Methodenartikel

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/60616

⸱

8. März 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide sind strukturell vielfältige amphipathische Moleküle, die in Wasser unlöslich sind. Lipide sind wesentliche Beiträge zur Organisation und Funktion biologischer Membranen, Energiespeicherung und -produktion, zelluläre Signalisierung, vesikulärer Transport von Proteinen, Organellebiogenese und regulierter Zelltod. Da die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae ein einzelliges Eukaryoten ist, das für gründliche molekulare Analysen zugänglich ist, half seine Verwendung als Modellorganismus, Mechanismen aufzudecken, die den Fettstoffwechsel mit dem intrazellulären Transport mit komplexen biologischen Prozessen innerhalb eukaryotischer Zellen verbinden. Die Verfügbarkeit einer vielseitigen Analysemethode für die robuste, empfindliche und genaue quantitative Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist entscheidend, um tiefe Einblicke in diese Mechanismen zu erhalten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung der Flüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiae vor. Die beschriebene LC-MS/MS-Methode ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Arten (einschließlich verschiedener isobarer oder isomerischer Formen) innerhalb jeder der 10 Lipidklassen. Diese Methode ist empfindlich und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,2 pmol/l. Die Methode wurde erfolgreich angewendet, um Lipidome ganzer Hefezellen und ihrer gereinigten Organellen zu bewerten. Der Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bei dieser Methode kann die Ionisationseffizienz bei einigen Lipidarten erhöhen und kann daher zur Verbesserung ihrer Identifizierung und Quantifizierung eingesetzt werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Reihe von Beweisen zeigt, dass Lipide, eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen, spielen wesentliche Rolle in vielen lebenswichtigen Prozessen innerhalb einer eukaryotischen Zelle. Diese Prozesse umfassen die Montage von Lipid-Doppelschichten, die die Plasmamembran und Membranen umgebenden Zellorganellen bilden, den Transport kleiner Moleküle über Zellmembranen, die Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung und intrazelluläre Signaltransduktion, die Erzeugung und Speicherung von Energie, den Import und Export von Proteinen, die auf verschiedene Organellen beschränkt sind, vesikulären Handel mit Proteinen innerhalb des Endomembransystems und der Proteinsekretion sowie verschiedene Arten des regulierten Zelltodes1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Die angehende Hefe S. cerevisiae, ein einzelliger eukaryotischer Organismus, wurde erfolgreich verwendet, um einige der Mechanismen zu entdecken, die den wesentlichen Rollen von Lipiden in diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen zugrundeliegen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae ist ein wertvoller Modellorganismus für die Aufdeckung dieser Mechanismen, weil er für umfassende biochemische, genetische, zellbiologische, chemische, biologische, systembiologische und mikrofluidische Dissektionsanalysen21,22,23,24,25zugänglich ist. Weitere Fortschritte beim Verständnis von Mechanismen, durch die der Fettstoffwechsel und der intrazelluläre Transport zu diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen beitragen, erfordern empfindliche Massenspektrometrietechnologien für die quantitative Charakterisierung des zellulären Lipidoms, das Verständnis der molekularen Lipidkomplexität und die Integration der quantitativen Lipidomik in eine multidisziplinäre Plattform der Systembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.

Aktuelle Methoden für die Massenspektrometrie-unterstützte quantitative Lipidomik von Hefezellen und Zellen anderer eukaryotischer Organismen sind nicht ausreichend vielseitig, robust oder empfindlich. Darüber hinaus sind diese derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, verschiedene isobarische oder isomerische Lipidarten voneinander zu unterscheiden. Hier beschreiben wir eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode, die den Einsatz von Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiaeermöglicht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung steriler Medien zur Hefekultierung

  1. Bereiten Sie 90 ml eines vollständigen YP-Mediums vor, das 1% (w/v) Hefeextrakt und 2% (w/v) Bactopepton enthält.
  2. Bereiten Sie 90 ml eines synthetischen minimalen YNB-Mediums vor, das 0,67 % (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 mg/L L-Histidin, 30 mg/L L-Leucin,30 mg/L L-Lysinund 20 mg/L Uracil enthält.
  3. 90 ml des gesamten YP-Mediums gleichmäßig in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben (d.h. je 45 ml) aufteilen.
  4. 90 ml des synthetischen Minimal-YNB-Mediums in zwei 250 ml Erlenmeyer-Kolben (d.h. je 45 ml) aufteilen.
  5. Autoklavieren Sie die Kolben mit YP- und YNB-Medien bei 15 psi/121 °C für 45 min vor Gebrauch.

