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Methodenartikel

Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

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DOI:

10.3791/60849

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27. Mai 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung biologischer Kryoproben für Synchrotron-basierte Röntgenabsorptionsspektroskopie-Experimente vor. Wir beschreiben alle Schritte, die zur Optimierung der Probenvorbereitung und Kryokonservierung erforderlich sind, anhand von Beispielen für das Protokoll mit Krebs- und Phytoplanktonzellen. Diese Methode bietet einen universellen Standard für die Kryopräparation von Proben.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Elementen mit Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) ist von besonderem Interesse, wenn es darum geht, die Rolle von Metallen in biologischen Systemen zu untersuchen. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiges und oft komplexes Verfahren, insbesondere für biologische Proben. Obwohl Röntgenspeziationstechniken weit verbreitet sind, wurde noch kein detailliertes Protokoll für Benutzer der Technik verbreitet. Darüber hinaus ist die Modifikation des chemischen Zustands besorgniserregend, und kryobasierte Techniken werden empfohlen, um die biologischen Proben in ihrem fast nativen hydratisierten Zustand zu analysieren, um die maximale Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen oder Gewebe zu gewährleisten. Hier schlagen wir ein zelluläres Präparationsprotokoll vor, das auf kryokonservierten Proben basiert. Es wird in einer hochauflösenden fluoreszenzdetektierten Röntgenabsorptionsspektroskopie von Selen in Krebszellen und einer Studie von Eisen in Phytoplankton demonstriert. Dieses Protokoll kann mit anderen biologischen Proben und anderen Röntgentechniken verwendet werden, die durch Bestrahlung beschädigt werden können.

Einleitung

Die Untersuchung der zellulären Biotransformationen essentieller oder toxischer Elemente erfordert Speziationstechniken mit hoher Empfindlichkeit und sollte die Probenvorbereitungsschritte minimieren, die häufig zur Modifikation chemischer Spezies neigen.

Es ist bekannt, dass physiologische Elemente wie Selen und Eisen aufgrund ihrer komplexen Chemie, der verschiedenen Eigenschaften der Selen- oder Eisenspezies und ihrer geringen Konzentration im ppm- (mg/kg) oder sogar sub-ppm-Bereich besonders schwer zu speziieren sind. Daher kann das Studium der Speziation dieser Elemente durch XAS äußerst schwierig sein. Synchrotron XAS und insbesondere hochauflösende fluoreszenzdetektierte XAS (HERFD-XAS), die ein sehr niedriges Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis1 ermöglichen, stehen an Synchrotronquellen zur Verfügung, um hochverdünnte Elemente in komplexen biologischen Matrizen zu spezitieren 2,3. Herkömmliche Fluoreszenz-XAS-Messungen können mit einem energieaufgelösten Festkörperdetektor (SSD) mit einer Energiebandbreite von ~150–250 eV auf der CRG-FAME-Beamline an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4 durchgeführt werden, während HERFD-XAS-Messungen ein Kristallanalysatorspektrometer (CAS) mit einer Energiebandbreite von ~1–3 eV auf der CRG-FAME-UHD-Beamline am ESRF2 benötigen. . Fluoreszenzphotonen werden hinsichtlich ihrer Energie bei elektronischen bzw. optischen Verfahren diskriminiert.

Die Kryopräparation der Probe ist unerlässlich, um Strukturen zu erhalten und die chemische Integrität der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten, wodurch eine Analyse nahe am biologischen nativen Zustandermöglicht wird 5. Darüber hinaus ermöglichen Analysen, die bei kryogenen Temperaturen von bis zu 10 K mit flüssiger heliumkryogener Kühlung (LN2) durchgeführt werden, eine Verlangsamung der Strahlenschäden und die Erhaltung der Elementartbildung für XAS. Obwohl einige Übersichtsarbeiten zu XAS-Techniken, die auf biologische Proben angewendet werden, die Notwendigkeit der Vorbereitung und Analyse von Proben unter kryogenen Bedingungen berichten (z. B. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beschreibt keiner von ihnen eindeutig das zugehörige detaillierte Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird ein Verfahren zur Kryopräparation von Krebszellen und Planktonmikroorganismen für die HERFD-XAS-Speziation von Se8 und Fe9 bei kryogener Temperatur beschrieben.

