Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Bottom-up-Montageansatz für den Aufbau synthetischer Zellen ist ein effektives Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung zellulärer Prozesse in einer Zellimittierungsumgebung. Darüber hinaus hat die Entwicklung zellfreier Expressionssysteme die Fähigkeit gezeigt, die Proteinproduktions-, Transkriptions- und Translationsprozesse (DNA-RNA-Protein) kontrolliert zu rekonstituieren und dabei die synthetische Biologie zu nutzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines zellfreien Expressionssystems, einschließlich der Herstellung eines potenten bakteriellen Lysats und der Verkapselung dieses Lysats in cholesterinreichen Lipid-basierten Riesen-Unilamellar-Vesikeln (GUVs) (d.h. stabile Liposomen), um synthetische Zellen zu bilden. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur Herstellung der Komponenten der synthetischen Zellen einschließlich der Herstellung von aktiven bakteriellen Lysaten, gefolgt von einer detaillierten schrittweisen Vorbereitung der synthetischen Zellen auf der Grundlage eines Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahrens. Diese erleichtern die Produktion von Millionen synthetischer Zellen auf einfache und erschwingliche Weise mit einer hohen Vielseitigkeit für die Herstellung verschiedener Arten von Proteinen. Die erhaltenen synthetischen Zellen können verwendet werden, um die Protein-RNA-Produktion und -Aktivität in einer isolierten Umgebung zu untersuchen, in der gerichteten Evolution, und auch als kontrollierte Plattform für die Bereitstellung von Medikamenten für die On-Demand-Produktion von therapeutischen Proteinen im Körper.
Einleitung
Synthetische Zellen sind künstliche zellähnliche Teilchen, die eine oder mehrere Funktionen einer lebenden Zelle imitieren, wie z. B. die Fähigkeit, zu teilen, Membraninteraktionen zu bilden und Proteine basierend auf einem genetischen Code1,2,3zu synthetisieren. Synthetische Zellen, die zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) umschließen, besitzen eine hohe Modularität aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Proteine und RNA-Sequenzen nach Veränderungen in der DNA-Vorlage zu produzieren. Als attraktive Alternative zu den aktuellen Ansätzen der Proteinproduktion basieren CFPS-Systeme auf Zelllysat, gereinigten Komponenten oder synthetischen Komponenten und umfassen alle Transkriptions- und Übersetzungsmaschinen, die für die Proteinsynthese erforderlich sind, wie Ribosomen, RNA-Polymerase, Aminosäuren und Energiequellen (z. B. 3-Phosphoglycerat und Adenintriphosphat)8,4,5,6,7,9. Die Verkapselung eines CFPS-Systems in Lipidbläschen ermöglicht die einfache und effiziente Produktion von Proteinen, ohne von einer lebenden Zelle abhängig zu sein10. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Synthese von Peptiden, die in natürlichen Zellen abbauen können, Produktion von Proteinen, die toxisch für lebende Zellen sind, und modifizieren Proteine mit nicht-natürlichen Aminosäuren11,12. Synthetische Zellen wurden als Modell für Forschungszwecke verwendet, um die minimalen Zellkomponenten zu untersuchen, die erforderlich sind, um das zelluläre Leben aus evolutionärer Perspektive zu ermöglichen1,13. Synthetische Zellen wurden auch verwendet, um genetische Schaltung zu bauen und zu implementieren und als Modelle für gerichtete Evolution14,15,16. Andere Studien konzentrierten sich auf die Fähigkeit synthetischer Zellen, die biologische Aktivität natürlicher Zellen nachzuahmen, mit dem Ziel, beschädigte natürliche Zellen zu ersetzen, wie Betazellen bei Patienten mit Diabetes17. Darüber hinaus veranschaulicht die Fähigkeit dieser CFPS, synthetische Zellen zu verkapseln, eine Vielzahl von therapeutischen Proteinen zu produzieren, ihr Potenzial, in den klinischen Einsatz integriert zu werden18.