2. Hefe-Stamm

  1. Verwenden Sie den Wild-Stamm BY4742 (MAT- his3-1 leu2-0 lys2-0 ura3-0).

3. Kultieasthefe im gesamten YP-Medium mit Glukose

  1. Autoklaveine 20% (w/v) Vorrat an Glukose bei 15 psi/121 °C für 45 min vor der Anwendung.
  2. Fügen Sie 5 ml der sterilen 20% (w/v) Glukoselösung in jeden der beiden Erlenmeyerkolben, die das sterile YP-Medium enthalten, für eine Endkonzentration von 2% Glukose (w/v) hinzugeben.
  3. Verwenden Sie eine mikrobiologische Schleife, um Zellen des Wildstamms BY4742 in jeden der beiden Erlenmeyerkolben, die das YP-Medium enthalten, mit Glukose zu impfen.
  4. Kultur die Zellen über Nacht bei 30 °C mit Rotationsschütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
  5. Nehmen Sie ein Aliquot der Hefekultur. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Gesamtzahl der Hefezellen pro ml Kultur zu bestimmen.

4. Hefe auf das synthetische Minimal-YNB-Medium mit Glukose übertragen und kultivieren

  1. Fügen Sie jedem der beiden Erlenmeyerkolben, die das sterile YNB-Medium enthalten, 5 ml der sterilen 20%-Stammlösung (w/v) Glukose zu einer Endkonzentration von 2% Glucose (w/v) hinzu.
  2. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um ein Volumen der Übernachthefekultur, das die Gesamtzahl von 5,0 x 107 Zellen enthält, in jede der beiden Erlenmeyerkolben zu übertragen, die das YNB-Medium mit Glukose enthalten.
  3. Kultur die Zellen für mindestens 24 h (oder mehr, wenn das Experiment erfordert) bei 30 °C mit Rotationsschütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.

5. Herstellung von Reagenzien, Laborwaren und Geräten zur Lipidextraktion

  1. Bereiten Sie Folgendes vor: 1) hohe Qualität (>99,9%) Chloroform; 2) hochgradreich (>99,9%) Methanol; 3) 28% (v/v) Ammoniumhydroxidlösung in nanoreinem Wasser; 4) Glasperlen (säuregewaschen, 425-600 m); 5) ein Wirbel mit entsprechendem Adapter; 6) 15 ml Hochgeschwindigkeitsglaszentrifugenrohre mit polytetrafluorethylen gefütterten Kappen; 7) 17:1 und 2:1 Mischungen von Chloroform und Methanol; 8) ein Chloroform/Methanol (2:1) Mit 0,1% Ammoniumhydroxid (v/v); 9) ABC-Lösung (155 mM Ammoniumbicarbonat, pH = 8,0); 10) eine Mischung interner Lipidnormen, die in einem 2:1-Gemisch aus Chloroform und Methanol gemäß Tabelle 1hergestellt werden; und 11) 2 ml Glasprobenfläschchen mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappen zur Extraktion von zellulären Lipiden.

6. Herstellung von Reagenzien, Laborwaren und Geräten für LC

  1. Bereiten Sie folgendes vor: 1) Acetonitril/2-Propanol/Nano-reines Wasser (65:35:5) Gemisch; 2) einen Wirbel mit entsprechendem Adapter; 3) ein Ultraschall-Sonicator; 4) Glasfläschchen mit Einsätzen für eine Wellplate; 5) ein LC-System, das mit einer binären Pumpe, einem Entgaser und einem Autosampler ausgestattet ist; 6) eine C18-Rückwärtsphasensäule (2,1 mm; 75 mm; Porengröße 130 ° ; pH-Bereich von 1-11) gekoppelt an ein Vorsäulensystem; 7) Mischung A: Acetonitril/Wasser (60:40); und 8) Mischung B: Isopropanol/Acetonitril (90:10).