Gute Praktiken für die Probenvorbereitung und -umgebung bei hochmodernen XAS-Spektroskopiemessungen erfordern 1) eine Einrichtung; 2) ein Analyseverfahren, das die Auswirkungen von Strahlenschäden so weit wie möglich begrenzt; und 3) eine Probe (oder Modellverbindungsreferenz), die in Bezug auf die Strahlgröße der Röntgenphotonen so homogen wie möglich ist. Der erste Punkt wird berücksichtigt, indem die Erfassung bei niedriger Temperatur unter Verwendung eines flüssigen Heliumkryostaten durchgeführt wird. Der zweite Punkt wird behandelt, indem jede Akquisition auf einem frischen Bereich der Probe durchgeführt wird, indem sie in Bezug auf den Balken bewegt wird. Unter Berücksichtigung der dritten Bedingung werden schließlich Proben (Pellets) und Referenzen (Pulver) in gepressten Bulk-Pellets konditioniert, um Porositäten und Inhomogenitäten so weit wie möglich zu begrenzen und Rauheiten in Bezug auf die Strahlgröße auf der röntgensondierten Probenoberfläche zu vermeiden. Wir erklären, wie das Protokoll mit all diesen Punkten umgeht.

Wir verwendeten die humane Prostatazelllinie PC-3 (hohes metastasierendes Potenzial) und die Eierstockzelllinie OVCAR-3 (die bis zu 70% aller Eierstockkrebsfälle ausmacht), um die antiproliferativen Eigenschaften von Krebszellen von Selennanopartikeln (Se-NPs) und Phaeodactylum tricornutum diatomee als Modellspezies zur Untersuchung der Eisensequestrierung in Phytoplankton zu untersuchen.

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Protokoll

1. Herstellung der humanen PC-3- und OVCAR-3-Krebszellpellets für die Selenspeziation

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Weekley et al.10 übernommen. Alle Schritte müssen unter einer Zellkulturhaube unter Bedingungen und Einschränkungen der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden.

