Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.
Abstract
תאי גזע האדם בעלי עוצמה מציעים מערכת חזקה כדי לחקור את תפקוד הגנים ואת המודל מוטציות ספציפיות הרלוונטיות למחלה. הדור של שינויים גנטיים heterozygous מדויק מאתגר בשל CRISPR-CAS9 מתווך indel היווצרות ב allele השני. כאן, אנו להדגים פרוטוקול כדי לסייע להתגבר על הקושי הזה באמצעות שתי תבניות תיקון שבו רק אחד מבטא את שינוי הרצף הרצוי, בעוד שתי התבניות מכילות מוטציות שקטות כדי למנוע גזירה מחדש ומבנה indel. מתודולוגיה זו היא היתרון היעיל ביותר עבור הקוד לעריכת גנים באזורים של DNA כדי ליצור שליטה איזוגניים וקווי גזע האדם האנושי ללמוד מחלות אנושיות וביולוגיה. בנוסף, אופטימיזציה של העברת החצייה ומתודולוגיות ההקרנה בוצעו כדי להפחית את העבודה והעלות של ניסוי בעריכת גנים. בסך הכל, הפרוטוקול הזה הוא ישים נרחב לעריכת הגנום רבים באמצעות המודל האנושי pluriפוטנטי.
Introduction
האדם תאים גזע עובריים (hESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) הם כלים יקרי ערך למידול מחלות האדם בשל יכולתם להתחדשות, תוך שמירה על היכולת ליצור סוגי תאים של שונות לושלות1,2 ,3,4. מודלים אלה לפתוח את האפשרות לחקור פונקציה גנטית, ולהבין כיצד מוטציות ספציפיות פנוטיפים קשורים מחלות שונות5,6. עם זאת, כדי להבין כיצד שינוי מסוים מקושר לפנוטיפ מסוים, שימוש בפקד איזוגניים משויך ובקווי תא של מוטציה חשוב לשלוט בשורה לשונות שורה7,8. תמלול activator כמו נוקלאוסיס (TALENs) והנוקלאוסים אצבע אבץ שימשו כדי ליצור הוספה או מחיקה (indels) מוטציות במודלים גנטיים מגוונים, כולל תאים ראשוניים; אבל הנוקלאוסים האלה יכולים להיות מסורבל לשימוש ויקר9,10,11,12,13,14. הגילוי של באשכולות באופן קבוע הכולל מרווחים לחזור קצר palindromic (crispr)-CAS9 נוקלאז יש מהפכה בשדה בשל יעילות היווצרות indel כמעט בכל אזור של הגנום, פשטות השימוש, וצמצום עלות15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , . בן 19
אתגר בשימוש crispr-CAS9 מבוסס הגנום לעריכת הטכנולוגיה כבר הדור או תיקון של מוטציות ספציפיות אלל אחד בלי ליצור מוטציה indel ב אלל השני20. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להתגבר על האתגר הזה על ידי שימוש בשני משתמשים בעלי התקן בודד ומבודד (ssODN) תיקון תבניות כדי להפחית את היווצרות indel ב allele השני. שני ssODNs נועדו להכיל מוטציות שתיקה כדי למנוע חיתוך מחדש על ידי CAS9 nuclease, אבל רק אחד מכיל שינוי של עניין. שיטה זו מגבירה את היעילות של יצירת שינוי גנטי מסוים heterozygous מבלי לגרימת היווצרות indel ב allele השני. באמצעות פרוטוקול זה, הניסויים בעריכת גנים בשישה מיקומים גנומית עצמאית להפגין את המבוא המדויק של שינוי גנומית הרצוי באחד אלל ללא היווצרות indel ב אלל השני ומתרחשת עם יעילות כוללת של ~ 10%. הפרוטוקול המתואר הותאם מ מגווייר ואח '21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב ובנייה של מדריך RNA (gRNA)
הערה: כל gRNA מורכב של 2 60 בסיס זוג (bp) oligונוגראודים, כי הם מוגלים כדי ליצור 100 bp כפול תקוע (ds) oligונואוטייד (איור 1א-ג). ציר הזמן עבור העיצוב gRNA, הדור, ויעילות חיתוך בדיקות הוא כ 2 שבועות (איור 2).