7. Lipidextraktion aus Hefezellen

  1. Nehmen Sie ein Aliquot der Hefekultur. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder messen Sie OD600, um die Gesamtzahl der Hefezellen pro ml Kultur zu bestimmen.
  2. Nehmen Sie ein Volumen der Hefekultur, das eine Gesamtanzahl von 5,0 x 107 Zellen (3,3 Einheiten OD600) enthält. Legen Sie dieses Kulturvolumen in ein vorgechilltes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  3. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 1 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  4. 1,5 ml eiskaltes nanoreines Wasser hinzufügen und die Zellen durch Zentrifugieren bei 16.000 x g 1 min bei 4 °C waschen. Entsorgen Sie den Überstand.
  5. 1,5 ml eiskalte ABC-Lösung hinzufügen und die Zellen durch Zentrifugieren bei 16.000 x g 1 min bei 4 °C waschen. Entsorgen Sie den Überstand. Das Zellpellet kann vor der Lipidextraktion bei -80 °C gelagert werden.
  6. Um die Lipidextraktion zu beginnen, tauen Sie das Zellpellet auf Eis auf.
  7. Setzen Sie das Zellpellet in 200 l eiskaltem nanoreinem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe. Fügen Sie dieser Tube folgendes hinzu: 1) 25 l des Gemischs der in Chloroform/Methanol (2:1) hergestellten Mischung von internen Lipidnormen; 2) 100 l von 425-600 'M säuregewaschene Glasperlen; und 3) 600 l Chloroform/Methanol (17:1) Gemisch.
  8. Wirbeln Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu stören.
  9. Wirbel n. Chr. bei niedriger Geschwindigkeit für 1 h bei RT, um die Extraktion von Lipiden zu erleichtern.
  10. Inkubieren Sie die Probe für 15 min auf Eis, um die Proteinfällung und die Trennung der wässrigen und organischen Phasen voneinander zu fördern.
  11. Zentrifuge das Rohr in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min bei RT. Dieser Zentrifugationsschritt ermöglicht es, die obere wässrige Phase von der unteren organischen Phase zu trennen, die alle Lipidklassen enthält.
  12. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glaspipette, um die untere organische Phase (ca. 400 l) auf ein weiteres 15 ml hochfestes Glasschnecken-Spitzenzentrifugenrohr mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe zu übertragen. Unterbrechen Sie während des Transfers nicht die Glasperlen oder die obere wässrige Phase. Halten Sie die untere organische Phase unter dem Fluss von Stickstoffgas.
  13. Fügen Sie 300 l Chloroform-Methanol (2:1) In die verbleibende obere wässrige Phase ein, um die Extraktion von Sphingolipiden und PA, PS, PI und CL zu ermöglichen. Wirbel des Rohres kräftig für 5 min bei RT.
  14. Zentrifuge das Rohr in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min bei RT.
  15. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glaspipette, um die nach der Zentrifugierung gebildete untere organische Phase (ca. 200 l) in die organische Phase zu übertragen, die in Schritt 7.13 gesammelt wurde.
  16. Verwenden Sie den Stickstoffgasstrom, um das Lösungsmittel in den kombinierten organischen Phasen zu verdampfen. Schließen Sie die Rohre, die den Lipidfilm enthalten, unter dem Fluss von Stickstoffgas. Bewahren Sie diese Rohre bei -80 °C auf.

