Denne protokollen bilder både immunologiske synapse formasjon og den påfølgende polarisert sekretoriske trafikk mot immunologiske synapse. Cellular konjugater ble dannet mellom en superantigen-pulserende Raji celle (fungerer som en antigen-presentere celle) og en Jurkat klone (fungerer som en effektor hjelper T-lymfocytter).
Formålet med metoden er å generere en immunologiske synapse (IS), et eksempel på celle-til-celle Bøyning dannet av en antigen-presentere celle (APC) og en effektor hjelper T lymfocytter (th) celle, og for å spille inn bilder som tilsvarer de første stadiene av IS formasjon og påfølgende smugling hendelser (forekommer både i APC og i th cellen). Disse hendelsene vil til slutt føre til polarisert sekresjon på IS. I denne protokollen, Jurkat celler utfordret med Staphylococcus enterotoksin E (se)-pulserende Raji celler som en celle synapse modellen ble brukt, på grunn av nærheten til dette eksperimentelle systemet til den biologiske virkeligheten (th Cell-APC Synaptic konjugater). Tilnærmingen som presenteres her innebærer celle-til-celle Bøyning, time-lapse oppkjøp, Wide-Field fluorescens mikroskopi (WFFM) etterfulgt av bildebehandling (post-oppkjøpet deconvolution). Dette forbedrer signal-til-støy-forhold (SNR) av bildene, forbedrer Temporal oppløsning, gjør synkronisert oppkjøpet av flere fluorokromer i nye Synaptic konjugater og reduserer fluorescens bleking. I tillegg er protokollen godt matchet med endepunktet celle fiksering protokoller (paraformaldehyde, aceton eller metanol), som ville tillate ytterligere immunofluorescence farging og analyser. Denne protokollen er også kompatibel med laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi (LSCM) og andre State-of-the-art mikroskopi teknikker. Som en hoved advarsel, bare de T Cell-APC grenser (kalt IS grensesnitt) som var på rett 90 ° vinkel til fokus flyet langs Z-aksen kan være riktig avbildet og analysert. Andre eksperimentelle modeller eksisterer som forenkler Imaging i Z dimensjon og følgende bildeanalyser, men disse tilnærmingene ikke etterligne den komplekse, uregelmessige overflaten av en APC, og kan fremme ikke-fysiologiske interaksjoner i IS. Dermed er den eksperimentelle tilnærmingen som brukes her er egnet til å reprodusere og å konfrontere noen biologiske kompleksiteten oppstår på IS.
Hovedmålet med metoden er å generere immunologiske synapse (IS) celle-til-celle konjugater dannet av en antigen-presentere celle (APC) pulserende med se superantigens og en effektor th celle, og å registrere bilder som tilsvarer de første stadiene av immunologiske synapse formasjon og påfølgende smugling hendelser (forekommer både i APC og th cellen), som til slutt vil føre til polarisert sekresjon på IS. Opprettelsen av det er av T-lymfocytter ved binding av deres celle reseptor (TCR) til antigener bundet til MHC-II på APC organiserer en ekstremt dynamisk, formbare og kritisk forekomst involvert i antigen-spesifikke, humoral og cellulære immunresponser1,2. IS er definert ved dannelsen av en spesiell supramolekylært aktiverings kompleks (SMAC) mønster preget av en utgangen omorganisering prosess3. Upon IS konstruksjon av T-lymfocytter med en APC, polarisering av sekretoriske blemmer mot IS synes å være innblandet i polarisert sekresjon på Synaptic gapet. Dette fokuserte maskiner synes å entydig forsyne immunforsvaret med en ypperlig regulert krigslist å forsterke effekten av kritiske sekretoriske effektor roller av T-lymfocytter, samtidig redusere uspesifisert, cytokin-meglet stimulering av tilskuer celler, drap av irrelevante målceller og apoptotisk selvmord via aktivisering-indusert celle død (AICD)4.
Konsekvensen av IS varierer på innholdet i både T-lymfocytter og APC. Den Synaptic kontakt av th celler (vanligvis CD4 + celler) med APC viser antigen-knyttet til MHC-II produserer aktiveringen av T-cellen (cytokin sekresjon, spredning, etc.) og, i noen tilfeller, apoptose via AICD4. For cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) (hovedsakelig CD8 + celler) i samspill med APC presentere antigen knyttet til MHC-I, utfallet avviker på pre-stimulering eller ikke av CTLer med antigen. Dermed naiv CTLer identifisere antigen-MHC-I komplekser på APC er “primet” for å ødelegge målet celler og dividere. Primet CTLer også etablere synapser med målcellene (dvs. celler infisert av virus eller tumorceller) produserer antigen-spesifikk celle utryddelse5,6.
