Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

Summary

Dieses Protokoll zeigt sowohl die immunologische Synapsenbildung als auch den anschließenden polarisierten Sekretorischen Verkehr zur immunologischen Synapse. Zelluläre Konjugate wurden zwischen einer superantigen-gepulsten Raji-Zelle (als Antigen-präsentierende Zelle) und einem Jurkat-Klon (als Effektorhelfer T-Lymphozyten) gebildet.

Abstract

Der Zweck der Methode ist es, eine immunologische Synapse (IS), ein Beispiel für die Zell-zu-Zell-Konjugation, die durch eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) und eine Effektor-Hilfszelle T-Lymphozyten (Th) gebildet wird, zu erzeugen und die Bilder aufzuzeichnen, die den ersten Stadien der IS-Bildung und die nachfolgenden Menschenhandelsereignisse (sowohl im APC als auch in der Th-Zelle). Diese Ereignisse werden schließlich zu einer polarisierten Sekretion beim IS führen. In diesem Protokoll wurden Jurkat-Zellen, die mit Staphylococcus Enterotoxin E (SEE)-gepulsten Raji-Zellen als Zellsynapsemodell in Frage gestellt wurden, wegen der Nähe dieses experimentellen Systems zur biologischen Realität verwendet (Th cell-APC synaptic conjugates). Der hier vorgestellte Ansatz umfasst die Zell-zu-Zell-Konjugation, die Zeitraffererfassung, die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie (WFFM) gefolgt von der Bildverarbeitung (Nacherfassungsdekonvolution). Dies verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der Bilder, verbessert die zeitliche Auflösung, ermöglicht die synchronisierte Erfassung mehrerer Fluorchrome in neu entstehenden synaptischen Konjugaten und verringert die Fluoreszenzbleichung. Darüber hinaus ist das Protokoll gut mit den Endpunktzellfixierungsprotokollen (Paraformaldehyd, Aceton oder Methanol) abgestimmt, die weitere Immunfluoreszenzfärbungen und Analysen ermöglichen würden. Dieses Protokoll ist auch mit der Laserscanning Konfokalmikroskopie (LSCM) und anderen modernen Mikroskopietechniken kompatibel. Als Hauptvorbehalt konnten nur die T-Zell-APC-Grenzen (sogenannte IS-Schnittstellen), die sich im rechten 90°-Winkel zur Fokusebene entlang der Z-Achse befanden, richtig abgebildet und analysiert werden. Es gibt andere experimentelle Modelle, die die Bildgebung in der Z-Dimension und die folgenden Bildanalysen vereinfachen, aber diese Ansätze emulieren nicht die komplexe, unregelmäßige Oberfläche eines APC und können nicht-physiologische Wechselwirkungen im IS fördern. Somit eignet sich der hier verwendete experimentelle Ansatz, um einige biologische Komplexitäten, die beim IS auftreten, zu reproduzieren und zu konfrontieren.

Introduction

Das Hauptziel der Methode ist es, immunologische Synapsen (IS) Zell-zu-Zell-Konjugate zu erzeugen, die durch eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) gebildet werden, die mit SEE-Superantigenen und einem Effektor Th-Zelle gepulst wird, und die Bilder zu registrieren, die den ersten Stadien der immunologischen Synapsenbildung und den nachfolgenden Handelsereignissen (sowohl in der APC als auch in der Th-Zelle) entsprechen, die schließlich zu einer polarisierten Sekretion führen werden. Die Etablierung des IS durch T-Lymphozyten nach Bindung ihres Zellrezeptors (TCR) an Anantigene, die an MHC-II auf dem APC gebunden sind, organisiert eine extrem dynamische, formbare und kritische Instanz, die an antigenspezifischen, humoralen und zellulären Immunantworten beteiligt ist^1,2. Der IS wird durch die Bildung eines speziellen supramolekularen Aktivierungskomplexes (SMAC) definiert, das durch einen Aktin-Reorganisationsprozess3 gekennzeichnet ist. Nach IS-Konstruktion durch T-Lymphozyten mit einem APC scheint die Polarisation der sekretotischen Vesikel gegenüber dem IS in polarisierte Sekretion an der synaptischen Lücke verwickelt zu sein. Diese fokussierte Maschinerie scheint das Immunsystem eindeutig mit einer hervorragend regulierten Strategie zu versorgen, um die Wirksamkeit kritischer sekretorischer Effektorrollen von T-Lymphozyten zu verbessern und gleichzeitig die unspezifische, zytokin-arbitierte Stimulation von Bystander-Zellen, die Tötung irrelevanter Zielzellen und den apoptotischen Selbstmord durch Aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD) zu reduzieren⁴.

Die Folgen des IS variieren sowohl in der Art der T-Lymphozyten als auch der APC. Der synaptische Kontakt von Th-Zellen (typischerweise CD4+-Zellen) mit dem APC, der Antigen-assoziiertmit MHC-II zeigt, erzeugt die Aktivierung der T-Zelle (Zytokinsekretion, Proliferation usw.) und in einigen Fällen Apoptose über AICD⁴. Bei zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) (hauptsächlich CD8+-Zellen), die mit APC interagieren und Antigen im Zusammenhang mit MHC-I darstellen, unterscheidet sich das Ergebnis bei der Vorstimulation oder nicht der CTLs mit Antigen. So werden naive CTLs, die Antigen-MHC-I-Komplexe auf dem APC identifizieren, "grundiert", um Zielzellen zu zerstören und zu teilen. Primed CTLs stellen auch Synapsen mit Zielzellen (d. h. Zellen, die mit Viren oder Tumorzellen infiziert sind) und produzieren antigenspezifische Zellausrottung^5,6.

Die polarisierte Sekretion von Exosomen an der immunologischen Synapse ist ein sich entwickelndes und herausforderndes Forschungsgebiet, das an relevanten Immunantworten beteiligt ist⁷. Es wurde gezeigt, dass multivesikuläre Körper (MVB), die intraluminale Vesikel (ILVs) tragen, polarisierten Transport in Richtung IS^8,9 ( Video1) bei TCR-Stimulation mit Antigen erleben. Die Verschmelzung dieser MVB an der synaptischen Membran induziert deren Degranulation und die Freisetzung der ILVs als Exosomen in den synaptischen^Spalten8,10. Dies tritt in IS von Th-Typ Jurkat-Zellen gebildet, die mit SEE superantigenbeschichteten Raji-Zellen als APC^11,TCR-stimulierte CD4⁺ Lymphoblaste und grundierte CTLs herausgefordert wurden. So stellen Synapsen von Jurkat-Zellen ein wertvolles Modell zur Untersuchung des polarisierten Sekretousverkehrs von Exosomen dar. Darüber hinaus haben mehrere Jahrzehnte der Untersuchung gezeigt, dass viele grundlegende Erkenntnisse in der TCR-Signalisierung aus Studien mit transformierten T-Zell-Linien stammen, und in der Tat ist das bekannteste dieser Modellsysteme die Jurkat-Leukemic T-Zell-Linie¹².

