Summary
تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم صلاحية دروسوفيلا في كل مرحلة من مراحل النمو، من الجنين إلى الكبار. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد ومقارنة صلاحية مختلف الأنماط الجينية أو ظروف النمو.
Abstract
في دروسوفيلا melanogaster، وتستخدم اختبارات الجدوى لتحديد اللياقة البدنية لبعض الخلفيات الوراثية. ويمكن أن تؤدي الاختلافات الأليلية إلى فقدان جزئي أو كامل للقدرة على البقاء في مراحل مختلفة من التنمية. وقد طور مختبرنا طريقة لتقييم الجدوى في دروسوفيلا من الجنين إلى البالغين الناضجين بالكامل. تعتمد هذه الطريقة على تحديد عدد الذرية الموجودة في مراحل مختلفة أثناء النمو، بدءاً من الأجنة المفقسة. بعد أن يتم تحديد الأجنة كمياً، يتم حساب مراحل إضافية، بما في ذلك L1/L2، والجرو، والبالغين البالغين. بعد فحص جميع المراحل، يتم استخدام تحليل إحصائي مثل اختبار تشي سكوير لتحديد ما إذا كان هناك فرق كبير بين العدد الأولي للذرية (الأجنة المفقسة) والمراحل اللاحقة التي بلغت ذروتها في عدد البالغين الملاحظ، وبالتالي رفض أو قبول الفرضية الفارغة (أن عدد الأجنة المفقسة سيكون مساويا ً لعدد اليرقات والجراء والبالغين المسجلين طوال مراحل النمو). الميزة الأساسية لهذا الاختبار هو بساطته ودقته، كما أنه لا يتطلب شطف الجنين لنقلها إلى قارورة الغذاء، وتجنب الخسائر الناجمة عن الأخطاء التقنية. وعلى الرغم من أن البروتوكول الوارد وصفه هنا لا يفحص مباشرة يرقات L2/L3، يمكن إضافة خطوات إضافية لمراعاة هذه اليرقات. مقارنة عدد الأجنة المفقسة، L1، الجراء، والبالغين يمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كانت قابلة البقاء للخطر خلال مراحل L2/L3 لمزيد من الدراسات (استخدام المواد الغذائية الملونة يساعد في التعرف البصري لليرقات). بشكل عام، يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين Drosophila والمربين تحديد متى يتم اختراق القدرة على البقاء خلال دورة حياة ذبابة. التقييم الروتيني للمخزونات باستخدام هذا الفحص يمكن أن يمنع تراكم الطفرات الثانوية التي قد تؤثر على النمط الظاهري للمتحولة المعزولة أصلا، وخاصة إذا كانت الطفرات الأصلية تؤثر على اللياقة البدنية. لهذا السبب، يحتفظ مختبرنا بنسخ متعددة من كل من الأليلات Dm ime4 لدينا ويتحقق بشكل روتيني من نقاء كل مخزون مع هذه الطريقة بالإضافة إلى التحليلات الجزيئية الأخرى.
