Summary
该协议提供了一种方法，促进在人类多能干细胞中使用CRISPR-CAS9生成定义的异质核苷酸或同源核苷酸变化。
Abstract
人类多能干细胞为研究基因功能和模拟与疾病相关的特定突变提供了强大的系统。由于CRISPR-CAS9介导在第二个等位基因的形成，精确异构基因修饰的生成具有挑战性。在这里，我们演示了一个协议，以帮助克服这一困难，通过使用两个修复模板，其中只有一个表示所需的序列变化，而两个模板包含无声突变，以防止重新切割和indel形成。该方法对DNA的基因编辑编码区域产生异源对照和突变人类干细胞系，研究人类疾病和生物学最为有利。此外，还优化了转染和筛选方法，以减少基因编辑实验的人工和成本。总体而言，该方案广泛适用于利用人类多能干细胞模型进行的许多基因组编辑项目。
Introduction
人类胚胎干细胞 （hESCs） 和诱导多能干细胞 （iPSC） 是模拟人类疾病的宝贵工具，因为它们具有更新能力，同时保持生成不同谱系细胞类型的能力1，2 ，3，4.这些模型开启了询问基因功能的可能性，并了解特定突变和表型如何与各种疾病5、6相关。然而，为了理解特定改变如何与特定的表型相关联，使用成对同源对照和突变细胞系对于控制线变异性7、8非常重要。转录活化剂样效应素核酸酶（TALEN）和锌指核酸酶已用于在各种基因模型（包括原发细胞）中生成插入或删除（indels）突变;但这些核酸酶可能使用繁琐，而且价格昂贵9，10，11，12，13，14。集群定期间隔短节重复（CRISPR）-CAS9核酸酶的发现，由于在基因组的几乎任何区域的印德尔形成效率、使用简单性以及成本降低15，使该领域发生了革命性的变化。,16,17,18,19.
使用CRISPR-CAS9基于基因组编辑技术的挑战是生成或校正一个等位基因的特定突变，而不在第二个等位基因20中产生indel突变。该协议的主要目标是通过使用两个单链寡核苷酸 （ssODN） 修复模板来克服这一挑战，以减少第二个等位基因的形成。两种ssODN都设计包含无声突变，以防止CAS9核酸酶的重新切割，但只有一个包含利息的改变。该方法提高了产生特定杂性基因修饰的效率，而不会在第二个等位基因中诱导indel形成。利用该协议，在六个独立基因组位置进行基因编辑实验，证明在一个等位基因中精确引入所需的基因组变化，而第二个等位基因形成无indel形成，总效率为±10%。所述议定书改编自马奎尔等人21日。
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Protocol
1. 导引RNA（gRNA）的设计和结构
注：每个gRNA由两个60基对（bp）寡核苷酸组成，这些基质退火产生100 bp双绞合（ds）寡核苷酸（图1A-C）。gRNA 设计、生成和测试切割效率的时间表约为 2 周（图 2）。
- 选择要编辑基因组的DNA区域，并确定符合格式的3-4 23 bp序列，5'-G（N 19）NGG-3'。这些序列应位于感兴趣区域的 20 bp 以内。
注：目标可以在感应或反感链上执行。 - 使用 CRISPOR （http://crispor.tefor.net）等资源评估基因组冗余和离目标概率的 gRNA 序列。
- 将 20 bp 目标序列（不包括原木器相邻图案或 PAM）合并到两个 60 mer 寡核苷酸中（序列为 5' 到 3'，红色和绿色是反向补品，如图1C所示）。
- 从选择的供应商订购两个 60 bp 寡核苷酸。一旦收到寡核苷酸，在ddH2O中重新悬浮到100μM的最终浓度。使工作库存为10μM。
- 用DNA聚合酶（材料表）对两个寡核苷酸进行退火，并产生100 bp dsDNA片段。将5μL的10μM正向寡核苷酸和5μL的10μM反向寡核苷酸结合到聚合酶链反应（PCR）带管中，并在95°C下孵育5分钟，在室温（RT）下冷却反应10分钟。
- 如表 1所述设置 PCR。使用表2中概述的参数在热循环器中执行PCR放大。
- 在 1.5% （w/v） 溴化 （EtBr） 抗氧化凝胶电泳 80-100 V 上，40 分钟，将 PCR 产品可视化在 LED 灯箱上，从使用剃须刀的凝胶中，使用凝胶进行纯化提取套件 （材料表）