- בחר את אזור ה-DNA של עניין להיות הגנום נערך ולזהות 3-4 23 הרצפים bp להתאים את הפורמט, 5 '-G (N19) ngg-3 '. רצפים אלה צריך להיות ממוקם בתוך 20 bp של אזור הריבית.
הערה: ניתן לבצע את המיקוד במובן או בחוט האנטי-חוש. - הערכת רצפי gRNA עבור יתירות גנומית והסתברות מחוץ ליעד באמצעות משאב כגון CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- שילוב רצף היעד של 20 bp (למעט מוטיב הסמוך פרוטומונט או פאם) לתוך 2 60-מאמר oligונומטר מוצג (רצפים הם 5 ' כדי 3 "ו אדום ירוק הם משלים הפוכה כפי שמוצג באיור 1ג).
- להזמין את ה2 60. לאחר החלת החמצן מתקבלים, להשעות כל אחד לריכוז הסופי של 100 μM ב ddH2O. לעשות מלאי עובד של 10 μm.
- מייצרים את שני החומרים המגנטיים ויוצרים מקטע 100 bp dsDNA באמצעות דנ א פולימראז (טבלת חומרים). לשלב 5 μL של 10 μM קדימה olig, הגאות ו-5 μL של 10 μM הפוכה הפוך בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) שפופרת הרצועה והדגירה ב 95 ° c עבור 5 דקות. קריר התגובה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הגדר את ה-PCR כפי שמתואר בטבלה 1. בצע הגברה של ה-PCR בציקלייר תרמי באמצעות הפרמטרים המתוארים בטבלה 2.
- המחש את מוצרי ה-PCR ב-1.5% (w/v) אתידיום ברומיד (EtBr) agarose ג'ל אלקטרופורםב 80-100 V עבור 40 דקות. בלו את הלהקה bp ה100 (איור 3a), דמיינו על תיבת אור LED, מן הג באמצעות להב תער ולטהר באמצעות ג'ל ערכת חילוץ (רשימת חומרים).
2. עיצוב התחל של ה-PCR להקרנה
- בצע הקרנה של ה-DNA שנערך באמצעות מקדימה והפוכה PCR התחל אשר נועדו במיוחד כדי להגביר את אזור bp 400-500 של הגן של עניין (שולחן 2). השתמש ב-DNA בודד מכל שליטה ipsc קו כדי לאשר אמפליקון נקי בעת ביצוע ההקרנה PCR.
- הדמיה PCR מוצרים על 1.5% (w/v) ג'ל לאחר האלקטרופורזה ב 80-100 V עבור 1 h.
הערה: רצף של שיבוטים שנערכו מבוצע באמצעות פריימר מקונן המתוכנן לאחר אישור של מערכת ההקרנה להגדיר. . הדגימות נשלחות למקור מסחרי לרצף
3. הכנת פלgRNA_cloning וקטורי
- כדי לעבור שיבוט וקטור השיבוט, לקחת שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ולהוסיף 1-5 μg של ה-DNA של וקטור gRNA_cloning יחד עם 4 μL של הגבלה Aflii מאגר אנזים ו 1.5 μl של האנזים aflii הגבלה. העלה את התגובה ל 24 μL של ddH2O. לערבב את התגובה על ידי ליטוף למעלה ולמטה. מודטה ב 37 ° c ללילה (O/N).
- אלקטרופורסה על 1% העלה ג'ל ב 80-100 V עבור 1 h ולהקות בלו (גודל הלהקה צפוי הוא ~ 3519 bp).
- לחלץ ולטהר כמו בשלב 1.6.