Introduction
يتأثر العمر بالعوامل الوراثية وغير الوراثية. في ظروف نمو المختبر القياسية في درجة حرارة الغرفة، لاحظ مختبرنا تباينًا كبيرًا في اللياقة البدنية والقدرة على البقاء بين مختلف الأليلDm ime4 المزروعة في ظل ظروف متطابقة (الشكل1 والأرقام التكميلية). وكثيرا ً ما يتم إجراء دراسات الجدوى للتحقيق في آثار تركيبة معينة من الأليل أو حالة نمو في الدراسات الوراثية السكانية1و2و3 و4. ومع ذلك، من الصعب العثور على تحليلات مفصلة للصلاحية داخل مجموعة غير متكاملة من الطفرات في المؤلفات العلمية. وعادة ما يسمى أليل "غير ضروري" إذا وجد الباحث عدد قليل من الأفراد homozygous لذلك أليل داخل قارورة الغذاء الذي يضم المخزون المتوازن5،6. ومع ذلك، لا يتم الإبلاغ عن تحليلات دقيقة تشي مربع لتقييم ما إذا كانت هذه homozygotes تنشأ في نسب Mendelian المتوقعة5،6. درجة الحرارة الأكثر تساهلا لأي مخزون Drosophila هو درجة حرارة الغرفة (22-23 درجة مئوية) ومع المواد الغذائية المناسبة، ودورة حياة الذباب البرية من نوع يستغرق ما يقرب من اثني عشر يوما لإكمال7،8. كما أن مدة كل مرحلة من مراحل النمو من البرية من نوع Drosophila هو معروف7،8، ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة في هذا التقرير لدراسة ما إذا كان سلالة Drosophila قيد الدراسة يصلح في كل مرحلة بالمقارنة مع السيطرة المناسبة للخلفية الوراثية اختبارها. وعلى النقيض من الدراسات التي تركزعلى جانب محدد واحد من جوانب التنمية 9، يوفر هذا البروتوكول طريقة عملية لتقييم الجدوى في مختلف المراحل الإنمائية.
في مختبرنا، يتم استخدام هذا البروتوكول لتقييم جدوى الأسهم التي تعاني من نقص لمحفز دروسوفيلا من Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 هو جين أساسي10 الذي يشفر ميثيل ترانسفيراز RNA مع أدوار حاسمة في استقلاب الحمض النووي الريبي في دروسوفيلا وغيرها من الكائنات متعددة الخلايا5،6،10، 11 , 12 , 13 , 14 سنة . لتقييم بسرعة الأليلات الجديدة من Dm ime4 ولدت عن طريق كريسبر / Cas9 (الأرقامالتكميلية) ، تم إجراء اختبار الجدوى نقطة النهاية التي تحسب فقط ذرية الكبار المنتجة داخل قارورة من الأسهم المتوازنة (الشكل 1). وقد تم وصف بعض المخزونات المستخدمة في تقارير ألمانيا ime4 السابقة5و6. ظهرت المتحولين المتجانسين على مستويات شبه مندليان، كما هو محدد من قبل تحليلات تشي سكوير (الشكل1 والموادالتكميلية). لتقييم ما إذا كانت هذه الأرقام أقل من المتوقع كانت بسبب عدد أقل من الأجنة التي يتم زرعها، أو عدد أقل من الأجنة المفقسة، أو فقدان القدرة على البقاء في L1/L2 أو الجراء، قمنا بتوسيع نطاق التتبع ليشمل العد في كل مرحلة من هذه المراحل التنموية (الشكل2، الشكل3، الشكل4، الشكل5، الشكل6، الشكل7، الشكل8، والشكل 9).
هنا، ونحن نصف الطريقة باستخدام البرية من نوع الذباب (OreR). لاختبار هذه الطريقة تجريبيا للاستخدام مع الخلفيات الوراثية الأخرى أو الأنواع Drosophila، نوصي باستخدام OreR كمرجع وضبط النقاط الزمنية وفقا للكائن الحي التجريبي. كما تم تقييم البروتوكول لتقييم جدوى الذرية الناتجة عن عبور الإناث من النوع البري البكر مع الذكور من مخزون متحولة heterozygous Dm ime4 5و6 (الشكل4).
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام
- إعداد أجار العنب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدولالمواد) وتصب في طبق بيتري 35 ملم إلى نصف كامل (الشكل5). السماح لتقوية لمدة 1 ساعة تقريبا. بعد أن يترسخ أجار العنب، استخدمه أو خزنه على الفور عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- بلطف جعل الخدوش عبر لوحة أجار باستخدام سكين بلاستيكية صغيرة (الذباب ترغب في وضع على أسطحمتفاوتة) ترك منتصف لوحة دون خدوش (الشكل 5). وضع كمية صغيرة من عجينة الخميرة (مصنوعة طازجة؛ انظر جدولالمواد) في مركز لوحة (الشكل5).