Hier beschreiben wir ein Bottom-up-Labor-Skalenprotokoll (Abbildung 1) zur Herstellung von RNA- und Protein produzierenden synthetischen Zellen auf Basis eines CFPS-Systems, das in einem Lipidvesikel eingekapselt ist. Dies zeigt die mögliche Verwendung synthetischer Zellplattformen als neuartige Wirkstoffabgabesysteme für die Vor-Ort-Produktion eines therapeutischen Proteinmedikaments in vivo19. Frühere Studien haben die Optimierung der CFPS-Reaktion und der Zelllysatpräparationsprozesse4,8,20untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene Techniken für die zellgroße Liposomenpräparation angewendet, wie mikrofluidische und polymerbasierte Tröpfchenstabilisierungsmethoden21,22,23, die sich auch in der Lipidzusammensetzung der Liposomen24,25,26unterscheiden. Im vorgestellten Protokoll werden synthetische Zellen nach einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren hergestellt und der Verkapselungsprozess bei niedrigen Temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28durchgeführt. Diese milden Bedingungen haben sich als günstig für die Beibehaltung der biofunktionellen Integrität der molekularen Maschinerie erwiesen, nämlich Ribosomen und Proteine27,29,30. Die Lipidzusammensetzung der Partikel besteht sowohl aus Cholesterin als auch aus 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC). Die erste findet sich in allen Säugetierzellmembranen und ist wesentlich für die Stabilität, Steifigkeit und Durchlässigkeit der Membran, und letztere imitiert Säugetier Phospholipid Zusammensetzung11,13. Die zelluläre Transkription und Translation molekulare Maschinerie werden aus dem BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) Stamm extrahiert, der mit pAR1219 Plasmid überexzierende T7-RNA-Polymerase umgewandelt wird, um die CFPS-Potenz und Proteinsynthese zu erhöhen. Dieses System wurde zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Proteine mit Molekulargewichten von bis zu 66 kDa in vitro und in vivo19,31verwendet. Das folgende Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode zur Herstellung des synthetischen Zellsystems, die eine Vielzahl grundlegender Fragen im Zusammenhang mit der Proteinsynthese in der Natur angehen und auch für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden kann.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
ANMERKUNG: Abbildung des vollständigen Produktionsprotokolls der synthetischen Zellen ist in Abbildung 1dargestellt. Je nach Bedarf des Anwenders können die Proteinexpression (Abschnitt 3.2) und die synthetische Zellbildung (Abschnitt 4) Teile des Protokolls auch unabhängig (mit einigen Anpassungen) durchgeführt werden.
1. Herstellung von S30-T7-Lysat
- Streifenplatte die E. coli BL21(DE3) Bakterien transformiert mit der T7 RNA Polymerase exzessimitieren pAR1219 Plasmid auf einer LB-Agar-Platte mit 50 g/ml Ampicillin ergänzt, um einzelne Kolonien zu erhalten.
- Bereiten Sie eine Starterlösung vor: Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml LB-Medien, ergänzt mit 50 g/ml Ampicillin in einem 100 ml Erlenmeyer Kolben und wachsen Sie über Nacht mit einem Bodeninkubator-Shaker bei 250 U/min und 37 °C. Vorbereiten von Duplikaten.
- Impfen Sie jeweils 5 ml Starter separat in 500 ml TB-Medien, ergänzt mit 50 g/ml Ampicillin in einem 2 L ErlenmeyerKolben mit Baffeln und züchten Sie ihn mit einem Bodeninkubator-Shaker bei 250 U/min und 37 °C, bis er OD600 von 0,8-1 erreicht. Überwachen Sie dies regelmäßig mit einem Spektralphotometer.
- Zur Induktion der T7-RNA-Polymerase-Expression 2-3 ml von 100 ml IPTG-Bestand (bis zu 0,4 - 0,6 mM) hinzufügen und die Kultur weiter wachsen lassen, bis sie OD600erreicht.