Die Bildung eines voll entwickelten IS führt zu mehreren entscheidenden biologischen Ergebnissen, einschließlich der Aktivierung von Th-Zellen, der Aktivierung naiver CTLs oder der Tötung von Zielzellen durch grundierte CTLs, abgesehen von Anergie oder AICD⁵. Daher gibt es zwei Haupttypen von sekretonierenden IS, die von T-Lymphozyten etabliert werden, die zu sehr unterschiedlichen, aber ähnlich kritischen Immuneffektorfunktionen^1,6,13führen. Einerseits induziert der IS aus grundierten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) eine schnelle Polarisation (von Sekunden bis wenigen Minuten) von lytischen Granulaten (sogenannte "sekretotische Lysosomen") in Richtung DES IS. Die Degranulation des lytischen Granulats induziert das Sekretionperforin und Granzyme in den synaptischen^{Spaltenspalten 14}, die pro-apoptotische Moleküle sind. Die abgesonderten Perforin- und Granzyme induzieren anschließend die Tötung der Zielzellen^15,16. CTLs entwickeln temporäre Synapsen, die nur wenige Minuten dauern, da die Zielzellen ermordet werden^3,17. Dies ist wahrscheinlich auf den Umstand zurückzuführen, dass die optimale CTL-Aufgabe einen schnellen und temporären Kontakt erfordert, um so viele tödliche Schläge wie möglich auf zahlreiche Zielzellen zu verteilen^3,17. Im Gegensatz dazu erzeugen Th-Lymphozyten wie Jurkat-Zellen einen stabilen, langjährigen IS (von 10-30 min bis stunden), da dies sowohl für die richtungsweisende als auch für die unaufhörliche Sekretion von stimulierenden Zytokinen notwendig zu sein scheint^3,17. Die Zytokine sind auch in sekretonischen Vesikeln eingeschlossen und einige von ihnen (d.h. IL-2, IFN-) erleben polarisierten Transport zum IS¹⁷ und Sekretion. Ein wesentliches Merkmal des IS ist die Bildung von explorativen, schwachen und vorübergehenden Kontakten zwischen der T-Zelle und dem APC (Video 1), die eine stärkere Interaktion und die Etablierung eines reifen IS erzeugen können, vorausgesetzt, dass die TCR die cognate Antigen-MHC-Komplexe identifiziert und geeignete kostimulierende Verbindungen hergestellt werden⁵. Sowohl der Beginn der ersten Kontakte als auch die Gründung eines reifen, völlig produktiven IS sind von Natur aus stochastische, schnelle und asynchrone Prozesse^5,18. Darüber hinaus gibt es eine knappe Häufigkeit bei der Erstellung von Zell-zu-Zell-Konjugaten¹⁹, die eine Herausforderung für bildgebende Verfahren darstellen können (siehe Ergebnisse und Diskussionsabschnitte).

Eine weitere Hauptherausforderung bei der Untersuchung der Polarisation des Mikrotubuli-Organisationszentrums (MTOC) und des sekretonischen Granulats in T-Lymphozyten ist, dass der gesamte Prozess schnell ist (Sekunden bis wenige Minuten), insbesondere in CTLs. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen standen die meisten frühen Ansätze einer Endpunktstrategie gegenüber, bei der APC/Zielzellen und T-Lymphozyten gemeinsam gemischt und durch niedrige Geschwindigkeit konifugaliert werden, um die Zell-zu-Zell-Konjugatbildung zu begünstigen, die für mehrere Minuten inkubiert, fixiert und anschließend für die Verlagerung von MTOC und/oder sekretotrien Vesikeln in Richtung IS²⁰. Dieser Ansatz hat zwei wesentliche Einschränkungen: Es wurden keine lebhaften Daten zum Menschenhandel erreicht, und es wurden hohe Konzentrationen von MTOC/Sekretologiegranulatpolarisation erreicht, wahrscheinlich aufgrund des stochastischen Charakters des IS-Establishments¹⁸. Darüber hinaus ist jede Korrelation zwischen TCR-stimulierten, anfänglichen Signalereignissen (d. h. intrazellulärekalziumsteigt, Aktin-Reorganisation) und sekretoretoher Vesikelpolarisation problematisch zu untersuchen. So verbinden sich zwingende Bestimmungen für eine angemessene Bildgebung des IS in lebenden Zellen, um die Zell-zu-Zell-Konjugatmaterialisierung zu verbessern, die Erzeugung des IS zu synchronisieren und, wenn möglich, die Etablierung von zellulären Konjugaten an definierten XY-Feldern und Z-Positionen zu gewährleisten. Es wurden mehrere Strategien entwickelt, um all diese Probleme zu vermeiden. Es liegt aunter im Rahmen dieses Papiers, diese Methoden, ihre Vorteile und Schwächen zu erläutern. Bitte beachten Sie die zuvor veröffentlichten Rezensionen zu diesen wichtigen Punkten^1,4,5,21.

Die Tatsache, dass IS von Th-Lymphozyten hergestellt werden, sind langlebig, und der Umstand, dass in Th Lymphozyten das MTOC, Lymphokin-haltige sekretorische Granulate und MVB dauern von mehreren Minuten bis zu Stunden zu bewegen und anddocken an der IS²² macht die Th-APC IS ein idealer Kandidat für die Bildgebung mit dem Protokoll hier beschrieben beschrieben.

Protocol

1. Vorbereitung von Dias, um Raji-Zellen zu haften

1. Fügen Sie 150 l Fibronectin (100 g/ml) pro Brunnen zu einem 8-Mikrowell-Kammerschlitten (Kunststoff-Bodenkammerschlitten) hinzu und inkubieren Sie es 30 min bis 1 h bei 37 °C. Dieses Adhäsionssubstrat ermöglicht die Bindung von Raji-Zellen an den Brunnenboden (Schritt 2), die Bildung lebender Konjugate mit Jurkat-Zellen (Schritt 4) und die Zeitraffermikroskopie-Erfassung (Schritt 6) und ist danach auch mit der optionalen Paraformaldehyd (PFA)-Fixierung (Schritt 7) kompatibel.
   HINWEIS: Für die Acetonfixierung verwenden Sie Glasbodenkammerschlitten und Poly-L-Lysin (20 g/ml) anstelle von Fibronectin, da Aceton Kunststoff auflösen. Der 8 Mikrowell-Kammerschlitten (1 cm² Well, 300 l maximale Lautstärke) oder gleichwertig ist ein flexibles und geeignetes Format.
2. Saugen Sie Fibronectin mit einer automatischen Pipette von 200 l an und waschen Sie jeden Brunnen mit 200 l PBS für 2 min mit sanftem Schütteln. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal. Die Kammerrutsche kann in dieser Phase mit PBS für 1-2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.

