Summary
Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.
Abstract
As células-tronco pluripotentes humanas oferecem um poderoso sistema para estudar a função gênica e modelar mutações específicas relevantes para a doença. A geração de modificações genéticas heterozygous precisas é desafiante devido à formação negociada do Indel de CRISPR-CAS9 no segundo alelo. Aqui, demonstramos um protocolo para ajudar a superar essa dificuldade usando dois modelos de reparo em que apenas um expressa a mudança de sequência desejada, enquanto ambos os modelos contêm mutações silenciosas para evitar a formação de recorte e INDEL. Esta metodologia é mais vantajosa para a edição de genes codificando regiões de DNA para gerar controle isogênico e linhas de células-tronco humanas mutantes para estudar doenças humanas e biologia. Além disso, a otimização das metodologias de transfecção e triagem foi realizada para reduzir o trabalho e o custo de um experimento de edição de genes. Globalmente, este protocolo é amplamente aplicável a muitos projetos de edição de genoma utilizando o modelo de células-tronco pluripotentes humanos.
Introduction
Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são ferramentas valiosas para modelar a doença humana devido à sua capacidade de renovação, mantendo a capacidade de gerar tipos de células de diferentes linhagens1,2 ,3,4. Estes modelos abrem a possibilidade interrogar a função do gene, e compreendem como as mutações e os fenótipos específicos são relacionados às várias doenças5,6. No entanto, para entender como uma alteração específica está ligada a um fenótipo específico, o uso de um controle isogênico pareado e de linhagens celulares mutantes é importante para o controle da variabilidade da linha para a linha7,8. A transcrição ativador-como os nucleases efetoras (TALENs) e os nucleases do dedo do zinco foram usados para gerar mutações da inserção ou do apagamento (indels) em modelos genéticos diversos, incluindo pilhas preliminares; Mas esses nucleases podem ser complicados de usar e caros9,10,11,12,13,14. A descoberta da repetição palindromic curta interespaçada agrupada regularmente (CRISPR)-a nuclease de CAS9 revolucionou o campo devido à eficiência na formação do Indel em virtualmente toda a região do genoma, na simplicidade do uso, e na redução no custo15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , a 19.
Um desafio em usar a tecnologia de edição baseada do genoma de CRISPR-CAS9 foi a geração ou a correção de mutações específicas em um alelo sem criar uma mutação do Indel no segundo alelo20. O principal objetivo deste protocolo é superar esse desafio usando dois modelos de reparo de oligonucleotídeo (ssODN) de cadeia única para reduzir a formação de Indel no segundo alelo. Ambos ssODNs são projetados para conter mutações silenciosas para evitar o re-corte pela nuclease CAS9, mas apenas um contém a alteração de interesse. Este método aumenta a eficiência de gerar uma modificação genética heterozygous específica sem induzir a formação do Indel no segundo alelo. Usando este protocolo, as experiências de edição do gene em seis posições genomic independentes demonstram a introdução exata da mudança genomic desejada em um alelo sem formação do Indel no segundo alelo e ocorre com uma eficiência total de ~ 10%. O protocolo descrito foi adaptado de Maguire et al.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. projeto e construção do RNA do guia (gRNA)
Nota: cada gRNA é composto de 2 60 pares de base (BP) oligonucleotídeos que são recozidos para gerar um 100 BP duplo encalhado (DS) oligonucleotide (Figura 1a-C). A linha do tempo para o projeto gRNA, geração e eficiência de corte de testes é de aproximadamente 2 semanas (Figura 2).
- Selecione a região de DNA de interesse a ser editado pelo genoma e identifique 3-4 23 sequências BP que se encaixam no formato, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Essas sequências devem ser localizadas dentro de 20 BP da região de interesse.
Observação: a segmentação pode ser realizada no sentido ou na vertente antisense. - Avalie as sequências de gRNA para redundância genômica e probabilidade fora do alvo usando um recurso como CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Incorpore a sequência alvo de 20 BP (excluindo o motivo adjacente do protoespaçador ou PAM) em oligonucleotídeos 2 60-Mer como mostrado (as sequências são 5 ' a 3 ' e vermelho e verde são complementos inversos como mostrado na Figura 1C).