- Übertragen Sie die Lösung aus jedem Erlenmeyerkolben in zwei 250 ml sterilisierte Zentrifugenrohre.
- Zentrifuge bei je 7.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
HINWEIS: In diesem Stadium kann das bakterielle Pellet bei -20 °C für einige Tage gelagert werden, bevor es mit den nächsten Schritten fortschreitet. - Jedes Pellet in 250 ml kalt (4 °C) S30 Lysatpuffer und Zentrifuge bei 7.000 x g für 10 min bei 4 °C wieder aufsetzen.
HINWEIS: Der S30-Lysatpuffer wird zur Aufrechterhaltung der Proteinstabilität verwendet, nachdem die Zelllyse mit dem Homogenisator in Schritt 1.9 durchgeführt wurde. Von diesem Schritt nach vorn sollten alle Schritte bis 1.12 nacheinander und schnell durchgeführt werden.
ANMERKUNG: Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, kühlen Sie die Spitzen und 1,5-Milliliter-Fläschchen, die für die Lagerung des - Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie alle Pellets zusammen in 15 ml kaltem S30-Lysatpuffer wieder auf. Filtern Sie die Aufhängung mit Gazepad.
HINWEIS: 15ml Lösung ist durch Homogenisator min. Volumen. Beachten Sie, dass bakterienkonzentration ist auch wichtig. - Homogenisieren Sie bei einem Arbeitsdruck von 15.000 psi, mit einem Luftdruck von 4 bar (zwei Durchgänge) für Zellbruch. Vermeiden Sie eine Lösungsverdünnung für ein konzentrierteres und aktiveres Lysat.
- Fügen Sie 100 l 0,1 M DTT (VORSICHT) pro 10 ml der homogenisierten Suspension hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 24.700 x g für 30 min bei 4 °C.
- Führen Sie schnell den folgenden Schritt aus, um die Lysataktivität zu erhalten: Teilen Sie den Überstand eins nach dem anderen in 200 L-Aliquots in vorgekühlten 1,5 ml-Durchstechflaschen auf und fangen Sie sie sofort mit flüssigem Stickstoff ein. Bei -80 °C für die weitere Verwendung aufbewahren.
VORSICHT: DTT wird als reizend und schädlich eingestuft und sollte daher mit Vorsicht behandelt werden.
2. Herstellung von Lipiden in Öllösung
- POPC und Cholesterin in Chloroform (VORSICHT) separat auflösen, jeweils bis zu einer Endkonzentration von 100 mg/ml. Wirbel jede Durchstechflasche separat.
- Kombinieren Sie die Komponenten in einer 2ml Glasdurchstechflasche: fügen Sie 50 l POPC in Chloroform, 50 l Cholesterin in Chloroform und 500 l Mineralöl hinzu. Für 100 l synthetische Zellen werden 2 Durchstechflaschen mit Lipiden in Öl benötigt.
- Wirbel, und dann erhitzen für etwa 1 h bei 80 °C in einer chemischen Haube, um die Chloroform zu verdampfen. Stellen Sie sicher, dass die vollständige Verdampfung erfolgt ist, indem Sie die angegebenen Zeiten/Bedingungen befolgen und das Lösungsvolumen überwachen.
HINWEIS: Die resultierende Lipid-in-Öl-Lösung kann bis zu zwei Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden. Für verbesserte Ergebnisse wird empfohlen, vor jedem Experiment eine neue Zubereitung zu verwenden. Lipid- und Cholesterinverhältnisse können entsprechend der gewünschten Membranzusammensetzung verändert werden. Eine hohe Konzentration von Cholesterin kann zur Bildung von Aggregaten in der endgültigen synthetischen Zelllösung führen.
VORSICHT: Chloroform wird als reizend und schädlich eingestuft und sollte daher mit Vorsicht und in Bereichen mit Rauchextraktion behandelt werden.