4. הרכבת וקטור gRNA
- להגדיר את התגובות ולהרכיב קטעי DNA באמצעות ערכת ההרכבה (טבלה של חומרים) ב 1:5 היחס של aflII מתעכל grna שיבוט וקטור 100 bp ג'ל מטוהרים להוסיף, כפי שמתואר בטבלה 3.
- דגירה את התגובה ב 50 ° c עבור 15 דקות. לדלל את התגובה 1:3 ddH2O ולהשתמש 3 μl לשינוי חיידקי, לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). תאי צלחת על קנאמיסינ ליברות/לוחות אגר.
- לבחור 3-5 מושבות לכל gRNA. האיחסן כל מושבה ב 4 מ ל של LB ולצמוח O/N ב 37 ° c בתוך החממה לרעוד מסלולית.
- לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת הבידוד miniprep, והרצף כל gRNA באמצעות התחל הבאים כדי להבטיח שיבוט מוצלחת: קדימה: GTACAאאאכאגאג; הפוך: TGCCAACTT.
5. הבדיקה gRNA חיתוך יעילות
- צלחת hESCs על לקרינה עובריים מורנה מורטין (MEFs) בצלחת 6-באר, כפי שתוארה בעבר21. כאשר התאים מגיעים ל-70-80% שליטה, הכינו את המיקס הראשי של התרגום המתואר בטבלה 4.
- מערבבים על ידי ליטוף ו-דגירה ב-RT עבור 15 דקות. הוסף dropwise לתאים ו-דגירה ב 37 ° c עבור 48 h (עם שינוי מדיה לאחר 24 שעות).
- הקציר תאים למיון לאחר 48 h.
- הסר (טבלת חומרים) באמצעות דגירה של 3 דקות.
- לשטוף תאים 1x עם hESC בינונית (שולחן 5) ולגרד לתוך hesc בינונית + 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (טבלת חומרים).
- כדוריות התאים ב 300 x g עבור 3 דקות ו-resuspend ב 0.5 ML של hesc בינונית + 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון.
- מסנן לתוך צינור 5 מ ל באמצעות כובע מסננת תאים 35 יקרומטר.
- באמצעות מיון תא המופעל על ידי זריחה (FACS), שער על תאים חיים ולמיין חלבון פלורסנט ירוק (GFP) תאים חיוביים.
- העברת מקסימום של 1.5 x 104 תאים ממוינים ישירות לתוך 10 ס מ2 צלחת מצופה עם 1:3 מטריקס קרוםהמרתף (טבלה של חומרים) ו-Mefs הקרינה ב hesc בינונית (שולחן 5) המכיל Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון.
- שינוי בינוני מדי יום באמצעות hESC בינונית (שולחן 5) ללא Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון ולבחור שיבוטים באופן ידני לאחר 10-15 ימים, כאשר המושבות הם ~ 1 מ"מ קוטר.
- באמצעות פיפטה P200 ומיקרוסקופ, בזהירות לגרד שיבוט יחיד לצייר תאים לתוך הפיפטה.
- לפזר את התאים על ידי ליטוף בעדינות 3-4x ב 96 צלחת היטב בינונית שצוירה עם המושבה.
- מוותר לצינורות הסרט PCR להקרנה ולגלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות. לבחור 20 מושבות לכל grna.
6. הקרנת שיבוט
- בודד ה-DNA על ידי הדגירה כדורי תא ב 20 μL של מאגר פרוטטינואז K (שולחן 5) (1 h ב 55 ° צ' ו 10 דקות ב 95 ° c) ו מערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את סופרנטאנט.
- לבצע הקרנה PCR (סעיף 2) בנפח הכולל של 20 μL באמצעות מיקס הורים כולל תחל שנועד להגביר את האזור של ריבית 5 μL של התקציר הפרוטאינאז K. השתמש ב-DNA גנומית מבודדים מקו התא שהיה גן שנערך כפקד.
- הערכת שינויי גודל של מוצרי PCR לאחר 1 h אלקטרופורזה ב 70-90 V על 2.5% (w/V) agarose ג'ל (איור 3ב, ג). כל הבדל גודל מעיד על המחשוף.