Den polariserte utskillelsen av exosomes på immunologiske synapse er et utviklende og utfordrende område av forskning involvert i relevante immunresponser7. Det har blitt demonstrert at multivesicular organer (MVB) bærer intraluminal blemmer (ILVs) erfaring polarisert transport mot er8,9 (Video 1) ved TCR stimulering med antigen. Fusjonen av disse MVB på Synaptic membranen induserer deres degranulering og utgivelsen av ILVs som exosomes til Synaptic kløft8,10. Dette skjer i er dannet av th-type Jurkat celler som ble utfordret med se superantigen-belagt Raji celler opptrer som APC11, TCR-stimulert CD4+ Lymphoblasts, og primet CTLer. Således, synapser fremstilt av Jurkat celler utgjøre en kostbar modell å studere polarisert sekretoriske trafikk av exosomes. I tillegg har flere ti år med etterforskning vist at mange grunnleggende innsikt i TCR signalering kom fra studier med transformert T-cellelinjer, og faktisk den mest kjente av disse modellsystemer er Jurkat Leukemic T-Cell linje12.
Dannelsen av en fullt utviklet IS produserer flere viktige biologiske utfall, inkludert aktivering av th celler, aktivering av naive CTLer eller målet celle drap av primet CTLer, bortsett fra anergy eller AICD5. Derfor er det to hovedtyper av sekretoriske er etablert av T-lymfocytter som resulterer i svært mangfoldig, men tilsvarende kritisk, uimottakelig effektor funksjoner1,6,13. På den ene siden, er fra primet cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) induserer rask polarisering (alt fra sekunder til noen minutter) av lytisk granulater (kalt “sekretoriske lysosomer”) mot IS. Degranulering av lytisk granulater induserer utskillelsen perforin og granzymes til Synaptic kløft14, som er Pro-apoptotisk molekyler. De skilles ut perforin og granzymes senere indusere drap av målet cellene15,16. CTLer utvikle midlertidige synapser, som varer bare noen få minutter, som målcellene blir myrdet3,17. Dette er trolig på grunn av omstendighetene som den optimale CTL oppgaven krever en rask og midlertidig kontakt for å distribuere så mange dødelige streiker som mulig til en rekke målcellene3,17. I kontrast, th lymfocytter som Jurkat celler genererer stabil, langvarig er (fra 10-30 min opp til timer), siden dette synes å være nødvendig for både retningsbestemt og uopphørlig sekresjon av stimulerende cytokiner3,17. Cytokiner er også omsluttet av sekretoriske blemmer og noen av dem (dvs. IL-2, IFN-γ) erfaring polarisert transport til IS17 og sekresjon. En viktig karakteristikk av IS er dannelsen av utforskningen, svake og forbigående kontakter mellom T-cellen og APC (Video 1) som kan gi en sterkere interaksjon og etablering av en moden is, forutsatt at TCR identifiserer beslektet ANTIGEN-MHC komplekser og at passende co-stimulerende tilkoblinger er etablert5. Både begynnelsen av den innledende kontakter og grunnleggelsen av en moden, helt produktive er, er iboende Stokastisk, rask og asynkron prosesser5,18. Videre er det en knappe frekvens i etableringen av celle-til-celle konjugater19, som kan utgjøre en utfordring for Imaging teknikker (Vennligst se resultater og diskusjon seksjoner).