3. Zubereitungen von Außen-, Vor- und Fütterungslösungen
- Vorbereitung von Bestandslösungen
- Bereiten Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Lagerlösungen mit Reinstwasser (UPW) vor.
HINWEIS: Lagerlösungen sollten im Voraus vorbereitet und bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. Reagenz 7 neigt dazu, Aggregate zu bilden. Die Erwärmung auf 37 °C reduziert die Aggregation. Eine leichte Aggregation wird die Reaktion nicht signifikant beeinflussen. Reagenz 8 Lösung ist milchig und trüb.
- Bereiten Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Lagerlösungen mit Reinstwasser (UPW) vor.
- Äußere Lösung
- Glukose in DNase/RNase-freiH2 Obis zu einer Endkonzentration von 200 mM auflösen.
- Für 100 l innenlösung, bereiten Sie 1,6 ml außenlösung.
- Vorinnere Lösung
- Reagenzien 1-14 entsprechend den in Tabelle 2aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzufügen. Zum Beispiel für ein endgültiges synthetisches Zellvolumen von 100 l, bereiten Sie 100 l innere Lösung vor.
HINWEIS: UPW sollte hinzugefügt werden, um das endgültige erforderliche Volumen abzuschließen. In diesem Stadium kann die Mischung bei 4 °C für einige Stunden gelagert werden.
- Reagenzien 1-14 entsprechend den in Tabelle 2aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzufügen. Zum Beispiel für ein endgültiges synthetisches Zellvolumen von 100 l, bereiten Sie 100 l innere Lösung vor.
- Fütterungslösung
- Fügen Sie alle Reagenzien entsprechend den in Tabelle 3 aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzu.
HINWEIS: Verwenden Sie das Verhältnis 1:1 der Zuführlösung:innenlösung. Für ein endgültiges synthetisches Zellvolumen von 100 l 100 l Fütterungslösung vorbereiten. Es wird empfohlen, ein kleines Überschüssiges Volumen an Außen-, Innen- und Fütterungslösung vorzubereiten.
- Fügen Sie alle Reagenzien entsprechend den in Tabelle 3 aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzu.
4. Herstellung synthetischer Zellen
ANMERKUNG: Die folgenden Volumina werden für die Herstellung von 100 l synthetischen Zellen angepasst.
- Synthetische Zellen, die Protein produzieren
- In einem 15 ml Rohr 12 ml der äußeren Lösung platzieren und langsam, oben eine Schicht, von 500 l Lipiden in Öllösung hinzufügen. Bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.
- Um die innere Lösungszubereitung fertigzustellen: Mischen Sie die Inhaltsstoffe der inneren Lösung auf zerkleinertem Eis auf ein Endvolumen von 100 l, indem Sie auftauen und S30-T7 Lysat (Reagenz 15) und DNA-Plasmid (Reagenz 16) in die gelagerte Mischung einfügen.
- Zur zweiten 2 ml Glasdurchstechflasche mit 500 l Lipiden in Öllösung 100 l der inneren Lösung hinzufügen. Pipette kräftig für 1 Minute und Wirbel für eine weitere Minute auf Ebene fünf.
- 10 min auf zerkleinertem Eis brüten und die resultierende Emulsion langsam auf die Ölphase in das 15 ml-Rohr (ab 4.1.1) geben.
- Zentrifuge für 10 min bei 100 x g und 4 °C und dann Zentrifuge für 10 min bei 400 x g und 4 °C. Am Ende der Zentrifugation sollte ein Pellet an der Unterseite des Rohres beobachtet werden.
HINWEIS: Die Verwendung eines schwingenden Schaufelzentrifugenrotors wird hier bevorzugt, um eine bessere Abdeckung einer zweiten Lipidschicht während des Durchgangs der Wasser-in-Öl-Tröpfchen durch die Interphase zu erhalten. Falls kein beobachtbares Pellet vorhanden ist, kann die Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 1000 x gerhöht werden. Andernfalls lesen Sie den Abschnitt Diskussion, der sich auf die spezifische Schwere der äußeren Lösung bezieht. - Extrahieren Sie das Pellet.