2. مجموعة الأجنة قفص صغير إعداد
- إعداد الصليب باستخدام اثنين من الإناث البكر وشاب واحد داخل قفص جمع الجنين يحتوي علىلوحة أجار العنب تكملها معجون الخميرة (الشكل 5).
- بعد 24 ساعة، فحص أقفاص للأجنة وضعت دون فتح القفص من خلال النظر في الجزء السفلي من لوحة أجار. إذا تم وضع الأجنة، قم بإزالة لوحة أجار من الغرفة ووضعها داخل غرفة رطبة للمراقبة المجهرية (الشكل6). إذا تم تسجيل عدة أيام من زرع (على سبيل المثال، الخصوبة / اختبارات طول العمر)، والحفاظ على الآباء تربية واستبدال لوحة واحدة جديدة أعدت كما هو موضح. يمكن القيام بمجموعات مبكرة من أقل من 24 ساعة ولكن، عند استخدام الإناث العذراء، يجب أن ندرك أنها لن تكمن حتى 48 ساعة بعد الخروج من حالة بوبا.
- تغطية لوحة أجار التي تحتوي على الأجنة مع غطاء طبق بيتريلتجنب الجفاف ووضعها على الفور داخل غرفة رطبة (الشكل 7). مراقبة تحت المجهر تشريح وتسجيل الأجنة فقس وL1. استبدال الغطاء وتخزينه في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة حتىجميع الأجنة قد فقست وتطورت إلى يرقات L1 (الشكل 6).
3. عد الأجنة واليرقات
- بعد 48 ساعة، لاحظ لوحات تحت المجهر تشريح وتسجيل الأرقام مرة واحدة مشاركة قبل نقل قرص أجار إلى قارورة الغذاء. وينبغي أن تصبح الأجنة المخصبة/القابلة للحياة L1 بحلول ذلك الوقت. فترات حضانة أطول قبل نقل ممكنة ولكن يجب أن تدرك أن لوحات قد تبدأ في فقدان الرطوبة وأجار قد الكراك المساس نقل نظيفة إلى قارورة الغذاء (الشكل7). لضمان بقاء الأطباق رطبة ولا تتعرض قابلية الجنين للخطر أثناء العد، تجنب استخدام ضوء أوزة مباشرة على سطح أجار (الشكل7E يظهر مسافة مناسبة).
- بعد العد، وتغطية لوحة وتخزينها في غرفة رطبة حتى على استعداد لنقل. نتائج قياسية.
4. نقل قرص أجار العنب إلى قارورة الغذاء لرصد الجدوى أثناء التنمية
- بمجرد تسجيل الأرقام (الأجنة فقست / L1 / L2)، واستخدام ملعقة لنقل بعناية قرص أجار العنب إلى قارورة كبيرة بما يكفي لاستيعاب قرص 35 ملم تحتوي على وسائل الإعلام الغذائية Drosophila أعدت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر قائمة الكواشف). وضع قرص أجار العنب L1 الجانب إلىأسفل على الطعام (الشكل 7). بعد نقل قرص أجار مع اليرقات إلى قارورة الطعام، فحص بعناية طبق بيتري فارغة عن أي يرقات تركت وراءها (الشكل7E).
- وضع جدول زمني لفحص قارورة الطعام يوميا، في نفس الوقت تقريبا كل يوم، لضمان ملاحظة يرقات L2/L3تشق طريقها إلى الغذاء في القارورة (الشكل 8).
- سجل عدد من الجراء والكبار دروسوفيلا (الشكل9). استمر في العد حتى لا يلاحظ المزيد من البالغين وتجنب عد الجيل التالي (لا تحسب بعد 9 أيام بعد مراقبة البالغين الأوائل).
- مراقبة وتسجيل النتائج. ضبط الإطار الزمني لجمع الأجنة، عد، وتسجيل وفقا لذلك إلى الأسهم متحولة المستخدمة.
- إجراء تحليل مربع تشي. الفرضية الفارغة تفترض قابلية البقاء 100٪ بحيث يكون عدد البالغين يساوي عدد الأجنة فقس وL1 المسجلة أصلا ونقلها إلى قارورة الغذاء
Representative Results
هذه الطريقة بدقة وreproducibly يسمح للمرء لقياس الجدوى من الأجنة للبالغين الناشئة عندما يقترن تحليلات تشي مربع.
