Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung

Reinier  J. de Vries; Peony  D. Banik; Sonal Nagpal; Lindong Weng; Sinan Ozer; Thomas  M. van Gulik; Mehmet Toner; Shannon  N. Tessier; Korkut Uygun

doi:10.3791/60250

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Methodenartikel

Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung

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DOI:

10.3791/60250

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25. Oktober 2019

Reinier J. de Vries¹^,²^,³ , Peony D. Banik¹^,² , Sonal Nagpal¹^,² , Lindong Weng¹^,² , Sinan Ozer¹^,² , Thomas M. van Gulik³ , Mehmet Toner¹^,² , Shannon N. Tessier¹^,² , Korkut Uygun¹^,²

¹Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, ²Shriners Hospitals for Children, Boston, ³Department of Surgery, University of Amsterdam

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine eisfreie Kryokonservierungsmethode für große Mengen von Rattenhepatozyten, bei der Primärzellen mit kryoprotektiven Mitteln in geringer Konzentration vorinkubiert und in großen Tröpfchen verglast werden.

Zusammenfassung

Die Vitrifizierung ist eine vielversprechende eisfreie Alternative zur klassischen Slow-Freezing (bei ca. 1 °C/min) Kryokonservierung biologischer Proben. Die Vitrifizierung erfordert extrem schnelle Kühlraten, um den Übergang von Wasser in die Glasphase zu erreichen und gleichzeitig eine schädliche Eisbildung zu vermeiden. Obwohl die Vorinkubation mit kryoprotektiveN (CPA) die kritische Abkühlrate biologischer Proben reduzieren kann, sind in der Regel hohe Konzentrationen erforderlich, um eine eisfreie Kryokonservierung durch Verglasung zu ermöglichen. Infolgedessen wird die Verglasung durch CPA-Toxizität behindert und auf kleine Proben beschränkt, die schnell gekühlt werden können. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen durch die Verglasung von Tröpfchen überwunden werden können. Mit dieser neuartigen Methode werden Zellen zunächst mit einer niedrigen intrazellulären CPA-Konzentration vorinkubiert. Durch die Nutzung einer schnellen osmotischen Dehydrierung konzentriert sich das intrazelluläre CPA direkt vor der Vitrifizierung, ohne dass toxische CPA-Konzentrationen vollständig ausgeglichen werden müssen. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durchgeführt und mit kontinuierlicher hoher Durchsatzerzeugung von großen Tröpfchen integriert, die in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese eisfreie Kryokonservierungsmethode mit minimaler CPA-Toxizität eignet sich für große Zellmengen und führt zu einer erhöhten Hepatozytenlebensfähigkeit und Metabolisierungsfunktion im Vergleich zur klassischen langsam gefrierenden Kryokonservierung. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für eine erfolgreiche Bulk-Droplet-Verglasung im Detail.

Einleitung

Verlust der Zelllebensfähigkeit und metabolische Funktion nach Kryokonservierung von Hepatozyten ist immer noch ein großes Problem, das klinische Anwendungen begrenzt¹^,²^,³. Die Benchmark-Methode der Hepatozyten-Kryokonservierung ist das langsame Einfrieren, das durch Vorinkubation der Hepatozyten mit CPA (Dimethylsulfoxid [DMSO], Glucose und Albumin) und anschließender kontrollierter Rate gefriert (bei ca. 1 °C/min) kryogene Temperaturen⁴^,⁵. Trotz vieler gemeldeter Optimierungen bleiben CPA-Toxizität zusammen mit schä....