2. 用于筛选的 PCR 引体设计
- 使用前向和反向PCR引源进行编辑的DNA筛选，该引基专门设计用于扩增400-500 bp区域的感兴趣基因（表2）。在进行PCR筛选时，使用从任何对照iPSC线路中分离的DNA来确认一个干净的放大素。
- 在电泳后，在 80-100 V 下将 PCR 产品可视化到 1.5% （w/v） 凝胶上，为 1 小时。
注： 编辑的克隆的排序使用嵌套底漆执行，该底漆是在筛选引信集确认后设计的。样品被发送到商业来源进行测序。
3. gRNA克隆载体质粒的制备
- 要使克隆载体线性化，采用 1.5 mL 离心管，加入 1-5 μg 的 gRNA 克隆载体 DNA 以及 4 μL的 AflII 限制酶缓冲液和 1.5 μL的 AflII 限制酶。提出对ddH2O的24 μL的反应。通过上下移液混合反应。在37°C过夜孵育（O/N）。
- 电磷在1%的甘蔗凝胶在80-100 V1小时和消费税带（预期带大小为+3519 bp）。
- 提取和净化步骤1.6。
4. gRNA载体的组装
- 设置反应，并使用组装试剂盒（材料表）设置反应和组装DNA片段，以AflII消化的gRNA克隆载体与100bp凝胶纯化插入的1：5的比例，如表3所述。
- 在50°C下孵育反应15分钟，在ddH2O中稀释反应1：3，按照制造商的说明（材料表）使用3μL进行细菌转化。卡那霉素LB/琼脂板上的板细胞。
- 每克RNA选择3-5个菌落。在4 mL的LB中接种每个菌群，并在37°C的轨道摇动培养箱中生长O/N。
- 使用微型质粒分离试剂盒纯化质粒DNA，并使用以下引物对每个gRNA进行测序，以确保成功克隆：前进：GTAAAAAAGAAGCTTAAGG;反向： TGCCAATATCTAAAAGCT.
5. 测试 gRNA 切割效率
- 板hESCs在辐照的鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在6孔板，如前所述21。当细胞达到70-80%的汇合时，准备表4中概述的转染主混合物。
- 通过移液在RT下混合和孵育15分钟。滴入细胞，在37°C孵育48小时（24小时后更换介质）。
- 收获细胞，在48小时后分拣。
- 用3分钟RT孵育，酶去除MEF（材料表）。
- 用hESC介质冲洗细胞1x（表5），刮入hESC介质+10μM Y-27632二盐（材料表）。
- 300 x g的颗粒细胞 3 分钟，在 0.5 mL 的 hESC 介质 + 10 μM Y-27632 二盐中重新悬浮。
- 通过 35 μm 细胞滤网盖过滤到 5 mL 管中。
- 使用荧光活化细胞分类（FACS），对活细胞进行门控，并分拣绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞。
- 将最多1.5 x 104个分类的细胞直接转移到一个10厘米2的碟子上，上面涂有1：3的基底膜基质（材料表），并在含有Y-27632二盐酸的hESC介质（表5）中照射MEFs。
- 在没有Y-27632二盐酸的情况下，每天使用hESC介质更换介质，并在10-15天后手动挑选克隆，当菌落直径为±1 mm时。
- 使用 P200 移液器和显微镜，小心地刮擦单个克隆，并将细胞放入移液器中。
- 在与菌群绘制的介质中，在 96 孔板中轻轻移液 3-4x，以分散细胞。
- 放入PCR带管进行筛选，并在10，000 x g离心下颗粒细胞5分钟。
6. 克隆筛选
- 通过在20μL蛋白酶K缓冲液（表5）中孵育细胞颗粒（在55°C下孵化1小时，在95°C下孵化10分钟）和涡旋大力分离DNA。在 10，000 x g下离心 5 分钟，并收集上清液。
- 使用主混合物（包括旨在放大感兴趣区域的引体和5 μL蛋白酶K消化剂）在总体积为20μL的体积下进行筛选PCR（第2部分）。使用从基因编辑为对照的细胞系分离的基因组DNA。
- 在 2.5% （w/v） agarose 凝胶上，在 70-90 V 下 1 h 电泳后评估 PCR 产品的大小变化（图 3B，C）。任何尺寸差异都表示裂解。