في الدراسات الأولية، بعد عد الأجنة واليرقات، تم وضع أجار العنب داخل القارورة تستقيم على جانب القارورة. لسوء الحظ، عندما وضعت أجار على جانب القارورة العديد من الأجنة واليرقات لم تنضج للبالغين. وكان هذا على الأرجح بسبب قرص أجار العنب تجفيف (الشكل 3). هذا التنسيب أدخلت متغير البيئية (ترطيب قرص أجار) التي يمكن أن تشوش النتائج. فقد ما يقرب من 39٪ من ذرية بين الأجنة للبالغين كما ظهرت فقط 61٪ من البالغين. حدثت أكبر الخسائر بين يرقات L1 (التي تحسب على سطح لوحات أجار العنب) والجرو (التي تحسب على جدران قارورة الطعام) التهم. ومع ذلك، عندما وضعت أجار العنب تواجه أسفل داخل القارورة في اتصال مباشر مع سطحالغذاء، فقدت أقل من 6٪ من ذرية (الشكل 2). وظلت أجار رطبة حيث ظل قرص أجار العنب بأكمله على اتصال مع رطوبة الطعام الفوري داخل القارورة (الشكل 7، الشكل 8). وتشير هذه النتائج إلى أن وضع أجار داخل القارورة مهم للحصول على بيانات موثوقة وتقليل مساهمة المتغيرات البيئية. تم جمع المزيد من البيانات لدعم فعالية هذه الطريقة عن طريق مقارنة الذرية البرية المستخدمة في التحقق من صحة الأسلوب الأولي والذرية التي تنتجها عبور الإناث من النوع البري ة العذراء إلى الذكور من مخزون متحولة Dm ime4 متوازن ( الشكل التكميلي2، ime4Δnull/TM3sb). حوالي 91٪ من ذرية نضجت إلى مرحلة البلوغ مقارنة مع 94٪ من ذرية من النمط البري (الشكل4). ولم يكن هذا الاختلاف ذا دلالة إحصائية.
[هوموزغوس] [دم] [إم4] متحولة ذكران5 كان أيضا استعملت أن يزوّد تصديق بعيد من الأسلوب. ومع ذلك، فإن المتحولين المتجانسين كانوا مرضى جدا ً بحيث لا يمكن أن يتكاثروا وماتوا قبل إيداع الأجنة. ولذلك، فإن أحد القيود على التجربة هو أن الذكور بحاجة إلى أن تكون صحية بما فيه الكفاية للتكاثر لتوليد مجموعة من الأجنة بدءا لتتبع.
الشكل 1 الأسهم المتحولة Dm ime4 تظهر عند مستويات شبه مندليان. يتم عرض المخزونات التي تم فيها تغيير أجزاء من المجال الحفاز أو مجال ملزم Ado-Met (راجع الشكل التكميلي 1 للحصول على التفاصيل). وكان بعض الأسهم أجزاء من أي من المجالين استبدال علاء (alanine-المسح ية الطفرات)، في حين أن الأسهم الأخرى إما أو كلا المجالين حذف. وتتمثل نسبة العدد الملاحظ من المتجانسات إلى الأرقام المتوقعة في النسب المئوية (مقارنة بضوابط الأشقاء غير المتجانسة، يرجى الإشارة إلى الشكل التكميلي 3 من أجل مخطط الفرز وتحليل مربع تشي). وقد أجريت تحليلات مربعتشي لتحديد ما إذا كان الفرق بين الملاحظة والمتوقع ة كبيراً إحصائياً وليس بسبب الصدفة وحدها (p-values < 0.01). تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي للمتوسط (الحد الأدنى من ثلاث تجارب لكل تقاطع المشار إليه). يمكن العثور على جدول بيانات مع جميع البيانات في الموادالتكميلية . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 موقف أجار داخل القارورة يمكن أن يقدم متغيرات بيئية غير مقصودة. الرسم البياني لعدد الأفراد في مراحل مختلفة من التنمية تحسب من العنب أجار القرص الجنين الجانب إلى أسفل في قارورة الغذاء أو أجار على جانب قارورة الغذاء. وضع القرص أجار الجنين إلى أسفل في القارورة أدى إلى 94٪ (SD ± 0.02) من الأجنة الأولية البقاء على قيد الحياة حتى مرحلة البلوغ. وضع أجار على جانب قارورة الغذاء أدى فقط 61٪ (SD ± 0.07) من الأجنة التي تم عدها أصلا تصل إلى مرحلة البلوغ. يمكن العثور على جدول بيانات مع جميع البيانات في الموادالتكميلية . يتم تعيين الأرقام المتوقعة في كل مرحلة كما يتم تعيين العدد الأولي من الأجنة / L1 محسوبة على قرص أجار العنب قبل نقلها إلى قارورة الغذاء (فرضية فارغة: 100٪ من الأجنة فقست تتطور). والأرقام الملاحظة هي العدد الفعلي للأفراد الذين تم عدهم لمرحلة التطور المشار إليها. وهكذا، يتم مقارنة كل مرحلة إلى العدد الأولي من الأجنة فقس تُعد على لوحة أجار العنب. وأُجريت تحليلات لمربع تشي لتحديد ما إذا كان الفرق بين الملاحظة والمتوقع كبيراً إحصائياً وليس بسبب الصدفة وحدها باستخدام عتبة القيمة p البالغة 0.05. كان الفرق كبيرا بالنسبة للأجنة المزروعة مع أجار على جانب قارورة الغذاء، ولكن ليس بالنسبة لتلك التي نمت في جانب الجنين القرص إلى أسفل. تمثل أشرطة الأخطاء خطأ قياسي (الحد الأدنى من ثلاث تجارب لكل تقاطع المشار إليه). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 يمكن وضع الرسوم المتحركة التي تظهر طريقتين من أقراص أجار العنب التي تحمل الأجنة / L1s داخل قارورة الطعام. كان هناك فرق كبير بين العدد الإجمالي للأجنة وذرية البالغين على أساس موقف أجار في قارورة الغذاء. الفرق ينبع من متغير بيئي (ترطيب) الناجمة عن الفرق في وضع القرص داخل قارورة الغذاء: هناك فرق كبير إحصائيا بين الأرقام المتوقعة والملاحظة في اليرقات والجرو التهم عندما أجار تم وضع القرص على جانب القارورة مقابل عدم وجود فرق كبير في الأرقام المتوقعة مقابل الأرقام الملاحظة عندما كان قرص أجار على اتصال مع الطعام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 الرسم البياني الذي يبين عدد الأفراد في مراحل مختلفة من التنمية من الذكور من النوع البري مقابل الذكور من مخزون متوازن من Dm ime4. عبر الذكور المتوازنون إلى الإناث العذراء من النوع البري كما هو موضح في 2.1. تم نقل أجار إلى جانب الجنين إلى قوارير غذائية. وكان متوسط نسبة البالغين الناشئين من الأجنة الأصلية التي تم عدها في أقراص أجار العنب من النوع البري X البرية 94٪، SD ± 0.02، في حين أن نسبة Dm ime4 متحولة / + X البرية من نوع 91٪، SD ± 0.01. أُجري تحليل إحصائي على النحو المبين في الشكل2؛ ولم تكن الاختلافات كبيرة بالنسبة لأي من المجموعتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 الإعداد التجريبي: (أ) جمع الأجنة أقفاص صغيرة والعنب أجار البسيطة بيتري الأطباق. يتم وضع لوحات داخل غرفة رطبة (طبق بيتري القياسية مع قرص ورقة ماصة مشبعة بالماء) لمنع الجفاف. تم وضع كمية صغيرة من عجينة الخميرة في وسط كل طبق من العنب أجار. (ب) فصل غطاء حامل لوحة جمع الجنين (الأحمر) ووضع لوحة أعدت، جانب الخميرة حتى. (ج) نقل الصليب إلى قفص الجنين ووضع على الفور غطاء طبق بيتري لعقد الذباب داخل. (D) إزالة الغطاء بسرعة والوجه قفص