2. Haftung von Raji-Zellen an den Kammer-Dias und 7-Amino-4-Chlormethylcoumarin (CMAC) Kennzeichnung

1. Übertragen Sie 10 ml eines konfluenten (1-2 x 10⁶ Zellen/ml) Vorkultur von Raji-Zellen in ein 15 ml, V-Bodenrohr. Mischen Sie gut und verwenden Sie 10 l, um die Zellen auf Neubauer-Kammer oder gleichwertig zu zählen.
2. Zentrifugieren Sie die restlichen Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
3. Das Zellpellet in einem warmen Gesamtkulturmedium (RPMI 1640 ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin) bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml vorsichtig wieder aufsetzen. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
   ([ ]_{anfangs x} V_initial = [ ]_final x V_final), wobei [ ]_initial die anfangse Zellkonzentration darstellt, V_initial = Anfangsvolumen der Zellsuspension, [ ]_endg. = endgültige Zellkonzentration, V_endgültig = Endvolumen der Zellsuspension.
   HINWEIS: Abhängig von der Zellkonzentration der Startkultur ist es möglich, mehr Zellen als benötigt zu sammeln, aber es ist wichtig, die verbleibenden Zellen in Kultur (37 °C) bis zum Ende des Experiments zu erhalten, um potenzielle Probleme zu vermeiden (siehe Schritt 2.6).
4. Label Raji Zellen für ihre Identifizierung während der synaptischen Konjugatbildung zu ermöglichen. In diesem Experiment wird die 7-Amino-4-Chlormethylcoumarin (CMAC)-Kennzeichnung in Schritt 2.4.2 durchgeführt.
   1. Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Raji-Zellen im Kulturmedium auf eine 2 ml-Röhre. Für den 8-Mikrowell-Kammerschlitten werden insgesamt 1,6 ml der Zellsuspension benötigt (200 l pro Brunnen).
   2. Fügen Sie CMAC zu einer Endkonzentration von 10 m hinzu. Halten Sie die Zellen im Dunkeln, indem Sie das Rohr mit Aluminiumfolie bedecken, da CMAC lichtempfindlich ist. Pro 1 cm² Brunnen werden 200 l mit 2 x 10⁵ Raji-Zellen benötigt. Wenn also 8 Brunnen vorbereitet werden müssen, sind 1,6 x 10⁶ Raji-Zellen erforderlich.
      HINWEIS: Die Kennzeichnung von Raji-Zellen mit Zell-Tracker blau (CMAC, UV-Erregung und blaue Emission) unterscheidet sie von Th-Zellen, wenn die synaptischen Konjugate gebildet werden. Dieser Farbstoff ist mit PFA- und Acetonfixativen kompatibel und ermöglicht weitere Immunfluoreszenzverfahren. Versuchen Sie, Lichtexposition zu vermeiden. Die Kennzeichnung von Raji-Zellen in einem Pool mit CMAC gefolgt von Resuspension vor der Haftung der Raji-Zellen zu den Fibronectin-beschichteten Kammerrutschen sorgt für die homogene Kennzeichnung von Raji-Zellen mit CMAC zwischen verschiedenen Brunnen.
5. CMAC-gefärbte Zellen aussetzen und nach Demehnung des PBS in der Kammerrutsche ab Schritt 1.2. 200 l der Zellsuspension auf jeden Brunnen der in Schritt 1.1-1.2 hergestellten Fibronectin-beschichteten Kammerschlitten übertragen. Inkubieren Sie die Kammerrutsche bei 37 °C, 5%_CO2 für 30 min-1 h.
   HINWEIS: Die Haftung und CMAC-Beschriftung erfolgt gleichzeitig bei diesem Schritt und das spart Zeit. Bitte beachten Sie, dass Raji-Zellen schnell Sediment und Vorsicht muss genommen werden, um eine homogene Konzentration in der Zellsuspension vor der Aussaat zu halten. Es ist nicht notwendig, CMAC in diesem Stadium durch Zentrifugation zu waschen, da CMAC Waschen wird leichter bei Schritt 2.7 durchgeführt werden (wenn die beschrifteten Raji-Zellen sind bereits an den Kammerrutschen haftet). Da CMAC in der Zellsuspension in großem Überschuss vorhanden ist, ist der blaue Fluoreszenzhintergrund zu hoch, um die blau gefärbten Zellen zu unterscheiden. Überprüfen Sie die CMAC-Fluoreszenz in Schritt 2.7 nach dem CMAC-Waschen.
6. Stellen Sie sicher, dass Raji-Zellen durch sanftes Schütteln der Kammerrutschen am Mikroskop am Boden der Brunnen haften bleiben. Stellen Sie sicher, dass die Zellen Lücken untereinander anzeigen und nicht konfluent sind(Abbildung 1, mittlerer Bereich). 50-60% des Zellzusammenflusses ist angemessen.
   1. Wenn die meisten Zellen effizient am Kammerschlitten haften und keine Zelllücken beobachtet werden, waschen Sie jeden Brunnen mit warmem komplettem Medium und setzen Sie das Medium mit einer automatischen Pipette von 200 L wieder auf, um den Zellüberschuss abzulösen. Überprüfen Sie die Einmündung nach jedem Resuspensionsschritt.
   2. Wenn die Zellen nicht haften, wiederholen Sie den Haftschritt erneut und erhöhen die Haftzeit und/oder die Zellenzahl.
      HINWEIS: Hier kann angehalten werden, die Kammerrutsche bei 37 °C, 5%_CO2 über Nacht (O/N) inkubiert und am nächsten Tag mit dem Protokoll fortgesetzt werden. Bitte bestätigen Sie am nächsten Tag, dass Raji-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie haftenzundigt und CMAC-gekennzeichnet bleiben.
7. Waschen Sie jeden Brunnen wieder sorgfältig mit warm ergänztem RPMI, um überschüssige cMAC zu beseitigen und mit dem Fluoreszenzmikroskop auf blaue Emission zu überprüfen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Um die Verwendung von Tauchöl (klebrig und zähflüssig) und hohen numerischen Blendenölobjektiven zu vermeiden, können extralange (d. h. 20x- oder 40x)-Objektive verwendet werden, um die CMAC-Kennzeichnung mit dem Fluoreszenzmikroskop schnell zu überprüfen.

3. Puls von CMAC — Beschriftete Raji-Zellen mit Staphylokokken-Enterotoxin E

1. Staphylokokken-Enterotoxin E (SEE, 1 g/ml) zu jedem Brunnen hinzufügen. SEE kann bequem in Zellkulturmedium (Arbeitslösung bei 100 g/ml) aus den SEE-Gefrorenen Beständen (1 mg/ml in PBS) verdünnt werden. Verwenden Sie 2 l der 100-fachen Arbeitslösung pro 200 L Mikrowell.
   ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe für diesen Schritt und entsorgen Sie die verwendete Spitze in die Biohazard-Box.
2. Inkubieren Sie die Kammerrutsche bei 37 °C, 5%_CO2 für mindestens 30 min. Der SEE-Effekt dauert mindestens 3-4 h.
   HINWEIS: SEE kann den Brunnen bei Bedarf zu unterschiedlichen Zeitpunkten hinzugefügt werden, wenn unterschiedliche Zeitraffer-Setups geplant sind (Schritt 5) und/oder abhängig vom Startzeitpunkt für die Endpunktexperimente (Schritt 6).

4. Vorbereitung von Jurkat-Zellen

1. Verwenden Sie für dieses Experiment eine zuvor wachsende Kultur von Jurkat-Zellen (1-2 x 10⁶ Zellen/ml). Verwenden Sie Zellen aus einem Standard-Kulturkolben oder aus einer früheren Transfektion nach Standard-Elektroporationsprotokollen, wie zuvor beschrieben²³. Die Transfektion von Jurkat-Zellen ermöglicht die Zeitraffer-Visualisierung des Verkehrs von sekretonierenden Granulaten in lebenden Zellen. Wenn beispielsweise GFP-CD63 (ein Marker von MVB) ausgedrückt wird, kann die Bewegung von GFP-CD63-verzierten Vesikeln aufgenommen werden (Video 1).
2. Beobachten Sie die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop. Wenn ein Überschuss an abgestorbenen Zellen (>20-30%) werden beobachtet, führen Ficoll Dichte Gradientzentrifugation mit^{Standardprotokollen 24}, um den Überschuss der abgestorbenen Zellen (tote Zellen weisen eine höhere Dichte als lebende Zellen) vor der Verwendung zu beseitigen (siehe Diskussion).
3. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Rohr, ein V-Bodenrohr, und verwenden Sie 10 l für die Zählung mit Hämozytometer.
4. Zentrifuge die verbleibenden Zellen, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit der gleichen Konzentration wie Raji-Zellen (1 x 10⁶/ml) mit frischem, warmem Kulturmedium. Befolgen Sie die Schritte 2.2-2.3.
5. Bewahren Sie die Jurkat-Zellen in Kultur (37 °C, 5% CO₂) auf, während Sie auf Schritt 4 warten.
   HINWEIS: Bei der zweiten Option (Transfektion) wird die Anzahl der lebenden Zellen viel niedriger sein als in der ersten. Erwägen Sie daher, ein höheres Anfangszellkulturvolumen zu verwenden, um genügend Zellen für das Experiment zu haben. Von 10 x 10⁶ Jurkat-Zellen pro Elektroporationsküvette und Transfektion überleben nur 2-4 x 10⁶ Jurkat-Zellen nach 48 h Transfektion und einige dieser Zellen gehen während des Ficoll-Schritts verloren. So reicht eine Elektroporationsküvette in der Regel aus, um die haftenden SEE-gepulsten Raji-Zellen aus 8 Mikrobrunnen herauszufordern (1,6 x 10⁶ transfizierte Jurkat-Zellen erforderlich).

5. Co-Seeding von Raji und Jurkat Zellen

1. Nehmen Sie die Kammergdias mit den CMAC-beschrifteten, SEE-gepulsten, haftenden Raji-Zellen aus dem Inkubator ab Schritt 3.2. Es ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht notwendig, den CMAC zu waschen, da dies zuvor in Schritt 2.7 geschehen ist.
2. Saugen Sie sorgfältig das Kulturmedium jedes Brunnens, einer nach dem anderen, aus einer Ecke des Brunnens mit einer automatischen 200-L-Pipette. Lassen Sie das Medium im Brunnen nicht vollständig austrocknen.
3. Ersetzen Sie das Medium sofort durch 200 l resuspendierte Jurkat-Zellen im Zellkulturmedium (1 x 10⁶/ml), die in Schritt 4.5 hergestellt werden. Wenn Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt wird, gehen Sie sofort nach diesem Schritt zu Schritt 6, da Jurkat-Zellen dazu neigen, sich sehr schnell zu Sedimenten zu entwickeln und synaptische Konjugate zu bilden. Der Einfachheit halber sollten die Mikrobrunnen, die SEE-gepulste, haftende Raji-Zellen enthalten, die in diesem Stadium keine Aussaat mit Jurkat-Zellen erhalten, mit Zellkulturmedium bis zur anschließenden Herausforderung mit Jurkat-Zellen erhalten bleiben. Dies ermöglicht flexibel eine nachfolgende Herausforderung mit Jurkat-Zellen für zusätzlichen Zeitraffer oder umgekehrte kinetische, Endpunkt-Experimentelle Ansätze.
4. Wenn ein Zeitraffer ausgeführt wird, fahren Sie schnell mit Schritt 6 fort. Dabei handelt es sich um die Kokultur für 1-2 h auf dem Mikroskop-Bühneninkubator oder gleichwertig bei 37 °C, 5%_CO2, um die synaptische Konjugatbildung und gleichzeitige Bildaufnahme zu ermöglichen. Wenn Endpunktanalyse, aber kein Zeitraffer, vorgesehen ist, überprüfen Konjugatbildung nach der Co-Kultur-Periode mit dem Mikroskop (wie in Abbildung 1) vor der Fixierung der Zellen (Schritt 7).

6. Zeitraffer-Bildgebung aufkommender synaptischer Konjugate

1. Bereiten Sie das Mikroskop und die Inkubationskammer vor der Bildgebung vor. Für das in Video 1 gezeigte Beispiel sind die detaillierten Mikroskopieeinstellungen in Abbildung 2dargestellt.
   HINWEIS: Wenn ein Zeitrafferexperiment geplant ist, sollten alle Mikroskopeinstellungen und Ergänzungen (Umgebungszellkulturkammer, etc.) vorbereitet werden, bevor die Jurkat-Suspension mit haftenden Raji-Zellen in die Kammerrutsche gesetzt wird. Die folgenden Schritte werden für einkommerziellesMikroskop beschrieben ( Tabelle der Materialien ). Es kann jedoch jedes invertierte Fluoreszenzmikroskop verwendet werden, das mit einem Zellkultur-Inkubator ausgestattet ist.
   1. Verwenden Sie ein Mikroskop mit einer 60-fachen Öl-Immersion, hohe numerische Blende bei der Abbildung polarisierten Verkehrs.
   2. Stellen Sie sicher, dass das automatische Fokussystem eingeschaltet ist, und passen Sie den Offset an, um die Raji-Zellen zu fokussieren, die an die untere Oberfläche gebunden sind. Siehe Abbildung 1, Video 1 und Video 2.
2. Nach Jurkat Ergänzung zu jedem Brunnen enthält die haftenden Raji-Zellen in Schritt 5.3, schnell lokalisieren Sie die Mikrowell-Kammer-Dia auf dem vorgeheizten (1-2 h) Mikroskop-Stadium-Inkubator (d.h. OKOlab) und wählen Sie einige XY-Positionen mit dem Mikroskop, Felder, in denen es ist eine aufkommende IS-Formation aufzeichnen, die beispielsweise durch eine Jurkat-transfizierte Zelle entstanden ist, die in den Mikroskopfokus fällt.
3. Verwenden Sie einen vorgeheizten Mikroskop-Bühneninkubator, da beobachtet wurde, dass ein temperaturstabilisiertes Stadium stabile X-, Y-,Z-Positionen beibehält. Kriterien für ein praktisches XY-Feld sind: gut fokussierte und nicht konfluente Raji-Zellen (d. h. die Anzeige von Lücken zwischen den Zellen) und das Vorhandensein von transfizierten Jurkat-Zellen (dies kann durch die Kombination von Durchlässigkeit und UV- oder GFP-Kanälen überprüft werden). Jurkat-Zellen werden sehr schnell (wenige Minuten) auf der Kammerrutsche sedimentieren, und die Chancen, entstehende Synapsen abzubilden, werden mit der Zeit abnehmen (Abbildung 1). Es ist möglich, das Experiment entweder nach dem definierten Zeitraffer zu beenden oder zum Schritt 7 zu gehen und die Konjugate für nachfolgende Immunfluoreszenz und Analysen zu fixieren.
   HINWEIS: Es ist möglich, bis zu 16 verschiedene Mikroskopfelder aus bis zu 4 verschiedenen Mikrobrunnen für die gleichzeitige, multi-well Zeitraffererfassung mit der richtigen zeitlichen Auflösung (1-2 min pro Frame) auszuwählen. Die Begrenzung hängt sowohl von der Anzahl als auch von der Intensität (beeinflussender Kameraexposition) der verschiedenen fluorchromen abbilden den verschiedenen Fluorchromen ab (abhängig von der Anzahl der exprimierten fluoreszierenden Proteine, abgesehen von CMAC). Eine Möglichkeit, die Bildrate zu erhöhen, ist die Aufnahme für den CMAC-Kanal in nur einem von jedem "n" Zeitrahmen für GFP (d.h. n = 8, wie in Abbildung 2dargestellt ), da Raji-Zellen am Brunnenboden haften und sich nicht leicht als Jurkat-Zellen bewegen. Darüber hinaus kommt dies der Zelllebensfähigkeit zugute, da eine häufige UV-Lichtexposition die Zellen schädigen kann. Versuchen Sie, die Zeitbildrate auf 1 Frame pro 1 Minute oder weniger einzustellen (d. h. 20 s pro Frame in Video 1, Abbildung 2), da die Polarisation von MVB ein paar Minuten bis Stunden dauert. Ein Mikroskop, das mit einem motorisierten Epifluoreszenzrevolver und geeigneten Bandpass-Fluoreszenzfiltern oder Äquivalenten ausgestattet ist, ist für diese Mehrkanalaufnahme erforderlich.