7. הגנום המדויק עריכת בתאי גזע pluriפוטנטי באמצעות ה-DNA בודד סטרנד oligo (ssODNs)
- עיצוב 100 bp ssODNs ממורכז סביב רצף gRNA היעיל ביותר נחוש לקבל את יעילות הגזירה הטובה ביותר.
- למנוע המחשוף מחדש של ODN משולב על ידי החדרת מוטציות שתיקה ברצף gRNA. מוטציה שתיקה אחת ברצף פאם הוא מספיק, אבל אם לא אפשרי, 3-4 מוטציות שתיקה יעבוד.
הערה: כדי להקל על ההקרנה של שיבוטים ממוקד, המבוא של אתר הגבלה בתוך ~ 20 bp של רצף gRNA הוא אידיאלי. - עיצוב ODN אחד עם שינוי הבסיס הרצוי כדי ליצור את מוטציה של ריבית ו-ODN אחד ללא שינוי בסיס (ים).
הערה: שינויים אלה צריכים להיות לא יותר מ-~ 20 bp מהאתר החזוי CRISPR/CAS9, כמו שילוב מחדש יורד באופן משמעותי במרחקים גדולים. - להזמין את שני ssODNs מן הספק של בחירה להשעות מחדש במים לעשות 1 μg/μL מניות. חנות מניות ב-20 ° c.
8. התקנת מעבר החצייה
- כדי לעבור החוצה את ssODN ו-CRISPR-CAS9 ds, הצלחת קו התא היעד בצלחת 6-טוב על הקרינה הוקרן כדי להגיע 70-80% שליטה לאחר הדגירה O/N.
- הגדר את תגובת המשגר כמתואר בטבלה 6. מערבבים את התגובה על ידי ליטוף ו-דגירה עבור 15 דקות ב-RT. הוסף את התערובת תגובת העברה התגובה לתאים.
- לאחר 48 h, הכן את התאים למיון התא כמתואר בסעיף 5.3.
- לבחור מושבות ~ 10 ימים לאחר ציפוי תאים בודדים באמצעות הפיפטה 200 μL. העברת 100 μL של תאים אחד טוב של 24 או 48 צלחת הבאר בעבר מצופה בג ו MEFs לקרינה בינונית hESC עם Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון. השתמש בשאר 100 μL עבור בידוד DNA כמתואר בסעיף 6.
9. בדיקת מוטציות במושבות יחיד
- כדי לבדוק שילוב מוצלח של ssODN, לקחת 5 μL של דנ א מבודדים מכל מושבה כדי לבצע PCR באמצעות ההקרנה התחל המתוכנן בסעיף 2. לטהר את מוצרי ה-PCR (טבלת חומרים) ולהכין את מגבלת העיכול באמצעות אתר האנזים הייחודי שנוצר ב-ssODN.
הערה: עיכול זה כולל גם את מאגר האנזים ההגבלה ואת הריכוז המומלץ של היצרן של אנזים ההגבלה בנפח של 40 μL. - מערבבים את התגובה על ידי ליטוף ו-דגירה בטמפרטורה המומלצת של היצרן עבור 1-3 h.
- המחש את מוצרי ה-PCR המתעכל ב-1.5% (w/v) EtBr agarose ג'ל אלקטרופורםב 80-100 V עבור 40 דקות. אם שילוב מוצלח של ה-ssODN התרחש, רצף מוטציות ספציפיות באמצעות תחל מקונן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דור של gRNAs והקרנה עבור אינדלים
כל gRNA ישוכפל לתוך וקטור פלמיד וביטא באמצעות מקדם U6. האנזים AflII הגבלה משמש כדי לאתר את הפלסמיד (addgene #41824) והוא ממוקם לאחר מקדם U6. הלהקה 100 bp שנוצר לאחר הריפוי של 2 60 bp oligos משוכפל לתוך הביטוי gRNA ביטוי באמצעות הרכבה DNA. לאחר הפקת פלמידים של gRNA, הם מhESCs לתוך הiPSCs ולאחר מכן עם CRISPS-CAS9 GFP בינוני (addgene #44719). התאים GFP + ממוינים לאחר 2 ימים כדי להעשיר עבור תאים מזוהמים מצופה (ראה סעיף 5). לאחר 10-14 ימים, תא יחיד המושבות הנגזרות הם לאסוף ולהשתמש כדי לבודד DNA למסך עבור היווצרות indel שנוצר עבור gRNA כל. הגברה ה-PCR עם התחל של האתר gRNA משמש כדי להמחיש את היווצרות indel באמצעות 2.5% (w/v) agarose ג'ל עם EtBr, electrophoresed ב 70-90 V עבור 1 h.