En annen stor utfordring i å undersøke polarisering av mikrotubulinettverket-organisering Center (MTOC) og sekretoriske granulater i T-lymfocytter er at hele prosessen er rask (sekunder til noen minutter), spesielt i CTLer. vurderer disse fakta, de fleste tidlige tilnærminger konfrontert en endepunkt strategi der APC/Target celler og T-lymfocytter er blandet sammen og løpe sammen med lav hastighet sentrifugering, for å favorisere celle-til-celle bøye skapelsen, inkubert i flere minutter, fast og senere evaluert for flytting av MTOC og/eller sekretoriske blemmer mot IS20. Denne tilnærmingen har to vesentlige begrensninger: ingen levende menneskehandel data ble oppnådd og høye nivåer av bakgrunn MTOC/sekretoriske granulater polarisering ble innhentet, sannsynligvis på grunn av Stokastisk karakter er etablering18. Videre enhver sammenheng mellom TCR-stimulert, innledende signalering hendelser (dvs. intracellulære kalsium stiger, utgangen omorganisering) og sekretoriske vesicle polarisering er problematisk å undersøke. Dermed er avgjørende bestemmelser for hensiktsmessig avbildning av IS i levende celler kombineres for å forbedre celle-til-celle bøy materialisering, for å synkronisere generering av IS og, når det er mulig, for å garantere etablering av mobilnettet konjugater på definerte mikroskop XY felt og Z posisjoner. Flere strategier har blitt utviklet for å unngå alle disse problemene. Det er ute av omfanget av dette papiret for å forklare disse metodene, deres fordeler og svakheter. Vennligst henvis til tidligere publiserte vurderinger håndtere disse viktige punktene1,4,5,21.
Det faktum at er laget av th lymfocytter er lang levetid, og forholdet som i th lymfocytter den MTOC, lymfokingener inneholder sekretoriske granulater og MVB ta fra flere minutter til timer for å flytte og Dock til er22 gjør th-APC er en ideell kandidat for Imaging bruker protokollen beskrevet her.
En begrensning av denne protokollen er at ikke alle synapser vil være ideelt orientert vinkelrett på den optiske aksen. Ved hjelp av denne teknikken, er det ingen måte å forutsi og/eller å påvirke den ideelle orientering for uimottakelig synapse Imaging. For å løse dette problemet, ekskluderer vi fra den påfølgende analyser alle tilfeldig fanget synapser som til slutt ikke oppfyller de ideelle kriteriene. Disse synapser, opportunely nok, er ikke veldig hyppige. Det er imidlertid mulig å omgå denne begrensningen ved hjelp av flere eksperimentelle tilnærminger4.
Den polariserte CD63 release (degranulering) kan kvantifisert av andre komplementære teknikker som celleoverflaten farging av CD63 (CD63 relocalization til celleoverflaten) i levende celler (ikke fast og ikke permeabilized), etter trinn 6, og påfølgende vask og fiksering, som tidligere vist8. I tillegg kan CD63 utgivelse på exosomes8,9 og exosome kvantifisering av nanopartikkel Tracking analyser9,25 utføres. Disse tilnærmingene er sikkert kompatible med vår protokoll, forutsatt fiksering blir utført etter celleoverflaten immunofluorescence av levende celler.
Vi har funnet det ideelle antall celler (for en 1 cm2 godt i 8-brønn kammer Slide) er 4 x 105 celler (2 x 105 Raji celler og 2 x 105 Jurkat celler) siden de holder seg effektivt til bunnen av brønnen. Bindende effektivitet til plast (ved hjelp av fibronektin), eller glassbunn (ved hjelp av Poly-L-lysin) microslides er vanligvis ikke et problem. Høyere celle tall kan produsere noen hull blant overholdt celler og, senere, komplekse Synaptic konjugater (figur 1); begge situasjoner er ikke ønskelig når én celle-til-celle konjugater trenger å bli avbildet i, for eksempel, MTOC eller sekretoriske granule polarisering eksperimenter. Lavere antall celler kan redusere sjansene for å finne konjugater, spesielt når transfekterte Jurkat celler blir utfordret med APC til å generere synapser. Vær oppmerksom på at vi har observert at en temperatur stabilisere scenen inkubator på plass på mikroskopet X/Y scenen før utbruddet av protokollen (dvs. 1-2 h på forhånd for å stabilisere scenen/mikroskop oppsett) opprettholder stabile X, Y, Z parametere, som er avgjørende for riktig bildebehandling. Automatisk fokus systemet vil til slutt kompensere små Z variasjoner.