  1. Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zellzählkammer. Samen Sie 150.000-200.000 Zellen pro Flasche für die PC-3-Zelllinie und 300.000 Zellen für die OVCAR-3-Zelllinie.
  2. Samenzellen in T-75-Kolben (drei Kolben pro Zustand, um Verdreifachungen zu haben) in den geeigneten Zellkulturmedien (Tabelle 1) unter der Laminar-Flow-Haube.
  3. Lassen Sie die Zellkulturen in einem Inkubator bei 37 °C und einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 wachsen, bis sie 80% Konfluenz erreichen. Normalerweise verdoppeln sich PC-3-Prostatakrebs-Zelllinien nach 24 Stunden, während OVCAR-3-Eierstockkrebs-Zelllinien 72 Stunden benötigen. Die Flaschen müssen im Inkubator belassen werden.
  4. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die zur Behandlung verwendeten Se-NPs auf eine Endkonzentration, die der IC20 (inhibitorische Konzentration zur Erzielung eines Zelltods von 20%) entspricht, die durch den MTT-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) zur Beurteilung der Zytotoxizität vorbestimmt wurde. Diese Konzentrationen sind spezifisch für jeden Se-NPs-Typ, aber auch spezifisch für die untersuchte Zelllinie.
    1. Die Nanopartikel-Stammlösung (2 mg/ml Rinderserumalbumin [BSA] oder Chitosan-beschichtete Se-NPs) 30 min lang bei Raumtemperatur (RT) in ein Ultraschall-Wasserbad geben.
    2. Verdünnen Sie die Se-NPs-Lösung durch serielle Verdünnungen in vollständigem Zellkulturmedium, um Arbeitskonzentrationen zu erreichen. Zwischen jeder Verdünnung 1 min vorwirbeln.
  5. Bereiten Sie eine Selen-Positivkontrolle mit verdünntem Selensalz zur Behandlung vor.
    1. Bereiten Sie eine wässrige Natriumselenit-Stammlösung (1 mg / ml) in einem 15 ml Polypropylenröhrchen vor. Mischen Sie 1 mg Natriumselenitpulver mit 1 ml Reinstwasser.
    2. Wirbeln Sie die Stammlösung für 1 min ein.
    3. Verdünnen Sie die Natriumselenit-Stammlösung durch serielle Verdünnungen in vollständigem Zellkulturmedium, um Arbeitskonzentrationen zu erreichen.
      HINWEIS: Vergessen Sie nicht, vor jeder Verdünnung mehrmals zu pipettieren, um die Lösung zu homogenisieren.
  6. Setzen Sie die Krebszellen Selenbehandlungen aus.
    HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls muss für jedes getestete Nanopartikel (NP) wiederholt werden. Hier handelt es sich um zwei Typen, BSA- und Chitosan-beschichtete Se-NPs sowie die Kontrollen. Die Natriumselenitlösung ist die Positivkontrolle und keine Behandlung ist die Negativkontrolle.
    1. Öffnen Sie die drei T-75-Kolben, die die Zellen in der Laminar-Flow-Haube enthalten.
    2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig 2x mit 5 ml erwärmter (37 °C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    3. Fügen Sie vorsichtig auf der Unterseite des Kolbens und nicht direkt auf der Zellschicht 15 ml der Behandlung in jeden Kolben mit einer automatischen Pipette hinzu, die mit 25 ml sterilen Kunststoffpipetten ausgestattet ist. Legen Sie die Deckel auf die Kolben. Schließen Sie die Deckel nicht fest.
      HINWEIS: Wie in den Schritten 1.3 und 1.4 beschrieben, müssen Behandlungslösungen zuvor resuspendiert worden sein, um homogenisiert zu werden.
    4. Lassen Sie die drei Kolben horizontal in einem Inkubator bei 37 °C und einer mit 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre für 24 hbefeuchten .
  7. Aufbereitung der Zellpellets
    1. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 2x mit 5 ml erwärmtem PBS (37 °C) direkt in den T75-Kolben.
    2. Fügen Sie 6 ml erwärmtes Zellkulturmedium (37 °C) auf die Zellschicht im T-75-Kolben mit einem Pipettenjungen hinzu, der mit sterilen 10-ml-Kunststoffpipetten ausgestattet ist.
    3. Sammeln Sie die Zellen durch sanftes Schaben mit einem Zellenschaber ein. Verwenden Sie einen Zellenschaber pro Kolben.
    4. Mit einem Pipettenjungen und einer 10-ml-Pipette saugen Sie die Flüssigkeit ab und spülen die Zelle / das Medium auf der Kolbenoberfläche zurück, um alle Zellen zu sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals, um die Zellen zu dissoziieren und zu individualisieren. Sammeln Sie das Medium, das die Zellen enthält, in einem 15 ml Polypropylenröhrchen.
    5. Drehen Sie sich bei 250 x g für 5 Minuten bei RT nach unten.
    6. Spülen Sie die Zellen aus, indem Sie sie in 5 ml PBS resuspendieren.
    7. Drehen Sie bei 250 x g für 5 Minuten bei RT nach unten. Saugen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie die Schritte 1.6.5 und 1.6.6 2x, um alle verbleibenden Spuren der Behandlung zu beseitigen.