- Encomende o 2 60 BP oligonucleotídeos do fornecedor de escolha. Uma vez que os oligonucleotídeos são recebidos, ressuscitem cada um a uma concentração final de 100 μm em DDH2O. faça um estoque de trabalho de 10 μm.
- Anneal os dois oligonucleotídeos e geram um fragmento de dsDNA de 100 BP usando o polymerase do ADN (tabela dos materiais). Combine 5 μL do oligonucleotide dianteiro de 10 μM e 5 μL do oligonucleotide reverso de 10 μM em um tubo da tira da reacção em cadeia do polymerase (PCR) e incubar em 95 ° c por 5 minutos. refrigere a reação por 10 minutos na temperatura ambiente (RT).
- Configurar o PCR como descrito na tabela 1. Realize a amplificação de PCR em um ciclador térmico utilizando os parâmetros descritos na tabela 2.
- Visualize os produtos do PCR em um gel do Agarose do brometo do etídio de 1,5% (w/v) (EtBr) electrophoresed em 80-100 v para 40 min. extirpar a faixa de 100 BP (Figura 3a), visualizado em uma caixa leve do diodo emissor de luz, do gel usando uma lâmina de navalha e purificar usando um gel Kit de extração (tabela de materiais).
2. projeto de primers do PCR para a seleção
- Realize a triagem do DNA editado usando primers de PCR para diante e reverso que são projetados especificamente para amplificar uma região de 400-500 BP do gene de interesse (tabela 2). Use o ADN isolado de toda a linha do iPSC do controle para confirmar um amplicon limpo ao executar o PCR da seleção.
- Visualize produtos do PCR em um gel de 1,5% (w/v) que segue a electroforese em 80-100 V para 1 h.
Nota: o sequenciamento de clones editados é realizado usando uma cartilha aninhada que é projetada após a confirmação do conjunto de primer de triagem. As amostras são enviadas para uma fonte comercial para seqüenciamento.
3. preparação de plasmídeo vetorial gRNA_cloning
- Para linearizar o vetor de clonagem, tome um tubo de centrifugação de 1,5 mL e adicione 1-5 μg de DNA do vetor gRNA_cloning juntamente com 4 μL do tampão enzimático de restrição AFLii e 1,5 μL de enzima de restrição AFLII. Coloque a reacção a 24 μL de ddH2o. Misture a reacção introduzindo a pipting para cima e para baixo. Incubar a 37 ° c durante a noite (O/N).
- Electrophorese em um gel do agarose de 1% em 80-100 V para 1 h e as faixas do imposto (o tamanho de faixa esperado são ~ 3519 BP).
- Extraia e purifique como na etapa 1,6.
4. montagem do vetor gRNA
- Configurar reações e montar fragmentos de DNA usando o kit de montagem (tabela de materiais) em 1:5 rácios de AFLII digerido grna clonagem de vetor para 100 BP gel purificada inserir, conforme descrito na tabela 3.
- Incubar a reacção a 50 ° c durante 15 min. diluir a reacção 1:3 em ddH2o e utilizar 3 μl para transformação bacteriana, de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais). Células de placa em placas de canamicina lb/agar.
- Escolha 3-5 colônias por gRNA. Inocular cada colônia em 4 mL de LB e crescer O/N a 37 ° c em uma incubadora de agitação orbital.
- Purifique o DNA plasmídeo usando um kit de isolamento de plasmídeo protocolo e sequencia cada grna usando os seguintes primers para garantir a clonagem bem-sucedida: forward: gtacaaaaaagcaggctttaaagg; Reverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. teste gRNA eficiência de corte
- HESCs da placa em fibroblastos embrionários murino irradiados (mefs) em uma placa de 6 poços, como descrito previamente21. Quando as células atingem 70-80% de confluência, prepare o Mix mestre de transfecção delineado na tabela 4.
