/m2). Эти изображения были захвачены под различными фильтрами: яркое поле (для клеточной морфологии), синий (Hoechst ядерного пятна), зеленый (ROS поколения) и красный (пропидий йодид окрашенных мертвых клеток). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Бар графики, показывающие результаты количественной оценки, полученные после расчета процент генерации ROS и процент мертвых клеток при воздействии первичных клеток глазной поверхности мыши в различных дозах УФ-С излучения. X-ось представляет дозы UV-C, в то время как Y-оси представляет процент клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Компонент | Объем |
| 10% Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, содержащая DMEM | 9790 л |
| Акционерное решение DCFDA | 5 зл |
| Hoechst 33342 фондовый раствор | 5 зл |
| Раствор запасов Propidium iodide | 200 зл. |
Таблица 1: Реагенты, необходимые для подготовки окрашивающего раствора.
| Проблема | Вероятные причины | Устранение неполадок | Комментарии |
| Нет или очень мало ROS или PI положительные клетки окрашены, когда клетки лечились с высокой до самой высокой дозы УФ | i. Использование старого окрашивающего раствора. | i. Используйте свежеприготовленный окрашивающий раствор. | i. Ранее подготовленный окрашивающий раствор приводит к неправильному окрашиванию клеток. |
| ii. Overconfluent культуры блюдо в результате спасти повреждения UVC клетками. | ii. Плита только 0,2 миллиона клеток в каждой 35 мм ячейки культуры блюдо и никогда не позволяют клеткам расти более 12 ч, прежде чем подвергать их UVC дозы. | ii. Overconfluent клетки могут спасти повреждения UVC, и, следовательно, нет или мало ROS и PI положительные клетки будут визуализированы. |
Таблица 2: Устранение неполадок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод окрашивания DCFDA позволяет визуализировать ROS в первичных глазных живых клетках мыши, обработанных ультрафиолетовым излучением. Преимущество этого метода окрашивания является то, что он также позволяет исследователям изучить непосредственное воздействие УФ-С (3 часа после воздействия УФ-т) на живые клетки и их одновременное перечисление в процентах от ROS положительные, а также, мертвые клетки. Кроме того, поскольку метод окрашивания используется на живых клетках, клетки могут быть дополнительно инкубированы в тех же носителях в течение более длительного времени (несколько дней) для изучения отсроченного воздействия УФ-С излучения. Таким образом, этот метод окрашивания позволяет визуализировать генерацию ROS (зеленый) и одновременно различать живые, апоптотические и мертвые популяции клеток в живых клетках под перевернутым флуоресцентным микроскопом. Однако при определенных обстоятельствах, несмотря на ожидание получения положительных и Pi положительных ячеек, визуализация может потерпеть неудачу. Для таких случаев предлагается устранение неполадок(таблица 2).
Этот протокол должен быть выполнен точно, чтобы получить оптимальные результаты. Оптимальные результаты указывают на корреляцию зеленого флуоресцентного сигнала, испускаемого/ROS, генерируемого как точное считывание специфической дозы УФ-С, индуцированной повреждения ДНК. Другими словами, для выполнения этого шага объем носителей, находящихся в контакте с клетками во время воздействия УФ-С, не должен быть настолько, чтобы доза УФ-С не могла вызвать требуемый ущерб. Таким образом, важно сохранить минимальный объем носителей, скажем, 500 л на 35 мм блюдо, как раз достаточно, чтобы покрыть клетки во время воздействия УФ-С на всех указанных дозах. Во-вторых, объем носителей не должен быть настолько маленьким, чтобы клетки высыхают во время воздействия УФ-С. Наконец, сразу же после воздействия клеток на УФ-С, клетки должны быть пополнены свежими носителями оптимального объема (скажем, 2 мл), чтобы избежать каких-либо повреждений и генерации ROS.
Одним из ограничений этого метода является тип Сгенерированного ROS. Другие дополнительные анализы должны быть выполнены для обнаружения конкретного типа ROS в ответ на диапазоны доз УФ-С. Такие ассиоры включают оценку внутриклеточного гидроксила-радикала (ЗЗ),внутриклеточных супероксидных радикалов, внутриклеточных реактивных видов азота, митохондриальных гидроксиловадных радикалов, митохондриальных супероксидов и перекиси водорода в живых клетках, использующих коммерчески доступные комплекты. Еще одним ограничением этого метода является обнаруживаемость процентного поколения ROS в дозах ниже 10 Дж/м2 и выше 10 000 Дж/м2. По-видимому, никакие положительные клетки ROS не были видимы когда главным образом клетки/стволовые клетки от поверхности мыши ocular подверглись действию к дозам UV-C меньш чем 10 J/m2. Напротив, 100% ПОЛОЖИТЕЛЬНЫе клетки ROS были видны, когда клетки подвергались воздействию УФ-С дозы выше 10000 J/m2. Таким образом, другие анализы (например, анализ ферментов, измерение окислительных маркеров стресса, таких как 8-гидроксидеоксигуанозин (8-OHdG) (маркер повреждения ДНК), и западный анализ помарка белков повреждения ДНК в различных дозах) может быть полезным, чтобы понять степень / тип клеточных / молекулярных повреждений на различных уровнях. Третьим ограничением этого метода является корреляция доз УФ-С с ROS, генерируемых различными типами клеток. Это должно быть проверено.
В настоящее время комплекты DCFDA доступны на коммерческой стадии для обнаружения ROS либо с помощью микроскопии или цитометрии потока10,11. Однако такие наборы являются дорогостоящими и не могут быть предоставлены исследовательскими лабораториями в странах с ограниченными ресурсами. Таким образом, этот протокол очень полезен с эффективностью сродни коммерчески проданных методов. Во-вторых, мы включили пропидий йодид мертвого пятна клеток вместе с DCFDA / ROS поколения. Таким образом, мониторинг живых клеток положительных и мертвых клеток ROS может осуществляться одновременно с помощью этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы получили финансовую поддержку от Bio-Rad Laboratories India Private Limited за спонсорство статьи.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку инфраструктурных объектов исследовательского центра «Енепоя» (Университет).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J.
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