    8. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Polypropylenröhrchen. Zum Schluss drehen Sie sie bei 250 x g für 5 min bei RT nach unten. Abbildung 1 zeigt das Zellpellet, das nach dem Zentrieren und Verwerfen des Überstands erhalten wurde.
    9. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten PBS-Überstand mit einer 200-μL-Pipette.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu berühren und zu beschädigen. Idealerweise sollte das Pellet 2–3 mm hoch oder dick sein, mit einem Durchmesser von 3–6 mm. Für die PC-3-Zelllinie werden 9 x 10 6–10x 106 Zellen für den Assay benötigt. Für die OVCAR-3-Zelllinie werden 8 x 10 6–9 x 106 Zellen benötigt (Abbildung 1). Einige Zellen werden wahrscheinlich während der nachfolgenden Pufferspülschritte verloren gehen. Je höher die Zellzahl, desto besser wird das Pellet sein.
  8. Schockgefrieren der Zellpellets
    1. Tauchen Sie den unteren Teil des 1,5-ml-Rohrs, das das Pellet enthält, in flüssigem Stickstoff (LN2) auf die Höhe des Zellpellets.
    2. Sammeln Sie in einem Handschuhfach, das vollständig mit einer inerten Atmosphäre wie Stickstoffgas gespült wird, das Zellpellet, indem Sie das 1,5-ml-Rohr vorsichtig auf die flache Oberfläche eines LN 2-gekühlten Kupferblocks klopfen (Abbildung 2). Das Pellet wird dann ohne Zellverlust gesammelt.
      HINWEIS: Verwenden Sie Kryoschutzausrüstung, Laborkittel, geschlossene Schuhe, Kryohandschuhe und einen Gesichtsschutz oder eine Schutzbrille für die LN2-Handhabung.
    3. Bei Bedarf kann eine LN2 gekühlte Nadel verwendet werden, um das Pellet herauszunehmen.
      HINWEIS: Das resultierende gefrorene Zellpellet kann fragmentieren. Diese Schritte müssen innerhalb weniger Minuten durchgeführt werden und sich auf die Geschicklichkeit und Geschwindigkeit des Forschers verlassen.
    4. Die Abmessungen des gefrorenen Pellets müssen zum Kryostat-Probenhalter passen. Wenn das Zellpellet größer als 2 mm hoch und etwas kleiner als das für XAS verwendete Loch des Probenhalters ist, kann die Probe mit der beschriebenen Ausrüstung direkt verwendet werden. Wenn nicht, oder wenn eine flache Oberfläche für die Analyse gewünscht wird, muss ein zylindrisches Bulk-Pellet vorbereitet werden, das das Pellet immer noch in seinem gefrorenen Zustand hält. Wenn das Zellpellet fragmentiert ist, können die folgenden Schritte idealerweise in einem Handschuhfach verwendet werden, das vollständig mit einer inerten Atmosphäre gereinigt wird.
  9. Aufbereitung der in großen Mengen gefrorenen zylindrischen Pellets
    1. Tauchen Sie alle Teile einer manuellen hydraulischen Presse in LN2 ein, die mit der Probe in Berührung kommen (Abbildung 3A; Pelletwerkzeuge mit einem Durchmesser von 3 oder 5 mm, Form, Kolben-/Drahtziehen).
    2. Die schnell eingefrorenen Pelletfragmente werden in die mit den entsprechenden Pelletsdüsen beladene Form überführt (Abbildung 3B).
    3. Schnelle Granulierung mit der hydraulischen Presse. Die Verwendung von 1,5 Tonnen für ein Pellet mit einem Durchmesser von 5 mm oder 0,5 Tonnen für ein Pellet mit einem Durchmesser von 3 mm ist ausreichend (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Nach jeder Pelletvorbereitung mit der hydraulischen Presse müssen alle Materialien ordnungsgemäß mit Stickstoffgas aufgetaut und getrocknet werden, um Probleme mit dem verbleibenden Frost und der verbleibenden Feuchtigkeit zu vermeiden.
    4. Sammeln Sie das Bulk-Pellet der gefrorenen Zellen schnell und legen Sie es zur Lagerung in ein geeignetes Kryoröhrchen.
    5. Lagern Sie es zur Langzeitlagerung wieder in den LN2-Tank .
    6. Übertragen und montieren Sie die Kryo-Pellets zur Analyse. Das in einem LN2-gekühlten Kryoröhrchen gelagerte Pellet wird in flüssigemN2 in einen 77 K vorgekühlten Kryostat-Probenhalter überführt (Abbildung 4, wie für eine CRG-FAME-UHD-Beamline verwendet). Dieser Schritt sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, kann aber einige Minuten dauern. Übertragen Sie dann den Probenhalter in den Kryostaten und halten Sie ihn während der gesamten XAS-Analyse bei 10 K.
      HINWEIS: Die Schritte 1.9.3 und 1.9.6 sind schwierig, da sie schnell durchgeführt werden müssen, um Frostbildung zu vermeiden, die den Kolben und die Form blockiert. Eine Alternative besteht darin, diese Schritte unter einem Kunststoffzelt durchzuführen, das vollständig mit Stickstoffgas gereinigt wird. Die LN2-kühle Kupfermasse ermöglicht es, das Pellet gefroren zu halten.