- Überschüssige Ölschicht entfernen.
- Verwenden Sie eine getrimmte Pipettenspitze, die mit ca. 400 l Außenlösung beladen ist, um das Pellet zu extrahieren. Lassen Sie die äußere Lösung während der Ölphase los, um nur das Pellet in der wässrigen Phase zu sammeln.
- Wischen Sie die Spitze nach der Extraktion des Pellets ab, um ölrestige Ölreste zu vermeiden, und übertragen Sie das Pellet in ein sauberes 1,5 ml-Rohr.
- Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g und 4 °C, den Überstand entfernen und das Pellet in 100 l Fütterungslösung (1:1 Verhältnis von Innen-:Fütterungslösungen) wieder aufhängen.
HINWEIS: Hier kann auch ein Zentrifugerotor mit festem Winkel verwendet werden. - Zur Proteinexpression 2 Stunden bei 37 °C ohne Schütteln inkubieren.
HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit variiert zwischen verschiedenen Proteinen. - Bewerten Sie die produzierte Proteinmenge mit einer geeigneten Methode entsprechend den Zielproteineigenschaften.
- Empfohlene Kontrollgruppen
- Innere Lösung und Lysataktivitätsbestätigung
- Bereiten Sie eine komplette innere Lösung (mit DNA & S30-T7 Lysat) vor.
- Sofort die Reaktion oben mit einem Bodeninkubator-Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute oder einem Thermomixer bei 1200 Umdrehungen pro Minute bei einer konstanten Temperatur von 37 °C für 2 h inkubieren.
HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit an die Inkubationszeit der synthetischen Zellen an.
- Synthetische Zellen
- Negative Kontrollgruppe: Bereiten Sie das in 4.1 vorgestellte Protokoll mit innerer Lösung ohne DNA vor.
- Positive Kontrolle: Bereiten Sie das in 4.1 vorgestellte Protokoll mit einer inneren Lösung vor, die eine T7-Plasmid-Codierung für ein Reportergen enthält.
HINWEIS: Fügen Sie eine positive Kontrollgruppe hinzu, die aus einem Reportergen, z. B. sfGFP, besteht, neben den Testgruppen, um den Kapselungseffizienzschritt sicherzustellen.
- Innere Lösung und Lysataktivitätsbestätigung
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung synthetischer Zellen, indem wir ein S30-T7 CFPS-System auf Basis von BL21 E. coli in Lipidbläschen verkapseln. Eine schematische Beschreibung des Vorbereitungsprozesses, die ein Bild der einzelnen Stufen enthält, ist in Abbildung 2dargestellt. Der Erfolg des synthetischen Zellvorbereitungsprozesses hängt von der entsprechenden Leistung der einzelnen Stufen ab und wird durch unterschiedliche Parameter bewirkt. Das Protokoll sollte angepa...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Mit diesem Protokoll wird eine einfache und erschwingliche Methode zur Herstellung großer Mengen proteinproduzierender synthetischer Zellen eingeführt. Die Ausbeute aktiver Zellen hängt von einer sorgfältigen und genauen Ausführung des Protokolls ab, wobei der Schwerpunkt auf mehreren kritischen Schritten liegt. Im Lysatpräparat dieser Methode ist es wichtig, die entsprechende Bakteriendichte vor der Zelllyse zu erreichen, um eine ausreichende Menge an Proteinen im bakteriellen Lysat zu erreichen. Zweitens sollte der Lys...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von ERC-STG-2015-680242 unterstützt.