8. Trennung der extrahierten Lipide durch LC

  1. Fügen Sie 500 l Acetonitril/2-Propanol/Nano-reines Wasser (65:35:5) in ein Rohr, das den bei Schritt 7.16 erhaltenen Lipidfilm enthält. Wirbel das Rohr 3x für 10 s bei RT.
  2. Unterziehen Sie den Inhalt der Röhre einer Ultraschallbeschallung für 15 min. Vortex das Rohr 3x für 10 s bei RT.
  3. Nehmen Sie 100 l einer Probe aus dem Rohr und fügen Sie sie in eine Glasflasche mit einem Einsatz für eine Wellplatte. Beseitigen Sie Luftblasen im Einsatz, bevor Sie sie in die Wellplate einbauen.
  4. Verwenden Sie ein LC-System, um verschiedene Lipidarten auf einer umgekehrten Phase c18-Spalte CSH gekoppelt mit einem vorkolenden System zu trennen (siehe Tabelle der Materialien). Während der Trennung die Säule bei 55 °C und bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/min halten. Halten Sie die Probe in der Bohrplatte bei RT.
  5. Verwenden Sie die beweglichen Phasen, die aus Mischung A (Acetonitril/Wasser [60:40 (v/v)]) und Mischung B (Isopropanol/Acetonitril [90:10 (v/v)]) bestehen. Für einen positiven Modus der Detektion von Elternionen, die mit der Elektrospray-Ionisation (ESI)-Ionenquelle erzeugt werden, enthalten die mobilen Phasen A und B Bei der Endkonzentration von 10 mM das Ammoniumformat. Für einen negativen Modus der Stammionenerkennung enthalten die ESI (-) Modus, die mobilen Phasen A und B Ammoniumacetat bei der Endkonzentration von 10 mM.
  6. Verwenden Sie für die Injektion in den ESI-Modus (+) und den ESI-Modus (-) ein Probenvolumen von 10 l.
  7. Trennen Sie verschiedene Lipidarten durch LC mit dem folgenden LC-Gradienten: 0-1 min 10% (Phase B); 1-4 min 60% (Phase B); 4-10 min 68% (Phase B); 10-21 97% (Phase B); 21-24 min 97% (Phase B); 24-33 min 10% (Phase B).
  8. Führen Sie Extraktionsrohlinge als erste Probe zwischen allen vier Proben und als letzte Probe aus. Subtrahieren Sie den Hintergrund, um Daten zu normalisieren.
  9. Abbildung 1zeigt ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm aus LC/MS-Daten von Lipiden, die aus Zellen des Wildstamms BY4742 extrahiert wurden.

9. Massenspektrometrische Analyse von lipiden getrennt durch LC

  1. Verwenden Sie ein Massenspektrometer, das mit einer HESI-Ionenquelle (beheizte Elektrospray-Ionisierung) ausgestattet ist, um Lipide zu analysieren, die durch LC getrennt wurden. Verwenden Sie die in Tabelle 2angegebenen Einstellungen .
  2. Verwenden Sie den Fourier-Transformationsanalysator, um Elternionen (MS1) mit einer Auflösung von 60.000 und im Massenbereich von 150-2.000 Da zu erkennen.
  3. Verwenden Sie die in Tabelle 3 angegebenen Einstellungen, um sekundäre Ionen (MS2) zu erkennen.

10. Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Lipidklassen und Arten durch Verarbeitung von Rohdaten von LC-MS/MS

  1. Siehe Tabelle der Materialien für Software, um die Identifizierung und Quantifizierung von verschiedenen Lipiden aus rohen LC-MS/MS-Dateien durchzuführen. Diese Software verwendet die größte Lipid-Datenbank, die mehr als 1,5 Millionen Lipidionen-Vorläufer (MS1) und ihre vorhergesagten Fragmentionen (MS2) enthält. Die Software verwendet auch MS1-Peaks für die Lipidquantitation und MS2 zur Lipididentifikation. Ein repräsentatives Chromatogramm zweier isomerischer Phosphatidylserinformen (34:0), die den gleichen m/z-Wert, aber unterschiedliche Retentionszeiten, sowie ihre MS1- und MS2-Spektren aufweisen, sind in Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4dargestellt.
  2. LC-MS-Rohdateien mit full-scan MS1-Daten und datenabhängigen MS2-Daten nach freien (unesterifizierten) Fettsäuren (FFA), Cardiolipin (CL), Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), Phosphatidylcholin (PC), Phospha Tidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS) und Triacylglycerol (TAG) Lipidklassen mit einer m/z-Toleranz von 5 ppm für Vorläuferionen und 10 ppm für Produktionen. Weitere Suchparameter sind in Tabelle 4dargestellt. Befolgen Sie die Anweisungen im Software-Benutzerhandbuch. Die Identitäten von internen Lipidstandards und Lipidarten mit ungewöhnlicher Fettsäurezusammensetzung müssen manuell überprüft werden.
  3. Um verschiedene Lipidklassen und -arten mit Hilfe frei verfügbarer Open-Source-Alternativen für die Lipid Search Software zu identifizieren und zu quantitieren, verwenden Sie die Software Lipid Data Analyzer (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), MZmine 2 (http://mzmine.github.io/) oder XCMS (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html), um Rohdaten von LC-MS/MS zu verarbeiten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unsere Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger zellulärer Lipide innerhalb einer Hefezelle mit Hilfe von LC-MS/MS war vielseitig und robust. Es ermöglichte uns, 10 verschiedene Lipidklassen in S. cerevisiae Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die im synthetischen minimalen YNB-Medium kultiviert wurden, das zunächst 2% Glukose enthielt. Diese Lipidklassen umfassen freie (unesterifizierte) Fettsäuren (FFA), CL, Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), PC, PE, PG...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig für die erfolgreiche Implementierung des hier beschriebenen Protokolls:

1. Chloroform und Methanol sind giftig. Sie extrahieren effizient verschiedene Substanzen von Oberflächen, einschließlich Labor-Kunststoffundzeug und Ihre Haut. Behandeln Sie daher diese organischen Lösungsmittel mit Vorsicht, indem Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten vermeiden, die den Kontakt mit Chloroform und/oder Methanol beinhalten, Borosilikatglaspipetten fü...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Diskussionen. Wir würdigen das Zentrum für biologische Anwendungen der Massenspektrometrie und das Zentrum für Strukturelle und Funktionelle Genomik (beide an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) kanadas (RGPIN 2014-04482) und des Concordia University Chair Fund (CC0113) unterstützt. K.M. wurde vom Concordia University Merit Award unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus Glas mit Teflon-ausgekleideten KappenPYREX05-550
2 mL Probenfläschchen aus Glas mit Teflon-ausgekleideten KappenFisher Scientific60180A-SV9-1P
2-PropanolFisher ScientificA461-500
AcetonitrilFisher ScientificA9554
Agilent 1100 Serie LC-SystemAgilent TechnologiesG1312A
Agilent1100 WellplateAgilent TechnologiesG1367A
AmmoniumacetatFisher ScientificA11450
AmmoniumbicarbonatSigma9830
AmmoniumformiatFisher ScientificA11550
AmmoniumhydroxidFisher ScientificA470-250
BactopeptonFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinAvanti Polare Lipide750332
Centra CL2 klinische ZentrifugeThermo Scientific004260F
CeramidAvanti Polare Lipide860517
ChloroformFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardWasser186006944Vorsäulensystem
Freie Fettsäuren (19:0)Matreya1028
Glasperlen (säuregewaschen, 425-600 μ M)Sigma-AldrichG8772
GlukoseFisher ScientificD16-10
HämazytometerFisher Scientific267110
L-HistidinSigmaH8125
Lipid Search Software (V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS Analysesoftware
L-LeucinSigmaL8912
L-LysinSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
PhosphatidylcholinAvanti Polare Lipide850340
PhosphatidylethanolaminAvanti Polare Lipide850704
PhosphatidylglycerinAvanti Polare Lipide
PhosphatidylinositolAvanti Polare LipideLM1502
PhosphatidylserinAvanti Polare Lipide840028
Umkehrphasensäule CSH C18Wasser186006102
SphingosinAvanti Polare Lipide860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricylglycerolLarodan, MalmöTAG Mixed FA
Ultraschall-UltraschallgerätFisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
VortexFisher Scientific2215365
HefeextraktFisher ScientificBP1422-2
Hefestickstoffbase ohne AminosäurenFisher WissenschaftlichDF0919-15-3
Hefestamm BY4742DharmaconYSC1049
840446

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  3. Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
  6. Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
  7. Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
  8. Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
  9. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  10. Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83(2019).
  11. Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
  12. Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
  13. Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
  14. Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
  15. Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
  16. Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
  17. Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
  18. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
  19. Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
  20. Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
  21. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  22. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  23. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  24. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  25. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
  26. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  27. Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
  28. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  29. Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
  30. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  31. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
  32. Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394(2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

LipidomanalyseLipidextraktionHefezellkulturC18 Umkehrphasens uleElektrospray Ionisationmobile Phasenadditivekollisionsinduzierte Dissoziation

Verwandte Artikel