7. 使用单链寡核糖核酸（ssODN）对多能干细胞进行精确基因组编辑
- 设计 100 bp ssODN 以最有效的 gRNA 序列为中心，确定具有最佳的切割效率。
- 通过在gRNA序列中引入无声突变，防止重组的ODN的重新裂解。PAM 序列中的单个静默突变就足够了，但如果不可能，3-4 个静默突变将起作用。
注：为了便于筛选靶向克隆，在gRNA序列的±20 bp内引入限制位点是理想的选择。 - 设计一个具有所需基次更改的 ODN 以创建感兴趣的突变，一个 ODN 在没有基次更改的情况下进行设计。
注： 这些更改不应超过预测的 CRISPR/CAS9 切割站点的 20 bp，因为重组在更远的距离内会大幅下降。 - 从选择的供应商处订购两个 ssODN，然后在水中重新悬浮，以生产 1 μg/μL 库存。储存在-20°C的库存。
8. 转染设置
- 转染ssODN和CRISPR-CAS9质粒，在辐照MEFs上的6孔盘中将目标细胞系板成板，在O/N孵育后达到70-80%的汇合。
- 如表6所述设置转染反应。通过移液混合反应，在RT处孵育15分钟。将转染反应混合物滴入细胞。
- 48小时后，按照第5.3节所述，准备细胞进行细胞分拣。
- 使用 200 μL 移液器电镀单个细胞后 10 天选择菌落。将100 μL的电池转移到24或48孔板的一口井中，该孔板以前涂有明胶，在hESC介质中用Y-27632二盐酸剂照射MEF。使用剩余的100μL进行DNA分离，如第6节所述。
9. 检查单菌落的突变
- 为了检查ssODN的成功整合，从每个菌群中分离出5μL的DNA，使用第2节设计的筛选引体执行PCR。净化PCR产物（材料表），并使用在ssODN中产生的独特酶位点制备限制性酶消化。
注：此消化还包括限制性酶缓冲液和制造商推荐的40μL体积中限制性酶的浓度。 - 通过移液混合反应，并在制造商的建议温度下孵育1-3小时。
- 在 1.5% （w/v） EtBr agarose 凝胶电泳 80-100 V 上可视化消化的 PCR 产品 40 分钟。如果 ssODN 已成功集成，则使用嵌套引体对特定突变进行序列化。
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Representative Results
生成 gRNA 和针对印子的筛查
每个gRNA将被克隆成质粒载体，并使用U6启动子表达。AflII限制酶用于使质粒（添加基因#41824）线性化，位于 U6 启动子之后。两个 60 bp 寡核糖退火后产生的 100 bp 波段使用 DNA 程序集克隆到 gRNA 表达载体中。一旦gRNA质粒生成，它们与CRISPS-CAS9 GFP质粒（添加基因#44719）一起转染成hESC或iPSC。GFP® 细胞在2天后进行分拣，以丰富转染细胞和镀层（见第5节）。10-14天后，单细胞衍生菌落被采摘，用于分离DNA，以筛选每个gRNA产生的indel形成。使用跨越gRNA位点引的PCR扩增使用2.5%（w/v）带EtBr的抗胶凝胶，在70-90 V下电泳1小时，用于可视化indel形成。
生成 100 bp ssODN 引入特定突变
两个ssODN寡聚物在gRNA周围设计，切割效率最高。每个gRNA为100 bp，并包含无声突变，最好在PAM序列，以避免重新切割（图4A）。PAM 序列中的静默突变可以生成唯一的限制位点，这有助于筛选成功集成到一个或两个等位基因（图 4B）。
sSODN 重组结果
使用该协议，使用两个ssODN方法对六个不同基因进行靶向事件的频率如图5所示。通过检查两个等位基因的gRNA位点的基因组修饰，预期会有不同的结果，包括重组野生型（WT）ssODN、突变ssODN和indel形成。只有一个等位基因经历重组的克隆，最常见的结果是在第二个等位基因（10-42%）中形成indel。在两个等位基因中集成ssODN的克隆导致三种不同的结果：1） WT ssODN在两个等位基因（0-8%）中的集成（0-8%），2）突变ssODN在两个等位基因（0-25%）中的集成，以及3）WT和突变ssODWT（8-21%）的集成。