الجنين حتى فتح الاتصالات العنب أجار لوحة. حضانة لمدة 24-48 ساعة، وتفتيش يوميا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 تطوير الأجنة على لوحات العنب أجار. (أ) يتم حساب الأجنة من النوع البري المودعة على أطباق العنب أجار ميني بيتري تحت المجهر تشريح. الحفاظ على لوحات داخل غرفة رطبة عند عدم تصور وتجنب الضوء المباشر لمنع الجفاف. (ب) يتم الاحتفاظ بألواح العنب في غرفة رطبة ويتم تسجيل الأجنة من النوع البري المفقس. تُظهر هذه الصورة ثلاث يرقات من النوع البري L1 تطورت من الأجنة المعروضة في A. (ج) مثال على الأعداد المسجلة للأجنة (اليوم الأول) ويرقات L1 (اليوم الثاني) للصفيحتين المبينتين في الشكل5. يتم تحديد "العدد المتوقع" للفرضية الفارغة من خلال عدد الأجنة التي فقست وأصبحت يرقات L1 في وقت نقلها إلى قارورة الغذاء (الجدول أدناه). بالنسبة للذباب من النوع البري، تفقس جميع الأجنة تقريبًا وتتطور إلى يرقات L1. قد لا يكون هذا هو الحال بالنسبة للخلفيات الوراثية الأخرى ويستخدم هذا الأسلوب لتحديد هذه الاختلافات في الجدوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7 نقل اليرقات. (أ) بعد تسجيل التهم L1، تتم إزالة أقراص العنب أجار بعناية من طبق بيتري باستخدام ملعقة نظيفة (مسح الإيثانول) (B،C)ونقل L1 جنبا إلى أسفل للاتصال الطعام في قارورة كما هو مبين في D. (E) يتم فحص طبق بيتري الفارغ بعناية للكشف عن أي يرقات تركت وراءها. إذا كانت اليرقات التي تركت وراءها على قيد الحياة ويمكننقلها إلى قارورة الطعام، القيام بذلك بعناية وعلى الفور (F). إذا كانت اليرقات التي تركت وراءها ميتة أو لا يمكن نقلها، سجل هذه الحقيقة لتصحيح "العدد المتوقع" للحسابات اللاحقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8 L2 اليرقات شق طريقها إلىالطعام. انظر الشقوق والأخاديد بين قرص العنب أجار والطعام الأزرق. إعداد جدول لمراقبة قارورة يوميا، ويفضل في نفس الوقت من اليوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9 ظهور الكبار. (أ) يرقات L3 تجعل طريقها للخروج من الطعام لتصبح الجراء. (ب) البالغين تبدأ في الظهور في اليوم 11. إعداد جدول لمراقبة قارورة يوميا، ويفضل في نفس الوقت من اليوم وتسجيل ملاحظاتك بعناية. التوقف عن العد عندما ظهرت جميع الجراء (عد حالات الجراء فارغة) وتجنب عد الجيل القادم من الذباب عن طريق وقف التجربة في اليوم 15 وعد الجراء الميتة إن وجدت (أسود / المجفف ة). المسوخ مع دورات الحياة أطول قد تحتاج إلى فترات أطول من الزمن، والتي تحتاج إلى تحديد تجريبيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الأرقام التكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.
المواد التكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.
Discussion
وباختصار، توفر هذه الطريقة تقييما دقيقا وبسيطا للصلاحية في دروسوفيلا. يستغرق البروتوكول بأكمله حوالي 14 يومًا لإكماله. ولا يتطلب هذا الإجراء مهارات تقنية من الخبراء؛ ومع ذلك، فإن التوقيت المناسب، وجدول زمني للملاحظات اليومية، ونقل أجار بعناية أمر مهم للدقة والتكرار.