2. Vorbereitung der Planktonzellen für die Eisenspeziation

HINWEIS: Synthetisches Meerwasser, das für dieses Protokoll verwendet wird, wurde durch Zugabe von Meersalzen aus Reinstwasser, Morpolinopropansulfonsäure, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Natriummetasilikatpentahydrat, monobasischem Natriumphosphat, Vitaminstock, Spurenmetallstock, Antibiotikastock und HEPES-Puffer bei pH = 7,9 hergestellt. Die Konzentrationen der einzelnen Komponenten sind in der Materialtabelle angegeben. Details zur Kultur finden Sie in Sutak et al.11

  1. Eine P. tricornutum-Kieselalgenkultur in einem 50 ml Polypropylenröhrchen bei 1.100 x g für 6 min zentrifugieren und das Pellet in einen Kolben mit frischem Medium geben.
  2. Lassen Sie die Kultur in synthetischem Meerwasser in einer Wachstumskammer für 24 h wachsen.
  3. Zentrifugieren Sie die Planktonkultur für 6 min bei 1.100 x g und geben Sie das Pellet in frisches Medium, das Fe-Citrat enthält (1 μM in der Endkultur). Inkubiere für 72 h.
  4. Vorbereiten der Planktonzellen
    1. Die Zellen 3 min bei 1.100 x g zentrifugieren und mit Medium ohne Eisen abspülen.
    2. Das Pellet in ein 1,5 ml Polypropylenröhrchen geben, mit Reinstwasser waschen und 2x für 3 min bei 1.100 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
    3. Tauchen Sie den unteren Teil des 1,5 ml Polypropylenrohrs, das das Pellet enthält, in LN2 ein, wie in Schritt 1.8 beschrieben.
    4. Die gefrorenen Zellen werden in eine LN 2-Tiefkühlmolder überführt und mit einerRFA-Pelletpresse (Abbildung 3 und Abbildung 7) schnell gepresst, wie in Schritt 1.9 beschrieben.
    5. Entfernen Sie das Pellet und lagern Sie es in einem LN2-Tank zur Langzeitlagerung.
    6. Befolgen Sie Schritt 1.9.6 (siehe Abbildung 4 für den Transfer in den Kryostat-Probenhalter).

3. Vorbereitung und Messung der Referenzverbindung

HINWEIS: Referenzverbindungen (fest oder flüssig), die für die Spezies repräsentativ sind und voraussichtlich im biologischen System gefunden werden, müssen von XAS für den Vergleich mit experimentellen biologischen Proben vorbereitet und analysiert werden. Referenzspektren finden sich auch in den Datenbanken12,13,14 und können verwendet werden, sofern die Messbedingungen (z.B. spektrale Auflösung) den experimentellen Proben ähnlich waren.