Die Autoren würdigen auch die Unterstützung des Technion Integrated Cancer Center (TICC); das Russell Berrie Nanotechnology Institute; das Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; das israelische Wirtschaftsministerium für einen Kamin-Zuschuss (52752); das israelische Ministerium für Wissenschaftstechnologie und Raumfahrt – Büro des Chefwissenschaftlers (3-11878); die Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); der Israel Cancer Association (2015-0116); die Deutsch-Israelische Stiftung für wissenschaftliche Forschung und Entwicklung für ein GIF-Young-Stipendium (I-2328-1139.10/2012); das FP-7 IRG-Programm der Europäischen Union für einen Stipendien für die berufliche Eingliederung (908049); das Phospholipid Research Center Grant; eine Rosenblatt Foundation for Cancer Research, ein Mallat Family Foundation Grant; und der Familienstiftung Unger. A. Schroeder würdigt Alon und Taub Fellowships. O. Adir würdigt die Sherman- und Gutwirth-Stipendien. G. Chen erkennt die Sherman Fellowship an. N. Krinsky würdigt das Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program der Rothschild Caesarea Foundation.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
100 mL <
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| A. Erforderliche Reagenzien für Schritt 1 (S30-T7-Lysatzubereitung) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron-Vektor für die Transformation. |
| Stammlösung von 50 mg/ml Ampicillin | Sigma | A9518 | Bei -20 μC gelagert. |
| 10 g/L Bacto-Trypton | BD Bioscience | 211705 | Zur Zubereitung von Luria Bertani (LB) Agar (1,5%) Platte. |
| 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Hefe-Extrakt | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar Agar gereinigt | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µ g/ml Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/l Bacto-Trypton | BD Bioscience | 211705 | Zur Vorbereitung von Luria Bertani (LB) Medien (20 mL). |
| 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Hefe-Extrakt | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 & Mikro; g/ml Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/l Bacto-Trypton | BD Bioscience | 211705 | Zur Zubereitung von Terrific Broth (TB) Medien (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Hefe Extrakt | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerin wasserfrei | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | Spectrum Chemikalie | P1383 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | Spectrum Chemikalie | P1380 | |
| 50 & Mikro; g/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stammlösung von 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Gefiltert mit 0,2 &; Mikro; m hydrophiler PVDF-Spritzenvorsatzfilter. |
| Stammlösung von 0,1 M Dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Gefiltert mit 0,2 &Mikro; m hydrophiler PVDF-Spritzenvorsatzfilter. |
| 10 mM Tris-Acetat bei pH = 7,4 | Sigma | T1503 | S30 Lysatpuffer (1,5 l) |
| 14 mM Magnesiumacetat | Merck | 1,05819.0250 | |
| 60 mM Kaliumacetat | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0,5 mL/L 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Erforderliche Ausrüstung für Schritt 1 | |||
| sterilisierte Erlenmeyerkolben | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 Flaschen |
| 2 L sterilisierte Erlenmeyerkolben mit Leitblechen | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 Kolben |
| Bodeninkubator Schüttler | MRC | TOU-120-2 | Laborschüttler Inkubator 450x450mm, 400rpm, 70 ° C |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Festwinkelrotor. Sollte mindestens 13.000 x g. * Vorgekühlt auf 4 °C. |
| Hochdruck-Homogenisator | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Vorgekühlt auf 4 °C. |
| -80oC Gefrierschrank | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilisierte 1,5 mL Kunststoffröhrchen | Eppendorf | 30120086 | Vorzugsweise vorgekühlt auf -20 °C. |
| Spektralphotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-Well-transparente Platte | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilisierter Messzylinder | Corning | ||
| Sterilisierte Zentrifugenröhrchen | Eppendorf | 30120086 | Vorzugsweise vorgekühlt auf -20 °C. |