Når visse gen Transduction teknikker som electroporation brukes til å uttrykke fluorescerende chimeric proteiner (dvs. GFP-CD63) i Jurkat kloner (Video 1), kan en betydelig brøkdel av cellene dø etter electroporation. Dette kan være et problem siden selv om døde celler ikke danner synapser, når de er i overkant over de levende, transfekterte celler, kan de forstyrre dannelsen av konjugater laget av levende th celler. Vi har funnet at forsiktig eliminering av døde celler fra transfekterte kulturer ved hjelp av en tetthet gradient medium følgende standardprotokoller før bøye formasjonen trinnet kan faktisk øke sjansene til riktig bilde konjugater. I tillegg har lav transfeksjoner effektivitet (< 20%) kan være en viktig påminnelse siden dette, kombinert med en moderat bøye formasjon effektivitet (rundt 60%)25, vil redusere sannsynligheten for å finne konjugater laget av transfekterte celler. Dette er ikke et problem når ikke-transfekterte celler brukes til å få konjugater i endepunktet eksperimenter og påfølgende fiksering. De 8 mikrotiterplateleser kammer lysbildene er kompatible med konvensjonelle immunofluorescence protokoller. Dette øker fleksibiliteten i protokollen ovenfor med ulike formål. Fiksering med aceton kan være et problem å vurdere når du bruker kammer lysbilder med plast-bunn brønner. Men det er kommersielt tilgjengelig 8 mikrotiterplateleser mikroskop kammer lysbilder som inneholder glass bunner, som er kompatible med aceton fiksering. Fjern plastlokk når aceton brukes til å fikse cellene kultivert i 8 mikrotiterplateleser glass-bunn kammer lysbilder.
Det anbefales at mikroskopet er utstyrt med en motorisert XY-scene, motorisert Epi-fluorescens turret og automatisk fokus system (for eksempel Perfect Focus system) eller tilsvarende kosttilskudd. Når multi-brønn oppkjøpet er nødvendig25, vil automatisk fokus systemet sikre et stabilt fokus langs hele eksperimentet. Tidligere erfaring indikerer at ved å etablere en hensiktsmessig fokusforskyvning på Raji cellene, både bevegelse av T-celler (Video 1) og mikroskopet scenen/kammer lysbilde bevegelser i xy Multi-punkt eksperimenter, kan kompenseres. Denne er virkelig bekvem for multiwell tid-lapse fange.
En sort og hvit, panchromatic og avkjøle beregnet koplet apparat (CDD) kameraet var anvendt bortsett fra høyere-følsomheten, fluorescens naturvitenskapelig komplementær metallisk-oksid halvleder (sCMOS) kameraet er ønskelig, siden denne ville nedgang kameraet avsøring timene og ville forsterke Temporal resolution. Den korte kameraet eksponeringstider vi har brukt (ranking form 100 MS til 500 MS) kombinert med automatisk fluorescens lukkeren kan langvarig tid forfalle fangst (opp til 24 h) med en tilstrekkelig tid oppløsning (1 ramme per minutt eller mindre, for opptil 16 XY stillinger) uten betydelige fluorescens bleking og/eller tap i celle levedyktighet. Den motoriserte scenen tillater multi-Point (XY) fangst og øker sjansen til å finne og bilde den nye og utvikle synapser i den ideelle orientering, men også tillater bildeoppkjøp i multiwell kammer lysbilder når ulike Jurkat kloner må samtidig bøyes25. Høy numerisk blenderåpning av målet (dvs. 60x, 1,4) er nødvendig for å oppnå de beste resultatene når analysere trafikken av sekretoriske granulater.
Den RAJI-SEE-Jurkat utgjør en veletablert immunologiske synapse modell som har blitt brukt av en myriade av forskere siden det opprinnelig ble beskrevet11. Vi har tilpasset vår protokoll til denne modellen for å riktig bilde de tidlige stadier av IS formasjon. Vårt mål var å forbedre tidlig tilnærminger20 tidligere fulgt for å studere POLARISERING av MTOC og sekretoriske maskiner mot is. Det er bemerkelsesverdig at konjugater gjort med denne protokollen produsere F-utgangen omorganisering på synapse, konfigurere en Kanonisk SMAC, samtidig til MVB polarisert trafikk25. Disse viktige hendelsene er også analysert og validert av konfokalmikroskopi mikroskopi25.