7. Endpunktbildung von synaptischen Konjugaten und Fixierung

1. Wenn nur ein Endpunktexperiment geplant ist (1-2 Stunden Inkubation, um eine synaptische Konjugatbildung zu ermöglichen), inkubieren Sie das Kammergleiten bei 37 °C, 5%_CO2 für 1-2 h. Überprüfen Sie die Konjugatbildung nach der Kulturperiode (wie in Abbildung 1) und fixieren Sie anschließend die Konjugate mit Aceton oder PFA (Fixierung hängt von den Antigenen und Antikörpern ab, die in den nachfolgenden Fluoreszen verwendet werden). In diesem Fall erfordert die Inkubation keinen Mikroskop-Bühneninkubator. Ein Beispiel finden Sie in Video 3.
2. Um die Zellen zu fixieren, waschen Sie den Brunnen durch sanftes Schütteln mit warmem RPMI (37 °C) Medium ohne FCS (Albumin aus Serum kann mit Acetonfixierung ausfallen). Aspirieren und fügen Sie jedem Brunnen 200 l PFA oder vorgekühltes Aceton hinzu. Inkubieren Sie die Kammerrutsche bei Raumtemperatur (RT) bzw. auf Eis für 20 min.
   HINWEIS: Für die Acetonfixierung das Aceton bei -20 °C vorkühlen und die Kammerbeigin bei 4 °C vorkühlen. Entfernen Sie Kunststoffdeckel, wenn Aceton verwendet wird, um die Zellen zu fixieren, die in den 8 gut Glasbodenkammerrutschen kultiviert werden.
3. Waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit PBS und fügen Sie 200 L Löschlösung (PBS, 50 mM NH₄Cl). Inkubieren Sie die Kammerrutsche bei 4 °C.
   HINWEIS: In diesem Stadium kann die Kammerrutsche mindestens einen Monat bei 4 °C bleiben, bevor das Immunfluoreszenzprotokoll, wie beschrieben^8,durchgeführt wird. Der Deckel verhindert Verdunstung.

8. Bildverarbeitung

1. Führen Sie die Dekonvolution nach der Erfassung (d. h. Huygens-Dekonvolution oder gleichwertig, Tabelle der Materialien)von Zeitrafferserien und/oder Standbildern fester Zellen durch. Deconvolute durch den Einsatz einer geeigneten Software (d.h. mit der optischen Option "Weitfeld" in Huygens) und die richtigen optischen Parameter. Die Dekonvolution erfordert für die Bildverarbeitung der gemessenen Punktstreufunktion (PSF) des Mikroskops⁴.
2. Alternativ können Sie die idealisierte PSF-Software berechnen, indem Sie die optischen Parameter, die zu den Metadaten aus den Mikroskopdateien gehören, automatisch laden. Diese optischen Parameter umfassen Fluorchromwellenlänge, Brechungsindex, numerische Blende des Objektivs und die bildgebende Technik (konfokale, weiträumige usw.) ⁴.
3. Anschließend verwendet die Imaging-Software die PSF und diverse Dekonvolution-Algorithmen (d.h. QMLE und CMLE in Huygens-Software) in einem schrittweisen akkumulativen Berechnungsprozess, dessen Ergebnisse bei Bedarf durch den Anwender kontinuierlich visualisiert und gestoppt (oder wiederaufgenommen) werden können. In diesem Stadium kann der Benutzer die Anzahl der Faltungen und/oder das Signal-Rausch-Verhältnis ändern und die Dekonvolution wieder aufnehmen. Die Dekonvolution-Software funktioniert gut mit Zeitrafferserien (X,Y,T) (Video 2) und Z-Stacks (X,Y,Z) (Video 3). Die dekonvolutierten Kanäle wurden anschließend mit dem CMAC, dem Rohkanal, verschmolzen, da zytosolische, diffuse Fluorchrome durch Dekonvolution^4,9nicht verbessert werden.

Results

Wir haben das beschriebene Protokoll befolgt, um Jurkat-Raji Immunsynapse Konjugate zu erzeugen und die frühen Stadien der IS-Bildung richtig abzubilden. Unser Ziel war es, die frühen Ansätze zu verbessern²⁰ zuvor gefolgt, um die Polarisierung des MTOC und der sekretonierenden Maschinen gegenüber dem IS zu studieren. Diese Ansätze basierten auf einer Endpunktstrategie, die keine Bildgebung der IS-Formation oder der frühen synaptischen Ereignisse erlaubte, da in diesen Strategien die IS-Bildung obligatorisch im Pellet gemischter, zentrifugierter Zellen, aber nicht auf einem Mikroskop stattfand. Unser Protokoll wurde entwickelt, um diesen Hauptvorbehalt zu vermeiden, da der Ansatz auf der Verwendung einer geeigneten Zellkonzentration (Schritte 2 und 3) beruhte, um die Bildung der Zell-zu-Zelle IS-Konjugate auf den eigenen Mikroskopkammer-Dias (8 Mikro-Wellkammerschlitten) zu begünstigen, die auf dem vorgeheizten Mikroskop-Bühnen-Inkubator (in Schritt 4) montiert waren. Diese Strategie induziert die IS-Formation, gleichzeitig zur Zeitraffer-Bildaufnahme (Video 1).

Abbildung 1 stellt synaptische Jurkat-Raji-Konjugate dar, die nach dem Protokoll erhalten wurden (Schritt 5.2). Das Bild stellt den ersten Frame eines repräsentativen Zeitrafferexperiments dar. 2 x 10⁵ Raji-Zellen und 2 x 10⁵ Jurkat-Zellen wurden einem 1 cm² Brunnen hinzugefügt. Das obere Panel zeigt den Übertragungskanal, das mittlere Panel besteht aus CMAC (blau) Kanal (Raji-Zellen), und das untere Panel zeigt sowohl Transmissions- als auch CMAC-zusammengeführte Kanäle. Gelbe Pfeile kennzeichnen einige synaptische Konjugate als Referenz, während grüne Pfeile auf synaptische Konjugate hinweisen, die von einer Jurkat-Zelle und mehreren Raji-Zellen (komplexe Konjugate) hergestellt werden. Abnehmende Zellkonzentrationen (10⁵ oder weniger Zellen im 1 cm² Brunnen) werden die Bildung komplexer zellulärer Konjugate umgehen, aber es gibt möglicherweise nicht genügend Zellkonjugate für die nachfolgende Analyse des polarisierten Verkehrs (siehe unten), was wiederum auch die Chancen verringert, entstehende synaptische Konjugate zu finden und abzubilden.

Abbildung 2 zeigt Screenshots, die den Bildparametern entsprechen, die für die gleichzeitige Erfassung der beiden verschiedenen Fluorchrome (CMAC und GFP-CD63) mit entsprechender Software (d. h. NIKON NIS_AR) in einem repräsentativen Zeitrafferexperiment entsprechend Video 1verwendet werden.