图1：gRNA生成概述。（A） 在感兴趣的区域，设计四个以 GG 结尾的 gRNA，间隔不超过 20 bp。（B） 每 gRNA 的 23 bp 在 3' 末端具有 NGG 的 PAM 序列。（C） 60 bp 引基由 40 bp 序列组成，该序列与 gRNA 主干质粒和 20 bp gRNA 序列互补，没有 PAM 序列。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：gRNA生成和克隆筛选的协议时间线。显示了 gRNA 生成和筛选克隆的时间轴。设计和克隆gRNA表达质粒大约需要一周时间。在转染到人类PSC后约48小时，GFP®细胞在限制稀释时进行分类和镀层。菌落应在7-10天之间可见，大约在20天，克隆可以挑选进行筛选、扩张和序列确认。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：用于切割效率的gRNA测试。（A） 对于gRNA结构，从1.5%的甘蔗糖凝胶中去除100 bp带。（B） 细胞转染后，使用2.5%的糖胶对gRNA切割的验证进行可视化。180 bp PCR 产物用于检查未切割控制和不同克隆的内德尔形成，分析指示 indel 形成的带移位。（C） 不同的rna可能具有不同的切割效率。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：使用两个ssODN生成和筛选突变。（A） 为了避免CRISPR-CAS9重新切割编辑的等位基因，可以使用G到A静默突变修改PAM序列。此修改添加了可用于筛选的唯一 EcoRI 限制站点。除了这种无声突变，突变ssODN包含所需的碱基变化。（B） 使用 EcoRI 限制酶消化进行寡核苷酸重组的筛选可产生三种可能的结果：WT 带在 ±650 bp 时无切割，在一个等位基因中重组，由 650 bp 和 2 的未切割带表示较小的频段或插入两个等位点，仅由较小的波段表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：ssODN集成效率和结果。通过分析六种不同基因，确定了两种ssODN方法的整合效率和结果。如果只集成一个 ssODN，则通常在其他等位基因中检测到 indel 形成。如果集成了两个 ssODN，则检测到三种可能的结果，如图所示。请点击此处查看此图的较大版本。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| dNTP （10 mM） | 0.4 |
| 塔克聚合酶 | 0.2 |
| PCR 缓冲液 | 4.0 |
| 退火寡聚物 （10 μM） | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
表1：gRNA克隆PCR条件。
| PCR 程序 | |
| 步骤 1 | 98 °C，30 s |
| 步骤 2 | 98 °C，10 s |
| 步骤 3 | 55 °C，20 s |
| 步骤 4 | 72 °C，30 s |
| 步骤 5 | 重复步骤 2⁄4 30 个循环 |
| 步骤 6 | 72 °C 5 分钟 |
| 步骤 7 | 保持在 4°C |
表2：PCR循环参数。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| 使用 AflII 线性化 gRNA 矢量（即 50 纳克/μL） | 1.0 |
| 100 bp DNA（即 250 纳克/μL） | 1.0 |
| 主混音 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. 到 20 |
表3：gRNA组装反应条件。
| 试剂 | 量 |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFP载体（添加基因质粒44719） | 0.5 μg |