- Misture com pipetagem e incubar em RT durante 15 min. Adicionar gota gota às células e incubar a 37 ° c por 48 h (com uma mudança de mídia após 24 h).
- Células de colheita para classificação após 48 h.
- Remover MEFs enzimaticamente (tabela de materiais) com uma incubação de 3 min RT.
- Lave as células 1x com meio hESC (tabela 5) e raspe em meio hESC + 10 μm Y-27632 dicloridrato de (tabela de materiais).
- Células da pelota a 300 x g por 3 min e ressuscição em 0,5 ml de meio hESC + 10 μm Y-27632 dicloridrato.
- Filtre em um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro de células de 35 μm.
- Usando a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), portão em células ao vivo e classificar as células positivas de proteína verde fluorescente (GFP).
- Transfira um máximo de 1,5 x 104 células ordenadas diretamente em um prato de 10 cm2 revestido com 1:3 matriz de membrana basal (tabela de materiais) e Mefs irradiados em meio hESC (tabela 5) contendo dicloridrato de Y-27632.
- Mude o meio diário usando o meio hESC (tabela 5) sem o dicloridrato de de Y-27632 e escolha manualmente clones após 10-15 dias, quando as colônias são ~ 1 milímetro no diâmetro.
- Usando uma pipeta e um microscópio de P200, raspe com cuidado um único clone e extraia pilhas na pipeta.
- Dispersar as células gentilmente pipetando 3-4x em uma placa de 96 bem no meio elaborado com a colônia.
- Dispense em tubos de tiras de PCR para triagem e pellet as células por centrifugação em 10.000 x g por 5 min. Pick 20 colônias por grna.
6. rastreio de clones
- Isole o DNA incubando pelotas de células em 20 μL de tampão proteinase K (tabela 5) (1 h a 55 ° c e 10 min a 95 ° c) e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante.
- Realize a triagem de PCR (seção 2) em um volume total de 20 μL usando uma mistura mestra, incluindo primers projetados para amplificar a região de interesse e 5 μL da síntese de proteinase K. Use o ADN genomic isolado da linha celular que era gene editado como um controle.
- Avalie as alterações de tamanho dos produtos de PCR após 1 h eletroforese a 70-90 V em um gel de agarose 2,5% (w/V) (Figura 3B, C). Qualquer diferença de tamanho é indicativa de clivagem.
7. edição precisa do genoma em pilhas de haste pluripotentes usando o único ADN do oligo da Costa (ssODNs)
- Design 100 BP ssODNs centrado em torno da seqüência gRNA mais eficiente determinado a ter a melhor eficiência de corte.
- Impeça o re-Cleavage do ODN recombined introduzindo mutações silenciosas na seqüência do gRNA. Uma única mutação silenciosa na seqüência PAM é suficiente, mas se não for possível, 3-4 mutações silenciosas funcionarão.
Nota: para facilitar a triagem de clones direcionados, a introdução de um local de restrição dentro de ~ 20 BP da seqüência gRNA é ideal. - Projete um ODN com as mudanças de base desejadas para criar a mutação do interesse e um ODN sem a mudança da base (s).
Nota: estas alterações não devem ser mais do que ~ 20 BP do local de corte CRISPR/CAS9 previsto, uma vez que a recombinação cai consideravelmente a distâncias maiores. - Encomendar os dois ssODNs do fornecedor de escolha e ressuscita na água para fazer 1 μg/μL estoques. Armazene estoques em-20 ° c.
8. instalação do transfection
- Para transfecção o ssodn e os Plasmids de crispr-CAS9, a placa a linha de pilha do alvo em um prato de 6 poços em mefs irradiados para alcangar 70-80% confluência após uma incubação de o/N.
- Configurar a reação de transfecção conforme descrito na tabela 6. Misture a reacção introduzindo pipetagem e incubar durante 15 min em RT. Adicione a mistura de reação de transfecção gota gota às células.
- Após 48 h, prepare as células para classificação de células conforme descrito na seção 5,3.