הדור של 100 bp ssODN כדי להציג מוטציות ספציפיות
שני ssODN אוליגוס מתוכננים סביב gRNA עם חיתוך יעיל ביותר. כל gRNA הוא 100 bp ומכיל מוטציות שתיקה, רצוי ברצף פאם, כדי למנוע גזירהמחדש (איור 4A). מוטציה שקטה ברצף פאם יכול ליצור אתר הגבלה ייחודי, אשר מסייע להקרין שילוב מוצלח לתוך אחד או שניים האללים (איור 4B).
התוצאות משולבות מחדש של ssODN
באמצעות פרוטוקול זה, תדירות המיקוד אירועים עבור שישה גנים שונים באמצעות שתי הגישה ssODN מוצג באיור 5. על ידי בחינת שינוי גנומי באתר gRNA בשני האללים, תוצאות שונות היו צפויים כולל שילוב מחדש של wildtype (WT) ssODN, המוטציה ssODN ו-indel היווצרות. שיבוטים שבו רק אלל אחד עבר שילוב מחדש, התוצאה השכיחה ביותר היתה היווצרות indel ב אלל השני (10-42%). המשובטים כי היה שילוב של ssodns בשתי אללים הובילו שלוש תוצאות שונות: 1) שילוב של WT ssodns בשני אללים (0-8%), 2) שילוב של מוטציה ssodns בשני אללים (0-25%), ו 3) שילוב של שני wt ו מוטציה ssodns WT (8-21%).
איור 1: סקירה של הדור gRNA. (א) באזור העניין, עיצוב ארבע grnas המסתיים GG כי הם לא יותר מ 20 bp בנפרד. (ב) כל grna של 23 bp יש רצף פם של ngg בסוף 3. (ג) 60 התחל bp לחץ מורכב רצף של 40 bp משלימה את השדרה grna פלבאמצע ואת 20 הרצף grna bp ללא רצף פאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציר הזמן של פרוטוקול עבור יצירת והקרנת שיבוט של gRNA. ציר הזמן עבור הדור של gRNA ושיבוטים ההקרנה מוצג. תכנון ושיבוט של gRNA ביטוי פלמידים לוקח בערך שבוע אחד. כ 48 שעות לאחר הPSCs האנושי, GFP + תאים ממוינים ומצופה הגבלת דילול. המושבות צריך להיות גלוי בין 7-10 ימים ובערך ביום 20, שיבוטים ניתן לבחור עבור הקרנה, התרחבות, ואישור רצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: gRNA מבחן לחיתוך יעילות. (א) עבור grna בנייה, הלהקה 100 bp הוא מגורש מ 1.5% agarose ג'ל. (ב) לאחר מעבר התא, ואלידציה של חיתוך grna הוא דמיינו באמצעות 2.5% agarose ג'ל. מוצר 180 bp PCR משמש כדי לבדוק היווצרות indel שבו שליטה נימולים שיבוטים שונים מנותח עבור משמרות הלהקה מעיד על היווצרות indel. (ג) grnas שונים עשויים להיות שונים יעילות חיתוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדור והקרנת המוטציות באמצעות שני ssODNs. (א) כדי להימנע CRISPR-CAS9 re-חיתוך של האללים הערוכה, רצף פאם ניתן לשנות באמצעות G כדי מוטציה שקט. שינוי זה מוסיף אתר הגבלה