  1. Für Referenzen in wässriger Lösung wiegen Sie Ausgangsverbindungen in Pulver- oder Flüssigkeitsform unter anaeroben Bedingungen oder inerter Atmosphäre. Bereiten Sie redoxempfindliche Referenzen in einer inerten Atmosphäre (d. h. in einem anaeroben Handschuhfach oder in einer Schlenk-Linie, siehe Abbildung 5 und Abbildung 6) vor, um eine oxido-reduktive Reaktion zu vermeiden und die chemische Integrität der Verbindung zu erhalten, die in der Umgebungsluft hochreaktiv und instabil sein kann). Hier wurden alle Selenreferenzen mit einer Schlenk-Linie hergestellt und Reinstwasser entgast (Abbildung 6). Flüssiges FeIII-Malat und Ferritin wurden an der Umgebungsluft hergestellt.
  2. Mit geeigneter Lösung mischen, um eine 1%ige Gew.-Endkonzentration des untersuchten Elements (d. h. Selen oder Eisen) für die Sammlung im Fluoreszenzmodus zu erreichen.
    HINWEIS: Reinstwasser ist die am häufigsten verwendete Lösung zur Vorbereitung von XAS-Referenzen. Die Zugabe von Glycerin (15%–20%) ist für Flüssigkeiten erforderlich, die mit der Standard-XAS-Fluoreszenz gemessen werden, um Artefakte zu verhindern, die durch Röntgenbeugung durch Eiskristalle entstehen, und die Qualität des mit dem Festkörperdetektor gesammelten XAS-Signals zu erhalten. Für HERFD-XAS ist Glycerin jedoch nicht obligatorisch. Mit einem Kristallanalysator-Spektrometer anstelle eines Festkörperdetektors wird die Energie mit einer extrem hohen Auflösung ausgewählt und die durch Eiskristalle induzierte Beugung hat keinen Einfluss auf die Datenerhebung des untersuchten Elements1.
  3. Die vorbereitete Lösung wird in einem verschlossenen Schlenk-Ballon (Abbildung 5) oder in einem 1,5-ml-Polypropylenröhrchen bis zur Messung unter den gleichen Bedingungen wie die Proben aufbewahrt und gelagert.
  4. Für feste Referenzen, wiegen Sie Selen oder Eisen-Modell-Compound-Pulver an der Umgebungsluft oder in einem Handschuhfach, wenn die Spezies redoxempfindlich sind. Hier wurden feste Fe II-Referenzen (FeII-Acetat und Vivianit) in einem gasförmigenN2-Handschuhfach hergestellt, während FeIII (Fe (OH) 3 und FeIII-Phosphat) an der Umgebungsluft hergestellt wurden.
  5. Sie wiegen hochreines Bornitridpulver und mischen Sie es mit den Modellverbindungspulvern, um eine Endkonzentration des untersuchten Elements von 1 % zu erreichen (Abbildung 7A).
  6. Mit einem Mörser mindestens 15 min zu einem feinen Pulver mahlen.
  7. Legen Sie die Pulvermischung in die Former, um Pellets mit der hydraulischen Presse herzustellen (Abbildung 7B, ähnlich wie in Abbildung 3A für das Probenpellet).
  8. Schließen Sie die Formmaschine mit dem Kolben (Abbildung 7C, ähnlich wie in Abbildung 3B für das Probenpellet).
  9. Drücken Sie die Taste, um das Bulk-Pellet zu erhalten (Abbildung 7D, ähnlich wie in Abbildung 3C für das Probenpellet).
  10. Lagern Sie die vorbereiteten Großpellets im Handschuhfach, bis sie unter den gleichen Bedingungen wie die Proben analysiert werden.
    HINWEIS: Das Bulk-Pellet haftet manchmal an den Kolben, abhängig von der Pulverkomposition, zum Beispiel. Es sanft zu entfernen, ohne es zu brechen, kann schwierig sein. In diesem Fall muss das folgende Verfahren mit Polyimidplatten (z. B. Kapton) verwendet werden.
  11. Geben Sie einen Tropfen Ethanol auf jede Seite der Kolben, die mit dem Pulver in Berührung kommen (Abbildung 8A).
  12. Bereiten Sie zwei Polyimidscheiben mit einem Durchmesser vor, der etwas kleiner ist als die Kolben. Die Polyimiddicke muss 10–25 μm betragen (dünner ist schwer zu manipulieren, dicker absorbiert zu viel von den Röntgenphotonen während der Analyse).
  13. Setzen Sie die Scheiben auf die Kolben. Sie bleiben durch Kapillarwirkung haften (Abbildung 8B).
  14. Montieren Sie die Formmaschine mit dem Kolben, fügen Sie das Pulver hinzu und setzen Sie den zweiten Kolben ein (Abbildung 8C).
  15. Drücken Sie (siehe Schritt 3.11) und entfernen Sie das komprimierte Bulk-Pellet aus den Kolben.
    HINWEIS: Die festen Referenzen können wie die Proben auf dem kryostatspezifischen Probenhalter montiert werden (siehe Schritt 1.8.6). Die Flüssigkeitsreferenzen können auf dem kryostatspezifischen Probenhalter montiert werden. Siehe Abbildung 9A für einen CRG-FAME-Kryostaten-Probenhalter. Das gleiche Verfahren kann mit einem CRG-FAME-UHD-Probenhalter (Abbildung 4D) unter Verwendung des folgenden Verfahrens angewendet werden.
  16. Montage der flüssigen Referenz auf dem Kryostat-Probenhalter.
    1. Setzen Sie das Polyimidband (z. B. Kapton) (25 μm dick) ein, um eine Seite des Lochs am Probenhalter bei RT abzudichten (Abbildung 9B).
    2. Füllen Sie den Hohlraum mit einer Spritze langsam mit der Lösung, bis er die Oberseite erreicht. Vermeiden Sie Blasen. Das Reservoir muss gefüllt werden (Abbildung 9C, links).
    3. Versiegeln Sie die andere Seite des Hohlraums mit dem Klebeband (Abbildung 9C, rechts).
    4. Tauchen Sie den versiegelten Probenhalter in LN2 (Abbildung 9D, T0–T 3).
    5. Eine thermische Reaktion induziertLN2-Blubbern . Warten Sie, bis das Blubbern aufhört und das Ende der Reaktion signalisiert (Abbildung 9D, T3–T 5).
    6. Überführen Sie den Probenhalter bei 77 K in den Kryostaten der Beamline, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen (Abbildung 9D, T6) oder im LN2 Dewar speichern.
      HINWEIS: Die gefrorene Lösung wird gut im Hohlraum verteilt und bildet ein gleichmäßiges und homogenes Pellet (Abbildung 9D, T7).