- Escolha colônias ~ 10 dias após o chapeamento de células individuais usando uma pipeta 200 μL. Transfira 100 μL de células para um poço de uma placa de 24 ou 48 poços previamente revestida com gelatina e MEFs irradiados em meio hESC com dicloridrato de Y-27632. Utilize os restantes 100 μL para isolamento de ADN, conforme descrito na secção 6.
9. verificação de mutações em colônias únicas
- Para verificar a integração bem-sucedida do ssODN, tome 5 μL de DNA isolados de cada colônia para realizar a PCR usando os primers de triagem projetados na seção 2. Purify os produtos do PCR (tabela dos materiais) e prepare a digestão da enzima da limitação usando o local original da enzima criado no ssODN.
Nota: esta digestão também inclui o tampão da enzima de restrição e a concentração recomendada pelo fabricante de enzima de restrição num volume de 40 μL. - Misture a reacção introduzindo pipetagem e incubar a temperatura recomendada pelo fabricante durante 1-3 h.
- Visualize os produtos digeridos do PCR em um gel do Agarose do EtBr de 1,5% (w/v) electrophoresed em 80-100 V para 40 minutos. Se a integração bem-sucedida do ssODN ocorreu, sequencia mutações específicas usando uma cartilha aninhada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geração de gRNAs e triagem para indels
Cada gRNA será clonado em um vetor de plasmídeo e expressado usando o promotor U6. A enzima de restrição AFLII é usada para linearizar o plasmídeo (addgene #41824) e está localizada após o promotor U6. A faixa de 100 BP gerada após o recozimento do 2 60 BP oligos é clonada no vetor da expressão de gRNA usando o conjunto do ADN. Uma vez que os plasmídeo de grna são gerados, são transfected em hESCs ou em iPSCs junto com um plasmídeo de Crisps-CAS9 GFP (addgene #44719). As células GFP + são classificadas após 2 dias para enriquecer as células transfectadas e banhadas (ver secção 5). Após 10-14 dias, colônias derivadas de células únicas são colhidas e usadas para isolar o DNA para a tela para formação de Indel gerada para cada gRNA. Uma amplificação do PCR com os primers que medem o local do gRNA é usada para visualizar a formação do Indel usando um gel do agarose de 2,5% (w/v) com EtBr, electrophoresed em 70-90 V para 1 h.
Geração de 100 BP ssODN para introduzir mutações específicas
Dois ssODN oligos são projetados em torno do gRNA com o corte mais eficiente. Cada gRNA é 100 BP e contém mutações silenciosas, preferencialmente na seqüência PAM, para evitar o recorte (figura 4a). Uma mutação silenciosa na seqüência PAM pode gerar um local de restrição exclusivo, que ajuda a tela para uma integração bem-sucedida em um ou dois alelos (Figura 4B).
resultados de recombinação de ssODN
Usando este protocolo, a frequência de eventos de segmentação para seis genes diferentes usando a abordagem de dois ssODN é mostrada na Figura 5. Examinando a modificação genomic no local do grna em ambos os alelos, os resultados diferentes foram esperados including o recombinação do tipo selvagem (WT) ssodn, o ssodn do mutante e a formação do INDEL. Os clones em que apenas um alelo havia sido submetido à recombinação, o desfecho mais comum foi a formação de Indel no segundo alelo (10-42%). Os clones que tiveram a integração do ssODNs em ambos os alelos conduziram a três resultados diferentes: 1) integração do WT ssODN em ambos os alelos (0-8%), 2) integração do ssODN do mutante em ambos os alelos (0-25%), e 3) integração do WT e do peso ssODN do mutante (8-21%).