بالإضافة إلى وضع قرص العنب أجار جانب الجنين أسفل في قارورة الغذاء، خطوة حاسمة أخرى في الإجراء هو نقل قرص أجار إلى قارورة الغذاء في موعد لا يتجاوز 48 ساعة بعد إزالة لوحة أجار العنب من أقفاص جمع الجنين مصغرة. نقل أجار بعد 48 ساعة أدى إلى فقدان الجنين واليرقات، على الأرجح بسبب الجفاف من قرص أجار. لحساب التحولات L2/L3، لوحة يحتاج إلى احتضان لمدة 72 ساعة. إذا كانت هذه المرحلة حاسمة، يجب سكب لوحات أجار العنب أكثر سمكا ويجب استخدام غرفة رطبة لمنع الجفاف. وقد أقيمت الصلبان في أقفاص لجمع الأجنة التي تستوعب لوحات 35 ملم؛ ومع ذلك، يمكن تنفيذ هذا الإجراء باستخدام أقفاص جمع الأجنة أكبر أيضا، مثل واحد الذي يستوعب 60 ملم أو 100 مم لوحات بيتري. ثم يجب أن تكون زجاجات الطعام كبيرة بما يكفي لاستيعاب تلك الأحجام.
هناك خطوات يمكن إضافتها إلى هذا البروتوكول. وكما ذُكر أعلاه، فإن التحولات L2/L3 تشكل تحدياً لتحديد كمي على الصفائح بسبب الوقت المطلوب والجفاف المحتمل للأجار. بالإضافة إلى ذلك، تصبح اليرقات متحركة للغاية على سطح أجار، مما يشكل تحديا لعدها بدقة. وضع لوحات في الثلاجة لمدة 30 دقيقة أو إضافة بضع قطرات من مخدر خفيف (محلول ليدوكائين) على سطح أجار قبل عد L2 /L3 اليرقات يمكن أن تساعد على إبطاء تحركاتها لحسابها بشكل أكثر دقة. تحذير لهذه التعديلات هو أنها يمكن أن تقدم متغيرات (حساسية الباردة، حساسية التخدير) والخلط بين نتائج الصلاحية. حتى من دون هذه الخطوات، وذلك باستخدام المواد الغذائية الملونة، يمكن للباحثين قياس تجول L3s / prepupae لأنها تستقر على جانب قارورة الغذاء لبدء الجرو. وهناك قيد على هذه الطريقة هو أنه يتطلب من البالغين المستخدمة في الصلبان البقاء على قيد الحياة يجري التخدير مع CO2 للنماذج الظاهرية لإعداد الصلبان في أقفاص جمع الأجنة. Dm ime4 homozygous متحولة الذكور لا يتعافى بشكل جيد ويموت بعد ساعات قليلة من الاستيقاظ من العلاج CO 2. ويمكن استكشاف طرق أخرى لشل حركة البالغين للفرز، مثل وضع قارورة في الثلاجة لبضع دقائق ثم نقل القنينات إلى الجليد المسحوق لإبطاء الحركة وفرز بسرعة وكفاءة.
وبصرف النظر عن مقارنة نقاط القوة الاليليك وآثارها على الجدوى، يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص الحساسية أو المقاومة للمركبات الصيدلانية المحددة. خلافا للأساليب الأخرى التي شاشة سمية مركب في ثقافة الخلية15،16،17،18، وتستخدم هذه الطريقة الكائنات الحية بأكملها ، مما يجعل تقييم الآثار التنموية أسهل لتحليلها. وخلاصة القول، باستخدام هذا البروتوكول والتعديلات فيه، سوف تسمح لقياس نقاط القوة الاليليك، فضلا عن آثار العوامل البيئية والمركبات الكيميائية على قدرة Drosophila على البقاء، والخصوبة، والخصوبة، وعمر، ومدة دورة التنمية.
Disclosures
ولا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يتم تمويل عملنا من قبل NIH 1R15GM1131-01 إلى CFH وNIH PA -12-149 إلى CFH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