Video 1 (Immunologische Synapsen, roh) stellt eine Jurkat-T-Lymphozyten dar, die GFP-CD63 (ein Marker von multivesikulären Körpern-MVB, grüne Vesikel) und die Bildung einer doppelten Synapse zwischen 1 Jurkat-Zelle und 2 Raji-Zellen, die mit CMAC gekennzeichnet sind, in Blau (einer von ihnen erfährt sich einer Verschlingenschaft) ausdrückt. Die gleichzeitige Bewegung von MVB innerhalb der Jurkat-Zelle in Richtung Synapsenbereiche wurde aufgezeichnet (Aufnahmebildrate = 1 Frame alle 20 Sekunden für GFP-CD63; Videowiedergabegeschwindigkeit = 2 Frames pro s). Die synaptischen Konjugate wurden nach dem oben beschriebenen Protokoll (Schritt 6.2) erhalten und abgebildet, das die Abbildung aufkommender Synapsen ermöglichte (Video 1). Die gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenzkanäle GFP-CD63 und CMAC erfolgte mit einer geeigneten Software (z.B. NIS-AR, Materialtabelle). Das Video stellt die Rohdaten eines repräsentativen Zeitrafferexperiments dar. Das automatische Fokussystem wurde mit einem geeigneten Offset in Bezug auf die Raji-Zellen definiert, die an den Glasboden gebunden sind, um einen stabilen Fokus entlang des Experiments zu gewährleisten.

Video 2 (immunologische Synapsen, nach Dekonvolution) entspricht Video 1, aber die Dekonvolution der GFP-CD63 Fluoreszenzkanalbilder wurde mit einer geeigneten Dekonvolution-Software (d.h. Huygens) unter Verwendung der optischen Option "Weitfeld" und der richtigen optischen Parameter (Schritt 8) durchgeführt. Dieser dekonvolutierte Kanal wurde anschließend mit dem CMAC, dem Rohkanal, verschmolzen. Die Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses und der Schärfe des Bildes ist offensichtlich. Die Dekonvolution wurde, wie oben beschrieben, nach der Übernahme durchgeführt. Spezifische Informationen zur Dekonvolution-Software finden Sie unter⁴.

Video 3 (immunologische Synapse, nach Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung) stellt einen Z-Stack (z-Schrittgröße = 0,8 m, 5 Frames) eines festen IS-Konjugats nach dem Schritt 6 des Protokolls dar (Acetonfixierung). Nach der Fixierung wurde die Immunfluoreszenz nach den Standardprotokollen²⁵ durchgeführt, indem Phalloidin verwendet wurde, um das F-Actin (grün), Anti-CD63 zur Visualisierung von MVB (Magenta), Anti-A-Tubulin zur Visualisierung von MTOC (rot) zu visualisieren. CMAC (blau) beschriftet die Raji-Zelle. Anschließend wurde das Konjugat durch Epifluoreszenz abgebildet und mehrere Kanäle mit der optischen Option "Weitfeld" und den richtigen optischen Parametern (Schritt 7) dekonvolutiert. Die dekonvolutierten Kanäle wurden anschließend mit dem CMAC, dem Rohkanal, verschmolzen, wie in den verschiedenen Panels angegeben (CMAC plus Transmittance-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus Anti-CD63 und CMAC plus Anti-A-Tubulin). Weißer Pfeil beschriftet die Synapse, während grüner Pfeil den MVB und der gelbe Pfeil den MTOC beschriftet. Die detaillierte Quantifizierung der MVB- und MTOC-Polarisation wurde an anderer Stelle erläutert²⁵.

Der hier vorgestellte Ansatz umfasst die Bildung von Zell-zu-Zell-Konjugaten und gleichzeitig die Zeitraffererfassung durch Weitfeldfluoreszenzmikroskopie (WFFM) gefolgt von Bildverarbeitung (Nacherfassungsdekonvolution). Diese Taktik verbesserte das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der Bilder, verbesserte ihre zeitliche Auflösung und ermöglichte die synchronisierte Erfassung mehrerer Fluorchrome in neu entstehenden synaptischen Konjugaten⁴. Darüber hinaus ist das Protokoll gut mit nachfolgenden Endpunkt-Zellfixierungsmethoden (Paraformaldehyd, Aceton oder Methanol) abgestimmt, die eine weitere Immunfluoreszenzfärbung und Analysen ermöglichen würden²⁵ (Video 3). Dieses Protokoll ist auch mit der konfokalen Lasermikroskopie und anderen modernen Mikroskopietechniken kompatibel.

Abbildung 1: Repräsentatives Doppelformat-Mikroskopiefeld von synaptischen Konjugaten. Das Bild stellt den ersten Frame eines repräsentativen Zeitrafferexperiments nach dem Protokoll dar. Das obere Panel zeigt den Übertragungskanal, den mittleren Panel-CMAC-Kanal (Raji-Zellen) und das untere Panel beide zusammengeführten Kanäle. Gelbe Pfeile beschriften einige synaptische Konjugate als Referenz. Grüne Pfeile zeigen komplexe synaptische Konjugate (d. h. eine Jurkat-Zelle, die Synapsen mit mehr als einer Raji-Zelle aufbaut). Erfasst mit einem 40x EWD (0.6 NA) Objektiv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Einstellungen des Zeitraffermikroskops. Das Bild entspricht mehreren Screenshots, die den Bildparametern entsprechen, die für die gleichzeitige Erfassung der beiden verschiedenen Fluorchrome (CMAC und GFP-CD63) mit entsprechender Software (d.h. NIKON NIS_AR) in einem repräsentativen Zeitrafferexperiment entsprechend Video 1verwendet werden. Jeder Frame für GFP-CD63-Kanal wurde alle 20 s aufgenommen. Nur ein Frame für einen UV-Kanal von acht Bildern für gfP-Kanal wurde erfasst, um die Zelllebensfähigkeit entlang des Experiments zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Immunologische Synapsen einer Jurkat-Zelle, die GFP-CD63, Rohdaten exzessiiert. Raji B-Zellen, die mit Zelltracker blau (CMAC, blau) gekennzeichnet waren, wurden 30 min lang mit SEE gepulst und Synapsen mit Jurkat-Zellen, die GFP-CD63⁸ exdrücken. Zeitraffer entsprechend GFP-CD63- und CMAC-Kanälen wurden erfasst (20 s pro Frame; Videowiedergabegeschwindigkeit = 2 Frames pro s) und ein repräsentatives Beispiel wird gezeigt. Erfasst mit einem 60x PLAN APO (1.4 NA) Objektiv. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Video 2: Immunologische Synapsen einer Jurkat-Zelle, die GFP-CD63 nach Dekonvolution exektioniert. Wie Video 1, aber Bilder wurden mit einer Dekonvolution-Software dekonvolutiert. Das verbesserte Signal-Rausch-Verhältnis und die erhöhte Schärfe durch die Eliminierung von Verunreinigungen aus der Fokusfluoreszenz sind offensichtlich. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Video 3: Feste und immunbefleckte immunologische Synapse. Das Bild zeigt ein repräsentatives festes synaptisches Konjugat nach Schritt 7 des Protokolls und anschließender Immunfluoreszenz. CMAC (blau) beschriftet Raji-Zellen, Transmission (TRANS), um die synaptischen Konjugat (weißer Pfeil), Phalloidin-Etiketten F-Actin (grün), Anti-CD63-Etiketten MVB (Magenta, grüner Pfeil) und Anti--Tubulin-Etiketten MTOC (roter, gelber Pfeil) anzuzeigen. Diese Kanäle wurden durch Epifluoreszenz abgebildet, dekonvolutiert und wie angegeben verschmolzen. Das Video enthält einen Z-Stack (Z-Schrittgröße = 0,8 m, 5 Frames). Weißer Pfeil beschriftet den synaptischen Kontaktbereich, während der grüne Pfeil den MVB und der gelbe Pfeil den MTOC beschriftet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Discussion

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass nicht alle Synapsen ideal senkrecht zur optischen Achse ausgerichtet sind. Mit dieser Technik gibt es keine Möglichkeit, die ideale Ausrichtung für die Immunsynapse-Bildgebung vorherzusagen und/oder zu beeinflussen. Um dieses Problem zu beheben, schließen wir aus den nachfolgenden Analysen alle zufällig erfassten Synapsen aus, die schließlich nicht die idealen Kriterien erfüllen. Diese Synapsen sind opportunerweise nicht sehr häufig. Es ist jedoch möglich, diese Beschränkung mit mehreren experimentellen Ansätzen zu umgehen⁴.