4. HERFD-XAS: Messverfahren

  1. Optimieren Sie alle Kristalle aus dem CAS unter Bragg-Bedingungen in Bezug auf die interessierende Fluoreszenzlinienenergie. Dieses Verfahren kann mit einer konzentrierten Referenzverbindung durchgeführt werden.
  2. Kalibrieren Sie die einfallende monochromatische Strahlenergie mit einer Referenz, für die die Energieposition der Absorptionskante bekannt ist (typischerweise eine reine metallische Folie). Diese Referenz kann in einem zweiten Schritt nach der Probe im doppelten Transmissionsmodus positioniert werden, um die Kalibrierung für jedes erhaltene Spektren überprüfen und schließlich nach der Behandlung ausrichten zu können.
  3. Die Probe wird in einem flüssigen Helium-Kryostaten für biologische Proben nach dem in Schritt 1.9.6 beschriebenen geeigneten Verfahren positioniert.
  4. Schließen Sie den Versuchsstall nach den Synchrotron-Sicherheitsregeln.
  5. Führen Sie die XAS-Erfassung in einem Energiebereich durch, der die ausgewählte Absorptionskante abdeckt.
  6. Bewegen Sie die Probe nach jeder spektralen Aufnahme mindestens doppelt so groß wie der Strahl in Bewegungsrichtung, bevor Sie mit einer neuen Aufnahme beginnen.
    HINWEIS: In diesem Fall wurden Messungen mit Ge(440)-Kristallen durchgeführt, um die Fe K a 1-Linie auszuwählen, und mit Ge(844)-Kristallen, um die Se Ka1-Linie auszuwählen. Die Strahlgröße auf der Probe betrug 200 x 100 μm² (H x V Full Width Half Maximum). Die Probenbewegung zwischen jeder Erfassung betrug 500 μm in beide Richtungen, um die strukturelle Homogenität zu untersuchen und jedes Mal einen neuen Bereich zu analysieren, der frei von früheren möglichen Strahlenschäden ist. Einzelne Spektren werden verglichen und zusammengeführt, wenn sie innerhalb des Rauschens überlagert sind. Die Messung wird für eine bestimmte Probe gestoppt, wenn die Qualität des zusammengeführten Spektrums korrekt ist. Dann kann die Datenanalyse mit jeder Software durchgeführt werden, die der XAS-Analyse gewidmet ist, insbesondere mit solchen, die eine lineare Kombinationsanpassung normalisierter Spektren ermöglichen, z. B. Athena und Artemis (Demeter-Softwaregruppe) 15, SixPack 16 oder Viper17. Vollständige und detaillierte Erklärungen der XAS-Analyse fallen nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls und können in den jüngsten Arbeiten18,19 gefunden werden, von denen einige speziell biologischen Proben gewidmetsind 20. Selen-XANES-Referenzspektren sind bereits in der SSHADE-Spektrendatenbank21 gesammelt.

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Ergebnisse

Die Hauptziele dieser Präparate waren die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Selen-Nanopartikeln (Se-NPs) und Krebszellen sowie der Eisenbindung und -sequestrierung in Phytoplankton.

HERFD-XANES-Spektren des Selens im Anfangszustand (BSA Se-NPs) und in Zellen im Nährmedium (BSA Se-NPs nach 24 h Inkubation) sind in Abbildung 10 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Selen in den anfänglichen Se-NPs sowohl als Se(0)- als auch als selenitähnliche ...

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Diskussion

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die chemische Form von Selen und Eisen in biologischen Proben durch Röntgenabsorptionsspektroskopie zu untersuchen. Es konzentriert sich auf die Kryopräparation und Lagerung von biologischen Proben und Referenzverbindungen sowie auf die HERFD-XAS-Messungen.