ייחודי EcoRI שניתן להשתמש בו להקרנה. בנוסף למוטציה שקטה זו, מוטציה ssODN מכיל את שינוי הבסיס הרצוי. (ב) הקרנה עבור oligb מחדש באמצעות הגבלות ecori הגבלה האנזים יכול לגרום לשלוש תוצאות אפשריות: אין חיתוך מיוצג על ידי הלהקה WT ב ~ 650 bp, שילוב מחדש ב אלל אחד מיוצג על ידי להקה נימולים של 650 bp ושני להקות קטנות יותר או הכנסה לשני האללים המיוצגות על-ידי להקות קטנות בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יעילות שילוב ssODN ותוצאות. יעילות האינטגרציה ותוצאות הגישה לשתי הדרכים נקבעו על ידי ניתוח שישה גנים שונים. אם רק אחד ssODN משולבים, היווצרות indel זוהה בדרך כלל ב allele השני. אם שני ssODNs משולבים, שלוש תוצאות אפשריות זוהו, כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ריאגנט | אמצעי אחסון (μL) |
| dNTPs (10 ממ) | 0.4 |
| טקיו פולימראז | 0.2 |
| מאגר PCR | 4.0 |
| האוליגוס (10 μM) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
שולחן 1: gRNA שיבוט תנאים PCR.
| תוכנית PCR | |
| . צעד ראשון | 98 ° c עבור 30 ס מ |
| . צעד 2 | 98 ° c עבור 10 ס מ |
| . צעד שלישי | 55 ° c עבור 20 ס מ |
| . צעד 4 | 72 ° c עבור 30 ס מ |
| . צעד 5 | חזור על שלבים 2-4 עבור 30 מחזורים |
| מצעד 6 | 72 ° c עבור 5 דקות |
| שלב 7 | המתן ב -4 מעלות צלזיוס |
שולחן 2: פרמטרים של אופני PCR.
| ריאגנט | אמצעי אחסון (μL) |
| וקטור לינגרנה באמצעות AflII (כלומר, 50 ng/μL) | 1.0 |
| 100 bp-DNA (כלומר, 250 ng/μL) | 1.0 |
| שילוב מאסטר 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. |
שולחן 3: gRNA תגובת הרכבה תנאים.
| ריאגנט | כמות |
| Dמאמ/F12 | 50.0 מיקרומטר |
| pCas9_GFP וקטור (הוספה גנטית פלמיד 44719) | 0.5 μg |
| gRNA פלמיד | 0.5 μg |
| מגיב לעירוי שומנים בדם | 3.0 מיקרומטר |
שולחן 4: תערובת של תאים מורים.
| הייסק מדיום | |
| ריאגנט | ריכוז סופי |
| Dמאמ/F12 | |
| החלפת סרום בנוקאאוט (KDR) | 15% (v/v) |
| חומצות אמינו לא חיוניות | 100 μM |
| פירובט | 1 ממ ' |
| גלוטמין | 2 ממ ' |
| β-מרקפיטואתנול | 0.1 ממ ' |
| bFGF האדם (גורם גדילה בסיסי הפיצוץ) | 10 ng/mL |
| 10x פרוטאינאז K מאגר | |
| הHCl של טריס pH: 7.4 | 50 ממ ' |
| החומציות אמוניום גופרתי: 9.3 | 15 ממ ' |
| מיכלהשני | 2.5 ממ ' |
| היחידה 20 | 0.1% (v/v) |
| פרוטטינואז | 100 μg/mL |
שולחן 5: תרבית תאים בינונית ו פרוטטינואז K מאגר העיכול.