Die polarisierte CD63-Freisetzung (Degranulation) kann durch andere komplementäre Techniken wie zelloberflächenfärbung von CD63 (CD63-Relokalisierung zur Zelloberfläche) in lebenden Zellen (nicht fixiert und nicht permeabilisiert) nach Schritt 6 und anschließendes Waschen und Fixieren, wie zuvor gezeigt^8,quantifiziert werden. Darüber hinaus können CD63-Freisetzungen auf Exosomen^8,9 und Exosomen-Quantifizierung durch Nanopartikel-Tracking-Analysen^9,25 durchgeführt werden. Diese Ansätze sind sicherlich mit unserem Protokoll kompatibel, vorausgesetzt, die Fixierung erfolgt nach der Zelloberflächenimmunofluoreszenz lebender Zellen.

Wir haben die ideale Anzahl von Zellen gefunden (für einen 1 cm² Brunnen in der 8-Well-Kammer-Dia) ist 4 x 10⁵ Zellen (2 x 10⁵ Raji Zellen und 2 x 10⁵ Jurkat Zellen), da sie effizient an der Unterseite des Brunnens haften. Die Bindungseffizienz an Kunststoff (mit Fibronectin) oder Glasboden (mit Poly-L-Lysin) Mikrorutschen ist in der Regel kein Problem. Höhere Zellzahlen dürfen keine Lücken zwischen den haftenden Zellen und in der Folge komplexe synaptische Konjugate erzeugen (Abbildung 1); Beide Situationen sind nicht wünschenswert, wenn einzelne Zell-zu-Zell-Konjugate beispielsweise in MTOC- oder sekretochen Granulatpolarisationsexperimenten abgebildet werden müssen. Eine geringere Anzahl von Zellen kann die Wahrscheinlichkeit verringern, Konjugate zu finden, insbesondere wenn transfizierte Jurkat-Zellen mit APC herausgefordert werden, um Synapsen zu erzeugen. Bitte beachten Sie, dass wir beobachtet haben, dass ein temperaturstabilisierter Stufeninkubator auf der X/Y-Stufe des Mikroskops vor dem Beginn des Protokolls (d. h. 1-2 h im Voraus zur Stabilisierung des Bühnen-/Mikroskop-Setups) stabile X-,Y-,Z-Parameter beibehält, was für die richtige Bildgebung entscheidend ist. Das automatische Fokussystem kompensiert schließlich kleine Z-Variationen.

Wenn bestimmte Gentransduktionstechniken wie Diepoporation verwendet werden, um fluoreszierende chimäre Proteine (d. h. GFP-CD63) in den Jurkat-Klonen(Video 1)auszudrücken, kann ein beträchtlicher Teil der Zellen nach der Elektroporation absterben. Dies kann ein Problem sein, da, obwohl abgestorbene Zellen keine Synapsen bilden, wenn sie über die lebenden, transfizierten Zellen hinaus sind, sie die Bildung von Konjugaten stören können, die von lebenden Th-Zellen gemacht werden. Wir haben festgestellt, dass die sorgfältige Eliminierung abgestorbener Zellen aus transfizierten Kulturen durch die Verwendung eines Dichtegradientenmediums nach Standardprotokollen vor dem Konjugatbildungsschritt tatsächlich die Chancen erhöhen kann, Konjugate richtig abzubilden. Darüber hinaus sind niedrige Transfeztionseffizienzen (<20%) kann ein wichtiger Vorbehalt sein, da dies, kombiniert mit einer moderaten Konjugat-Formation Effizienz (ca. 60%)²⁵, wird die Wahrscheinlichkeit verringern, Konjugate von transfekten Zellen gemacht zu finden. Dies ist kein Problem, wenn nicht transfizierte Zellen verwendet werden, um Konjugate in Endpunktexperimenten und anschließender Fixierung zu erhalten. Die 8 Mikrowell-Kammerschlitten sind mit herkömmlichen Immunfluoreszenzprotokollen kompatibel. Dies erhöht die Flexibilität des oben genannten Protokolls mit unterschiedlichen Zwecken. Die Fixierung mit Aceton kann ein Problem sein, das bei der Verwendung von Kammerschlitten mit Kunststoff-Boden-Brunnen zu berücksichtigen ist. Es gibt jedoch im Handel erhältliche 8 Mikrowell-Mikroskopkammerschlitten mit Glasböden, die mit der Acetonfixierung kompatibel sind. Entfernen Sie Kunststoffdeckel, wenn Aceton verwendet wird, um die Zellen zu fixieren, die in 8 Mikrowell Glasbodenkammer-Dias kultiviert werden.

Es wird empfohlen, das Mikroskop mit einer motorisierten XY-Stufe, einem motorisierten Epifluoreszenzrevolver und einem automatischen Fokussystem (z. B. Perfect Focus System) oder gleichwertigen Ergänzungen auszustatten. Wenn eine Multi-Well-Erfassung²⁵erforderlich ist, sorgt das automatische Fokussystem während des gesamten Experiments für einen stabilen Fokus. Frühere Erfahrungen zeigen, dass durch die Festlegung eines geeigneten Fokusoffsets auf die Raji-Zellen sowohl die Bewegung von T-Zellen (Video 1) als auch die Mikroskop-Bühne/Kammer-Diabewegungen in XY-Mehrpunktexperimenten kompensiert werden können. Dies ist in der Tat praktisch für Multiwell Zeitraffer-Capture.

Eine Schwarzweiß-, Panchromatische und gekühlte Charged Coupled Device (CDD) Kamera wurde verwendet, aber eine höherempfindliche, fluoreszenz wissenschaftliche Komplementär-Metall-Oxid-Halbleiter -Halbleiterkamera (sCMOS), da dies die Belichtungszeiten der Kamera verringert und die zeitliche Auflösung verbessert. Die kurzen Kamerabelichtungszeiten (Ranking von 100 ms bis 500 ms) in Kombination mit dem automatischen Fluoreszenzverschluss ermöglichen eine längere Zeitraffererfassung (bis zu 24 h) mit einer angemessenen Zeitauflösung (1 Frame pro Minute oder weniger, für bis zu 16 XY-Positionen) ohne signifikante Fluoreszenzbleichung und/oder Verlust der Zelllebensfähigkeit. Die motorisierte Stufe ermöglicht die Multi-Point-Aufnahme (XY) und erhöht die Chance, die entstehenden und sich entwickelnden Synapsen in der idealen Ausrichtung zu finden und abzubilden, ermöglicht aber auch die Bildaufnahme in Mehrwell-Kammerdias, wenn verschiedene Jurkat-Klone gleichzeitig konjugiert werden müssen²⁵. Eine hohe numerische Blende des Objektivs (d.h. 60x, 1.4) ist notwendig, um die besten Ergebnisse bei der Analyse des Verkehrs von sekretoreichen Granulaten zu erzielen.