Figura 1: visão geral da geração de gRNA. (A) na região de interesse, projetar quatro grnas terminando em gg que não são mais de 20 BP distante. (B) cada grna de 23 BP tem uma sequência Pam de NGG na extremidade 3 '. (C) os primers 60 BP são constituídos por uma sequência de 40 PB complementar ao plasmídeo da espinha dorsal do grna e a sequência de 20 BP grna sem a sequência Pam. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cronograma do protocolo para geração de gRNA e rastreamento de clones. A linha do tempo para geração de gRNA e clones de triagem é mostrada. Projetar e clonando plasmídeos da expressão de grna toma aproximadamente uma semana. Aproximadamente 48 horas após o transfection em PSCs humanos, as pilhas de GFP + são classificadas e chapeadas na diluição de limitação. As colônias devem ser visíveis entre 7-10 dias e aproximadamente dia 20, clones podem ser escolhidos para triagem, expansão e confirmação de sequência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: teste de gRNA para a eficiência do corte. (A) para a construção de grna, uma faixa de 100 BP é extirpada de um gel do agarose de 1,5%. (B) após o transfection da pilha, a validação do corte de grna é visualizada usando um gel do agarose de 2,5%. Um produto do PCR de 180 BP é usado para verific para obter a formação do Indel em que um controle uncut e uns clones diferentes são analisados para deslocamentos da faixa indicativos da formação do INDEL. (C) diferentes grnas podem ter diferentes eficiências de corte. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: geração e triagem de mutações usando dois ssODNs. (A) para evitar o recorte CRISPR-CAS9 dos alelos editados, a sequência Pam pode ser modificada usando uma mutação silenciosa de G para a. Essa modificação adiciona um site de restrição EcoRI exclusivo que pode ser usado para triagem. Além desta mutação silenciosa, o mutante ssODN contém a mudança de base desejada. (B) a triagem para recombinação de oligonucleotídeo usando a digestão da enzima de restrição EcoRI pode resultar em três desfechos possíveis: nenhum corte representado por uma faixa de WT a ~ 650 BP, recombinação em um alelo representado por uma faixa sem cortes de 650 BP e duas bandas menores ou inserção em ambos os alelos representados por apenas bandas menores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: eficiência e resultados da integração de ssODN. A eficiência e os resultados da integração da aproximação de dois ssODN foram determinados analisando seis genes diferentes. Se somente um ssODN integrou, a formação do Indel foi detectada geralmente no outro alelo. Se dois ssODNs integrados, três resultados possíveis foram detectados, como mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Volume (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 0,4 |
| Polimerase de Taq | 0,2 |
| Tampão do PCR | 4,0 |
| Oligos recozidos (10 μM) | 10,0 |
| ddH2O | 5,4 |
Tabela 1: condições de clonagem de gRNA de PCR.
| Programa do PCR | |
| Passo 1 | 98 ° c para 30 s |
| Passo 2 | 98 ° c para 10 s |
| Passo 3 | 55 ° c para 20 s |
| Passo 4 | 72 ° c para 30 s |
| Passo 5 | Repita os passos 2 − 4 para 30 ciclos |
| Passo 6 | 72 ° c por 5 min |
| Passo 7 | Preensão em 4 ° c |
Tabela 2: parâmetros de ciclagem de PCR.
| Reagente | Volume (μL) |
| vetor de grna linearizada usando AflII (isto é, 50 ng/μL) | 1,0 |
| 100 BP DNA (i.e., 250 ng/μL) | 1,0 |
| Master Mix 2x | 10,0 |
| ddH2O | veículo especial q.s.p. a 20 |
Tabela 3: condições de reação do conjunto gRNA.
| Reagente | Quantidade |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| vetor pCas9_GFP (plasmídeo addgene 44719) | 0,5 μg |
| plasmídeo de gRNA | 0,5 μg |
| reagente do transfection do lipido | 3,0 μL |
Tabela 4: mistura mestre de transfecção celular.
| hESC médio | |
| Reagente | Concentração final |
| DMEM/F12 | |
| Reposição sérica de nocaute (KDR) | 15% (v/v) |
| Aminoácidos não essenciais | 100 μM |
| Piruvato de sódio | de 1 mM |
| Glutamina | de 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 0,1 milímetros |
| bFGF Human (fator de crescimento básico de fibroblastos) | 10 ng/mL |
| amortecedor de 10x proteinase K | |
| PH de Tris. HCl: 7.4 | 50 milímetros |
| PH do sulfato de amônio: 9,3 | de 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 milímetros |
| Tween 20 | 0,1% (v/v) |
| A proteinase K | 100 μg/mL |
Tabela 5: meio de cultura celular e tampão de digestão da proteinase K.