| ריאגנט | כמות |
| Dמאמ/F12 | 50.0 מיקרומטר |
| pCas9_GFP וקטור (הוספה גנטית פלמיד 44719) | 0.5 μg |
| gRNA פלמיד | 0.5 μg |
| ssODN (0.5 μg של כל ssODN) | 1.0 μg |
| מגיב לעירוי שומנים בדם | 3.0 מיקרומטר |
שולחן 6: שילוב של מעבר תאים של תא ssODN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, את השימוש CRISPR-CAS9 יחד עם שני ssODN לתקן תבניות כדי לייצר heterozygous מסוימים או שינויים הגנום homozygous מוצג בתאי גזע האדם pluriפוטנטי. שיטה זו הביאה את הדור המצליח של קווי התא isogenic המבטא heterozygous גנומית שינויים עם יעילות קרוב ל 10%. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה עבור ESCs האנושית ו iPSCs גדל על MEFs הקרינה התומכת הצמיחה והישרדות התא לאחר תאים culturing בצפיפות נמוכה לאחר מיון התא. מוות תאים ניתן למזער על ידי שמירה על תאים עם 10 ng/mL bFGF ו-Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון. ייתכן שפרוטוקול זה מותאם למזין מערכות תרבות ללא תשלום, אך ייתכן שיהיה צורך במיטוב נוסף.
יעילות החצייה יכולה להיות משתנה מתא התאים לקו התאים, אבל השימוש 3 μg של DNA ו 3 μL של מגיב שומנים בדרך כלל נתן את התוצאות הטובות ביותר בין 0.5-2% יעילות הזיהום. עם זאת, אם היעילות היא נמוכה יותר, אופטימיזציה של כמות ה-DNA ו מגיב השומנים ניתן לבצע. החוקר יכול גם לבדוק את החומרים האחרים.
היעילות של דור indel יהיה שונה עם gRNAs שונים והוא יכול להיות מושפע על ידי מיקום גנומית. בתוך הרוב המכריע של המקרים, אם ארבעה gRNAs מתוכננים, לפחות אחד ורבים פעמים 2 כדי 3, יעבוד ביעילות. בנוסף, לפני בדיקת gRNAs, אופטימיזציה של אסטרטגיית ה-PCR להמחיש indels עם מוצר נקי DNA להקה אחת חשוב. עבור הקרנה ssODN מבוסס על עריכת הגנום, עדיף להוסיף אתר אנזים הגבלה בעת החדרת מוטציה שקט (עם), אבל אם לא אפשרי, מחיקה של אתר אנזים הגבלה ניתן להשתמש גם. בנוסף, תיקון הומולוגיה בבימויו דורש באופן פעיל תאים אופניים כך צפיפות התא של תרבויות לפני החצייה היא קריטית כדי לשפר את תדירות המשובטים לתיקון באמצעות התבנית ssODN הציג.
חלק ממגבלות פרוטוקול זה קשורים למיקום בגנום שייערך. כאשר אזורי קידוד משתנים, ssODN נושאת מוטציות שתיקה למנוע את Cas9 מחדש חיתוך האתר הערוך מוטציות שתיקה לא לשנות את מוצר החלבון. עם זאת, עריכה באזורים של רגולציה או אי-קידוד באמצעות מתודולוגיה זו הופכת לקשה יותר כאשר מוטציות שקטות אינן אפשריות. אם הבסיס לעריכה הוא חלק מרצף של פם, ניתן לעשות זאת בהצלחה, אך רק homozygous שינויים יכולים להיווצר ביעילות.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי כדי ליצור או לתקן מוטציות heterozygous coding ללא תוספת של indels לא מכוונים ב allele השני. פרוטוקול זה יקל על השימוש בPSCs האנושית כדי ללמוד מגוון רחב של נושאים מביולוגיה התפתחותית למידול של מחלות גנטיות. השימוש בקווים איזוגניים הוא קריטי כדי להגדיר פונקציות של מוטציה קידוד נתון ללא השפעות מייסדים עקב רקעים גנטיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מימון של הלב הלאומי, הריאות, ובדם המכון (NHLBI), המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענקים U01HL099656 (מ. פ. D.L.F.) ו U01HL134696 (למעלה ו D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