Der RAJI-SEE-Jurkat stellt ein etabliertes immunologisches Synapsenmodell dar, das von einer Vielzahl von Forschern seit der ursprünglichen^Beschrieben1verwendet wurde. Wir haben unser Protokoll an dieses Modell angepasst, um die frühen Stadien der IS-Bildung richtig abzubilden. Unser Ziel war es, die frühen Ansätze zu verbessern²⁰ zuvor gefolgt, um die Polarisierung des MTOC und der sekretonierenden Maschinen gegenüber dem IS zu studieren. Es ist bemerkenswert, dass die konjugate mit diesem Protokoll produziert F-actin Reorganisation an der Synapse, Konfiguration einer kanonischen SMAC, gleichzeitig mit dem MVB polarisierten Verkehr²⁵. Diese entscheidenden Ereignisse wurden auch durch konfokale Mikroskopie analysiert und validiert²⁵.

Kinetische Unterschiede im polarisierten Verkehr gibt es zwischen verschiedenen IS-Typen. Zum Beispiel erfolgt der polarisierte Transport von lytischen Granulaten aus CTLs in Sekunden oder sehr wenigen Minuten, während mehrere Zytokin-haltige Vesikel aus Th-Lymphozyten von Minuten bis zu mehreren Stunden dauern. Diese zeitlichen Unterschiede müssen im Voraus berücksichtigt werden, um die beste Strategie zu entwerfen und den am besten geeigneten experimentellen und bildgebenden Ansatz auszuwählen, da für einige bildgebende Strategien (d. h. Laserscanning Konfokalmikroskopie (LSCM)) die Zeit ein begrenzender Faktor sein kann, da die Aufnahmezeit viel höher ist als die entsprechende Zeitauflösung (1 min oder weniger)⁴. Dies ist keine Einschränkung, wenn die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie (WFFM) wie im obigen Protokoll beschrieben verwendet wird. Da in CTLs die Polarisation von MTOC in Richtung synapse nur wenige Minuten dauert^3,6,17, verschiedene spezifische mikroskopische Ansätze, die sich von denen unterscheiden, die hier beschrieben werden (aber eine höhere räumliche und zeitliche Auflösung aufweisen), sind notwendig, um diese Synapsen^26,27richtig abzubilden, hauptsächlich wenn mehrere Mikroskopfelder (Multi-Point-Capture) abgebildet sind. Diese hochauflösenden, neuen Ansätze können auch für die Abbildung der Synapsen von Th-Lymphozyten genutzt werden, obwohl wirtschaftliche und/oder logistische Gründe (d.h. die Kernausrüstung, die für einige dieser bildgebenden Verfahren benötigt wird, 6-7-mal mehr kosten als die hier beschriebenen) sicherlich eine Einschränkung für diese hochmodernen Bildgebungsmethoden darstellen könnten⁴. Die Tatsache, dass IS von Th Lymphozyten gemacht sind langlebig, und der Umstand, dass in Th Lymphozyten die MTOC, die lymphokinhaltigen sekretorischen Vesikel und MVB dauern von mehreren Minuten bis zu Stunden zu transportieren und docken an die IS²², macht dieses Protokoll ein idealer, erschwinglicher Ansatz für die Abbildung der Th-APC IS.

WFFM in Kombination mit der Nachaufnahme von Image-Dekonvolution stellt einen interessanten Ansatz dar und unterstützt diese Strategie nicht nur aus wirtschaftlichen Gründen. Die intrinsische schlechte Auflösung in der Z-Achse (der wichtigste Vorbehalt der Technik) kann durch die Verwendung der Nachaufnahmebilddekonvolution⁴ verbessert werden (vergleiche Video 1 mit Video 2). Deconvolution verwendet einen berechnungsbasierten Bildverarbeitungsansatz, der das Signal-Rausch-Verhältnis und die Bildauflösung verbessern und²⁷ bis 2-mal kontrastieren kann, bis zu 150-100 nm in der XY-Achse und 500 nm in der Z-Achse⁴.

Die Verwendung von höherempfindlichen, hohen Auslesegeschwindigkeit und breitem Dynamikbereich, neue Fluoreszenz-sCMOS-Kameras werden die Qualität der Bilder verbessern und fluoreszenzbleichung reduzieren. Die Flexibilität des hier beschriebenen Zell-zu-Zell-Konjugationsprotokolls ermöglicht die Kombination des beschriebenen zellulären Ansatzes mit mehreren modernsten Mikroskopietechniken, sowohl in lebenden Zellen als auch in festen Zellen, und das erwartete Ergebnis. in der Tat unser Wissen über die immunologische Synapse verbessern.

Obwohl wir das Protokoll implementiert und validiert haben, indem wir einfach zu handhabende, gut etablierte Zelllinien verwenden, kann der Ansatz die Visualisierung physiologischerer Wechselwirkungen ermöglichen, wenn primäre T-Zellen und verschiedene Arten von Antigen-präsentierenden Zellen (wie dendritische Zellen von Makrophagen) verwendet werden⁵. In diesem Zusammenhang wurde dieses Protokoll auch erweitert und validiert, indem Superantigen (SEB)-gepulste Maus EL-4-Zelllinie als APC verwendet wurde, um primäre Maus-T-Lymphoblaste⁹herauszufordern. In der Tat primäre T-Lymphozyten, insbesondere CTLs, machten mehr kurzlebige und dynamische synaptische Kontakte (siehe Ergänzendes Video 8 in Bezug⁹) zu denen, die mit dem SEE-Raji und Jurkat Modell gesehen. Die Variabilität synaptischer Kontaktmodi kann am besten bei primären T-Zell-Wechselwirkungen mit dendritischen Zellen oder B-Zellen in zweidimensionalen In-vitro-Gewebeäquivalenten beobachtet werden, die auch mit diesem Protokoll aufgezeichnet und analysiert werden können. Darüber hinaus kann die Technik neben Superantigenen auch andere Arten von Synapsen abbilden. Zum Beispiel könnte es in einem TCR transgene, antigenspezifische T-Zell-Modell verwendet werden, zum Beispiel mit dem ovalbumin spezifischen murine OT1/OT2-System oder durch Transfektion von T-Zellen mit antigenspezifischen T-Zellrezeptoren. Dies eröffnet eine Vielzahl experimenteller Möglichkeiten für die unmittelbare Zukunft.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kamera Nikon DS-QI1MC	Nikon	MQA11550	Gekühlter Kamerakopf
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	Zelltracker blau
JURKAT Zellen	ATCC	ATCC TIB-152	Effektor T-Lymphozyten
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glasboden	IBIDI	Cat.No: 80826, 80827	Zellkultur und Zellbildgebung
Mikroskop NIKON Eclipse Ti-E	Nikon	NIKON Eclipse Ti-E	Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, voll motorisiert, ausgestattet mit Perfect Focus System (PFS) Option
Mikroskoptisch-Inkubator mit manuellem 3-Kanal-Gasmischer und Gasblasen-/Feuchtemodul	OKOLAB	H201-NIKON-TI-S-ER	Zellkulturatmosphäre
Raji-Zellen	ATCC	ATCC CCL-86	APC
RPMI Medium GIBCO	ThermoFisher Scientific	21875034	Nährmedium
Streptococcus Enterotoxin E (SEE)	Toxin Technology, Inc	EP404	Software für bakterielle Toxine
Huygens Essential	SVI	Huygens Essential	Image Dekonvolutionssoftware
Software ImageJ	NIH	Image J	Image
Software Nikon NIS-AR	Nikon	NIS-Elements AR	Software zur Bilderfassung und -analyse