| Reagente | Quantidade |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| vetor pCas9_GFP (plasmídeo addgene 44719) | 0,5 μg |
| plasmídeo de gRNA | 0,5 μg |
| ssODN (0,5 μg de cada ssODN) | 1,0 μg |
| reagente do transfection do lipido | 3,0 μL |
Tabela 6: mistura do mestre da transfecção da pilha de ssODN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste protocolo, o uso de CRISPR-CAS9 junto com dois moldes do reparo de ssODN para gerar mudanças heterozygous ou homozygous específicas do genoma é demonstrado em pilhas de haste pluripotentes humanas. Este método conduziu à geração bem sucedida de linhas de pilha isogênicos que expressam mudanças genomic heterozygous com uma eficiência perto de 10%. Este protocolo foi aperfeiçoado para ambos os ESCs e os iPSCs humanos crescidos em MEFs irradiados que apoiam o crescimento e a sobrevivência da pilha após a cultura de pilhas na baixa densidade após a classificação da pilha. A morte celular pode ser minimizada pela manutenção de células com 10 ng/mL de bFGF e Y-27632 dihydrochloride. É possível que este protocolo possa ser adaptado aos sistemas livres da cultura do alimentador, mas uma optimização mais adicional pode ser necessária.
A eficiência do transfection pode ser variável da linha celular à linha celular, mas o uso de 3 μg do ADN e de 3 μL de um reagente do transfection do lipido deu geralmente os melhores resultados da eficiência do transfection de 0.5-2%. No entanto, se a eficiência de transfecção é menor, a otimização da quantidade de DNA e reagente lipídico pode ser realizada. Outros reagentes de transfecção também podem ser testados pelo investigador.
A eficiência da geração do Indel variará com gRNAs diferentes e pode ser influenciada pela posição genomic. Dentro da grande maioria dos casos, se quatro gRNAs são projetados, pelo menos uma e muitas vezes 2 a 3, funcionará eficientemente. Adicionalmente, antes de testar gRNAs, a optimização da estratégia do PCR para visualizar indels com um produto limpo do ADN da única faixa é importante. Para a triagem ssODN baseou a edição do genoma, é o melhor adicionar um local da enzima da limitação ao introduzir uma mutação silenciosa, mas se não possível, o apagamento de um local da enzima da limitação pode ser usado também. Além disso, a homologia dirigida reparação requer ativamente as células de ciclismo para que a densidade celular de culturas antes do transfection é fundamental para aumentar a freqüência de clones reparados usando o modelo introduzido ssODN.
Algumas das limitações deste protocolo estão relacionadas à posição no genoma que será editada. Quando as regiões codificantes são modificadas, o ssODN que carreg mutações silenciosas impede que o Cas9 recorte o local editado e as mutações silenciosas não alterem o produto da proteína. No entanto, a edição em regiões reguladoras ou não codificantes usando essa metodologia torna-se mais difícil, pois mutações silenciosas não são possíveis. Se a base a ser editada é parte de uma sequência PAM, isso pode ser feito com êxito, mas apenas as alterações homozozis podem ser geradas de forma eficiente.
O protocolo descrito aqui é útil para gerar ou corrigir mutações de codificação heterozygous sem a adição de indels não intencionais no segundo alelo. Este protocolo facilitará o uso de PSCs humanos para estudar uma escala larga dos tópicos da biologia desenvolvente à modelagem de doenças genéticas. O uso de linhas isogênicas é crítico para definir funções de uma determinada mutação de codificação sem efeitos de confundimento devido a diferentes origens genéticas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue (NHLBI), institutos nacionais de saúde através de subsídios U01HL099656 (PG e D.L.F.) e U01HL134696 (PG e D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