| gRNA质粒 | 0.5 μg |
| 脂质转染试剂 | 3.0 μL |
表4：细胞转染主混合物。
| hESC 介质 | |
| 试剂 | 最终浓度 |
| DMEM/F12 | |
| 挖空血清置换 （KDR） | 15% （v/v） |
| 非必需氨基酸 | 100 μM |
| 丙酸钠 | 1 mM |
| 谷 氨 酰 胺 | 2 mM |
| β-梅卡托乙醇 | 0.1 mM |
| bFGF 人（基本成纤维细胞生长因子） | 10 纳克/千米 |
| 10x蛋白酶K缓冲液 | |
| Tris.HCl pH：7.4 | 50 mM |
| 硫酸铵 pH： 9.3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| 补间 20 | 0.1% （v/v） |
| 蛋白酶K | 100 μg/mL |
表5：细胞培养基和蛋白酶K消化缓冲液。
| 试剂 | 量 |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFP载体（添加基因质粒44719） | 0.5 μg |
| gRNA质粒 | 0.5 μg |
| ssODN （每 ssODN 0.5 μg） | 1.0 μg |
| 脂质转染试剂 | 3.0 μL |
表6：ssODN细胞转染母混合物。
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Discussion
在此协议中，CRISPR-CAS9 与两个ssODN修复模板一起，在人类多能干细胞中证明具有特定的异构基因组变化或同源基因组变化。该方法成功地生成了异源细胞系，以接近10%的效率表达异质基因组变化。该协议已针对人类ESC和iPSCs在辐照MEF上生长，支持细胞生长和存活后培养细胞在低密度细胞排序后。通过维持具有10纳克/mL bFGF和Y-27632二盐的细胞，可以最大限度地减少细胞死亡。该协议可能适用于馈送自由培养系统，但可能需要进一步优化。
转染效率可以从细胞系到细胞系变化，但使用3μg的DNA和3μL的脂质转染试剂通常给出0.5-2%转染效率之间的最佳结果。但是，如果转染效率较低，则可以优化DNA和脂质试剂的含量。其他转染试剂也可以由调查员进行测试。
indel 生成的效率会因不同的 gRNA 而异，并且可能受基因组位置的影响。在绝大多数情况下，如果设计四个 gRNA，则至少一次和多倍 2 到 3 次，将高效工作。此外，在测试 gRNA 之前，优化 PCR 策略以使用干净的单波段 DNA 产品可视化 indels 非常重要。对于基于ssODN的基因组编辑进行筛选，最好在引入无声突变时添加限制性酶位点，但如果不可能，也可以使用删除限制性酶位点。此外，同源定向修复需要主动循环细胞，因此转染前的培养物的细胞密度对于提高使用引入的ssODN模板修复的克隆的频率至关重要。
该协议的一些限制与要编辑的基因组中的位置有关。当编码区域被修改时，ssODN携带无声突变可防止Cas9重新切割编辑的位点，而无声突变不会改变蛋白质产物。但是，使用此方法在监管或非编码区域中进行编辑变得更加困难，因为无法进行无声突变。如果要编辑的基是 PAM 序列的一部分，则可以成功完成此操作，但只能有效地生成同源更改。
此处描述的协议可用于生成或纠正杂杂编码突变，而无需在第二个等位基因中添加意外的 indels。该协议将促进使用人类PSC来研究从发育生物学到遗传疾病建模的广泛主题。使用同源性线对于定义给定编码突变的功能至关重要，而不会因不同的遗传背景而产生混淆效应。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）、国家卫生研究院的资助，资助了U01HL099656（P.G.和D.L.F.）和U01HL134696（P.G.和D.L.F.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
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