Kryo-Aufbereitung und Lagerung
Die Kryo-Aufbereitung der biologischen Probenpellets ermöglicht die Erhaltung der chemischen Integrität der in den Proben vorhandenen Spezies. Dies ist ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken CEMHTI (Orleans, Frankreich, ANR-13-BS08-0012-01) und Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankreich, ANR-10-LABX-0056) für die Beamline-Entwicklung. Das FAME-UHD-Projekt wird vom französischen "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), dem CEA-CNRS CRG-Konsortium und dem INSU CNRS-Institut finanziell unterstützt. Wir sind dankbar für alle Beiträge während der Experimente, insbesondere für alle Personen, die an BM30B und BM16 arbeiten. Die Autoren würdigen die European Synchrotron Radiation Facility für die Bereitstellung der Synchrotronstrahlungsstrahlzeit. Wir erkennen auch das PHYTOMET ANR-Projekt für finanzielle Unterstützung (ANR-16-CE01-0008) und das SEDMAC-Projekt für finanzielle Unterstützung (INCA-Plan cancer-ASC16019CS) an.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AmmoniumnitratSigma-AldrichA3795NH4NO3, 2,66 mg/L MilliQ Wasser
Anaerobe KammerCoy Laboratory, USAausgestattet mit Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotika-BestandSigma-AldrichA0166 für Ampicillin, S9137 für Streptomycinsulfat1 mL/L MilliQ Wasser (Ampicillin-Natrium und Streptomycinsulfat, 100 mg/ml)
Bornitrid-PulverSigma-Aldrich255475
ZellzählkammerNeubauer oder Malassez
Zellschaber
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)GIBCO14190-094ohne Calcium, Magnesium, Phenol Rot
Eppendorf Röhrchen0,5 mL und 1,5 mL
Falcon Röhrchen15 mL und 50 mL
Eisencitrat Fe/Citrat = 1/20Sigma-AldrichF3388wässrige Lösung aus FeCl3 50 mM und Na-Citrat 1M pH 6,5
Fötales RinderserumGIBCOA31604-02Performance Plus, zertifiziertes One-Shot-Format, US-Herkunft
KolbenSigma-AldrichZ707503TPP 150 cm2 Fläche
WachstumskammerSanyoSanyo MLR-352bei 20 &°; C und unter einem 12:12 Licht (3.000 Lux) Dunkelregime
HEPES-PufferSigma-AldrichH40341 g/L MilliQ Wasser HEPES
Hochwertiges seröses, OVCAR-3ATCC, Rockville, MDHTB-161Lagertemperatur: Temperatur Flüssigstickstoffdampf
InkubatorInkubator bei 37°; C, befeuchtete Atmosphäre mit 5% CO2
Insulinlösung aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma-AldrichI051610 mg/mL Insulin in 25mM HEPES, pH 8,2, BioReagenz, steril filtriert, geeignet für Zellkultur
Manuelle hydraulische PresseSpecac, USA
Marine Kieselalge Phaeodactylum tricornutumRoscoff KultursammlungRCC69http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
MorpholinpropansulfonsäureSigma-AldrichM3183MOPS, 250 mg/L milliQ Wasser (pH 7,3)
Optisches Mikroskop
PC-3ECCAC, Salisbury, UK90112714Lagertemperatur: Flüssigstickstoffdampf Temperatur
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333Lösungsstabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen
Pipette-boy25 mL-, 10 mL- und 5 mL sterile Kunststoffpipetten
Planktonkulturprodukte, Mf Medium: MeersalzeSigma-AldrichS988340 g/l milliQ Wasser. Zusammensetzung: Cl- 19,29 g, Na+ 10,78 g, SO42- 2,66 g, Mg2+ 1,32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8,8 mg, BO2- 5,6 mg, Br- 56 mg, I- 0,24 mg, Li+ 0,3 mg, F- 1 mg
KunststoffpinzetteOxford InstrumentAGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modifikation)GIBCOA10491-01Lösung mit 4,5 g/l D-Glucose, 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 110 mg/l (1 mM) Natriumpyruvat, 2,388 g/l (10 mM) HEPES-Puffer und 300 mg/l L-Glutamin für Forschungszwecke
Selen-Nanopartikel (Se-NPs), BSA-beschichtet, 2 mg/mLNANOCS Company, USASe50-BS-1BSA stabilisierte Se-NPs-Lösung. Durchschnittliche Größe ca. 30 nm. Gelagert bei 4°; C im Dunkeln, geschützt vor Licht.
Selen-Nanopartikel (Se-NPs), Chitosan-beschichtet, 2 mg/mLNANOCS Company, USA11. Se50-CS-1Chitosan-stabilisierte Se-NPs-Lösung. Durchschnittliche Größe ca. 30 nm. Gelagert bei 4°; C im Dunkeln, geschützt vor Licht.
Natriummetasilikat-PentahydratSigma-Aldrich71746Na2SiO3.5H2O, 22,8 mg/L MilliQ Wasser
NatriumnitratSigma-AldrichS5022NaNO3, 75 mg/L MilliQ Wasser
Natriumphosphat monobasischSigma-AldrichS5011NaH2PO4, 15 mg/L MilliQ Wasser
T-75 Kolben
Gewebekulturhaube
Spurenmetall-StammSigma-AldrichM5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 2298571 mL/L milliQ Wasser (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypanblau-Lösung (0,4%)GIBCO15250061
Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotGIBCO25300-054
VitaminstockSigma-AldrichT1270 für Thiamin, B4639 für Biotin, V6629 für B121 mL/L milliQ Wasser (Thiamin HCl 20 mg/L, Biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Wasserbad 37°; C

Referenzen

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