| Sterilisierte Pipettenspitzen | Corning | Vorzugsweise vorgekühlt auf -20 °C. | |
| Crushed Ice Bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Kleiner Flüssigstickstofftank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Erforderliche Reagenzien für Schritt 3 (Lipide in der Herstellung der Öllösung): | |||
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) | Lipoid | 556400 | Pulver |
| Cholesterin | Sigma | C8667 | Pulver |
| Chloroform | Bio-Labor | 3082301 | |
| Mineralöl | Sigma | M5904 | Leichtöl |
| Ausrüstung erforderlich für Schritt 2Vortex-Mischer | |||
| Wissenschaftliche Industrie | SI-0256 | ||
| Heizblock | TECHNE | FDB03AD | Vorgeheizt auf 80 °C. Sollte eine kontrollierte Temperatur ermöglichen. |
| 2-ml-Glasfläschchen mit Schraubhals | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | Für einen größeren Maßstab verwenden Sie 50-ml-Falken und verdampfen Sie das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer. |
| 9 mm Schraubverschluss | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| strong>C. Erforderliche Reagenzien für Schritt 3 (innere und zugeführte Reaktionsgemische): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH-Puffer |
| Kaliumhydroxid (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesiumacetat | Merck | 1.05819.0250 | Co-Faktor und negativer Ladungsstabilisator. |
| 1 M Kaliumacetat | Carlo Erba | 470147 | Stabilisator mit negativer Ladung. |
| 5.2 M Ammoniumacetat | Merck | 1.01116.1000 | Stabilisiert negative Ladung. |
| 50% (w/v) Polyethylenglykol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Erhöht die Konzentration der Makromoleküle. |
| 0,5 M 3-Phosphoglycerat (3-PGA) | Sigma | P8877 | Sekundäre Energiequelle. |
| 50 mM Aminosäuren-Mischung I | Sigma | LAA21-1KT | Aminosäuren Zusatz. Enthält: 50 mM von jeder der folgenden 17 natürlichen Aminosäuren - Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Prolin, Serin, Threonin und Valin. |
| 50 mM Aminosäuren Mischung II | Sigma | LAA21-1KT | Aminosäuren Zusatz. Enthält: 50 mM jeder der folgenden 3 natürlichen Aminosäuren - Tryptophan, Phenylalanin und Tyrosin. |
| 100 mM Adenintriphosphat (ATP) | Sigma | A3377 | Nukleotide & Energiequelle. |
| 50 mM Guanidintriphosphat (GTP) | Sigma | G8877 | Nukleotide & Energiequelle. |
| 100 mM Uridintriphosphat (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nukleotidzusatz. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Induktion der Expression von Genen. |
| 2 M Saccharose | J.T. Baker | 1933078 | Erzeugung eines Dichtegradienten. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Erzeugung eines Dichtegradienten. |
| H2O Reinstwasser (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNasefreies |
| S30-T7-Lysat | _ | _ | Hergestellt in Schritt 1. Quelle der Transkription & translation components. Speichern bei -80 ° c, Tauen auf abgestürztem Eis kurz vor der Verwendung. |
| Vorrat an DNA-Plasmid nach Wahl | _ | _ | Enthält die Sequenz für das angeforderte Protein. Unter T7 promotor |
| D. Erforderliche Ausrüstung für Schritt 4 (Vorbereitung synthetischer Zellen) | |||
| Boden-Inkubator-Schüttler oder Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Labor-Schüttel-Inkubator 450x450 mm, 400 U/min, 70 &Grad; C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomischer-Zentrifuge | |
| Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400 mL Ausschwingender Schaufelrotor. Geeignet für Röhrchen mit einer Größe von 15 mL. Vorzugsweise schwenkbare Eimer. Sollte mindestens 1000 x g. Vorgekühlt auf 4 μC ermöglichen. | |
| Tischzentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1,5/2,0 mL Rotor mit ClickSeal. Geeignet für Eppendorf Vials. Vorgekühlt auf 4 & Grad. |
| Vortex-Mischer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed Ice Bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL Schraubhals-Glasfläschchen | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL Kunststoffröhrchen | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilisierte 1,5 mL Kunststoffröhrchen | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilisierte Pipettenspitzen | Corning | Sterilisiert im Autoklaven. |
Referenzen
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