Kinetic forskjeller i polarisert trafikk finnes blant ulike typer IS. For eksempel, polarisert transport av lytisk granulater fra CTLer finner sted i sekunder eller svært få minutter, mens flere cytokin blemmer fra th lymfocytter ta fra minutter til flere timer å fullføre. Disse timelige dissimilarities må tas hensyn til på forhånd, for å designe den beste strategien og å velge den mest hensiktsmessige eksperimentelle og Imaging tilnærming, siden for noen tenkelig krigslist (dvs. laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi (LSCM)), tid kan være en begrensende faktor siden fangst tid er mye høyere enn den riktige tidsoppløsning (1 min eller mindre)4. Dette er ikke en begrensning når bredt felt fluorescens mikroskopi (WFFM) brukes som beskrevet i protokollen ovenfor. Siden i CTLer, den polarisering av MTOC mot synapse varer bare noen få minutter3,6,17, diverse spesifikke State-of the art mikroskopi tilnærminger annerledes enn det som er beskrevet her (men harboring høyere romlig og Temporal oppløsning) er nødvendig for å riktig bilde disse synapser26,27, hovedsakelig når flere mikroskop felt (multi-Point Capture) er avbildet. Disse høyoppløselige, nye tilnærminger kan også benyttes for Imaging synapser laget av th lymfocytter, men økonomisk og/eller logistikk grunner (dvs. kjerne utstyr som kreves for noen av disse Imaging teknikker koster 6-7 ganger mer enn det som er beskrevet her) kan sikkert utgjøre en begrensning for disse State of the art Imaging metoder4. Det faktum at er laget av th lymfocytter er lang levetid, og forholdet som i th lymfocytter den MTOC, den lymfokingener inneholder sekretoriske blemmer og MVB ta fra flere minutter til timer for å transportere og Dock til IS22, gjør denne protokollen en ideell, rimelig tilnærming for Imaging den th-APC is.
WFFM i kombinasjon med post-oppkjøpet bilde deconvolution utgjør en interessant tilnærming og ikke bare økonomiske grunner støtte denne strategien. Den iboende dårlig oppløsning i Z-aksen (den viktigste påminnelse av teknikken) kan forbedres ved hjelp av post-oppkjøpet bilde deconvolution4 (sammenlign Video 1 med video 2). Deconvolution bruker en beregning-basert, bildebehandling tilnærming som kan forbedre signal til støyforhold og bildeoppløsning og kontrast27 opp til 2 ganger, ned til 150-100 NM i XY-aksen og 500 NM i Z-aksen4.
Bruk av høyere følsomhet, høy avlesning hastighet og bredt dynamisk område, nye fluorescens sCMOS kameraer vil forbedre kvaliteten på bildene og vil redusere fluorescens bleking. Fleksibiliteten som tilbys av celle-til-celle Bøyning protokollen beskrevet her tillater kombinasjonen av de beskrevne cellulære tilnærming med flere State of the art mikroskopi teknikker, både i levende celler, men også i faste celler, og den forventede utfallet vil faktisk forbedre vår kunnskap om immunologiske synapse.
Selv om vi har implementert og validert protokollen ved hjelp av lett-å-håndtere, godt etablerte cellelinjer, potensialet tilnærmingen kan tillate visualisering av mer fysiologiske interaksjoner når primære T-celler og ulike typer antigen-presentere celler (for eksempel dendrittiske celler av makrofager) brukes5. I denne sammenhengen har denne protokollen er også utvidet og validert ved hjelp av superantigen (SEB)-pulserende mus EL-4 cellelinje brukes som en APC, til å utfordre primær mus T lymphoblasts9. Faktisk primære T-lymfocytter, CTLer spesielt, gjengitt mer kortvarig og dynamisk Synaptic kontakter (se supplerende video 8 i referanse9) til de sett med se-Raji og Jurkat modell. Variasjonen av Synaptic kontakt moduser kan best sees for primær T-celle interaksjoner med dendrittiske celler eller B-celler i to-dimensjonale in vitro vev ekvivalenter som kan også registreres og analyseres ved hjelp av denne protokollen. I tillegg, bortsett fra superantigens, kan teknikken brukes til bilde andre typer synapser. For eksempel kan det brukes i en TCR transgene, antigen-spesifikk T celle modell, for eksempel ved hjelp av ovalbumin spesifikke murine OT1/OT2 system eller ved transfeksjoner av T-celler med antigen-spesifikke T celle reseptorer. Dette åpner en myriade av eksperimentelle muligheter for umiddelbar fremtid.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner alle tidligere og nåværende medlemmer av laboratoriet for deres sjenerøse bidrag. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R til M.I., som delvis ble gitt med FEDER-EC finansiering). Vi erkjenner Facultad de Medicina (UAM) og Departamento de Audiovisuales av Facultad de Medicina for deres støtte og de fasiliteter som tilbys for å produsere videoen. Vi anerkjenner NIKON-Europe for kontinuerlig og ypperlig teknisk og teoretisk støtte. Gratis tilgang til denne artikkelen er sponset av Nikon.
Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
Software Image J | NIH | Image J | Image software |
Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |