Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung biologischer Kryoproben für Synchrotron-basierte Röntgenabsorptionsspektroskopie-Experimente vor. Wir beschreiben alle Schritte, die zur Optimierung der Probenvorbereitung und Kryokonservierung erforderlich sind, anhand von Beispielen für das Protokoll mit Krebs- und Phytoplanktonzellen. Diese Methode bietet einen universellen Standard für die Kryopräparation von Proben.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Elementen mit Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) ist von besonderem Interesse, wenn es darum geht, die Rolle von Metallen in biologischen Systemen zu untersuchen. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiges und oft komplexes Verfahren, insbesondere für biologische Proben. Obwohl Röntgenspeziationstechniken weit verbreitet sind, wurde noch kein detailliertes Protokoll für Benutzer der Technik verbreitet. Darüber hinaus ist die Modifikation des chemischen Zustands besorgniserregend, und kryobasierte Techniken werden empfohlen, um die biologischen Proben in ihrem fast nativen hydratisierten Zustand zu analysieren, um die maximale Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen oder Gewebe zu gewährleisten. Hier schlagen wir ein zelluläres Präparationsprotokoll vor, das auf kryokonservierten Proben basiert. Es wird in einer hochauflösenden fluoreszenzdetektierten Röntgenabsorptionsspektroskopie von Selen in Krebszellen und einer Studie von Eisen in Phytoplankton demonstriert. Dieses Protokoll kann mit anderen biologischen Proben und anderen Röntgentechniken verwendet werden, die durch Bestrahlung beschädigt werden können.

Einleitung

Die Untersuchung der zellulären Biotransformationen essentieller oder toxischer Elemente erfordert Speziationstechniken mit hoher Empfindlichkeit und sollte die Probenvorbereitungsschritte minimieren, die häufig zur Modifikation chemischer Spezies neigen.

Es ist bekannt, dass physiologische Elemente wie Selen und Eisen aufgrund ihrer komplexen Chemie, der verschiedenen Eigenschaften der Selen- oder Eisenspezies und ihrer geringen Konzentration im ppm- (mg/kg) oder sogar sub-ppm-Bereich besonders schwer zu speziieren sind. Daher kann das Studium der Speziation dieser Elemente durch XAS äußerst schwierig sein. Synchrotron XAS und insbesondere....

Protokoll

1. Herstellung der humanen PC-3- und OVCAR-3-Krebszellpellets für die Selenspeziation

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Weekley et ^al.10 übernommen. Alle Schritte müssen unter einer Zellkulturhaube unter Bedingungen und Einschränkungen der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden.

1. Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zellzählkammer. Samen Sie 150.000-200.000 Zellen pro Flasche für die PC-3-Zelllinie und 300.000 Zellen für die OVCAR-3-Zelllinie.
2. Samenzellen in T-75-Kolben (drei Kolben pro Zustand, um Verdreifachungen zu haben) in den geeigneten Ze....

Ergebnisse

Die Hauptziele dieser Präparate waren die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Selen-Nanopartikeln (Se-NPs) und Krebszellen sowie der Eisenbindung und -sequestrierung in Phytoplankton.

HERFD-XANES-Spektren des Selens im Anfangszustand (BSA Se-NPs) und in Zellen im Nährmedium (BSA Se-NPs nach 24 h Inkubation) sind in Abbildung 10 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Selen in den anfänglichen Se-NPs sowohl als Se(0^)- als auch als selenitähnliche .......

Diskussion

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die chemische Form von Selen und Eisen in biologischen Proben durch Röntgenabsorptionsspektroskopie zu untersuchen. Es konzentriert sich auf die Kryopräparation und Lagerung von biologischen Proben und Referenzverbindungen sowie auf die HERFD-XAS-Messungen.

Kryo-Aufbereitung und Lagerung
Die Kryo-Aufbereitung der biologischen Probenpellets ermöglicht die Erhaltung der chemischen Integrität der in den Proben vorhandenen Spezies. Dies ist .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumnitrat	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2,66 mg/L MilliQ Wasser
Anaerobe Kammer	Coy Laboratory, USA		ausgestattet mit Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotika-Bestand	Sigma-Aldrich	A0166 für Ampicillin, S9137 für Streptomycinsulfat	1 mL/L MilliQ Wasser (Ampicillin-Natrium und Streptomycinsulfat, 100 mg/ml)
Bornitrid-Pulver	Sigma-Aldrich	255475
Zellzählkammer			Neubauer oder Malassez
Zellschaber
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	GIBCO	14190-094	ohne Calcium, Magnesium, Phenol Rot
Eppendorf Röhrchen			0,5 mL und 1,5 mL
Falcon Röhrchen			15 mL und 50 mL
Eisencitrat Fe/Citrat = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	wässrige Lösung aus FeCl3 50 mM und Na-Citrat 1M pH 6,5
Fötales Rinderserum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, zertifiziertes One-Shot-Format, US-Herkunft
Kolben	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 Fläche
Wachstumskammer	Sanyo	Sanyo MLR-352	bei 20 &°; C und unter einem 12:12 Licht (3.000 Lux) Dunkelregime
HEPES-Puffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L MilliQ Wasser HEPES
Hochwertiges seröses, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Lagertemperatur: Temperatur Flüssigstickstoffdampf
Inkubator			Inkubator bei 37°; C, befeuchtete Atmosphäre mit 5% CO2
Insulinlösung aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL Insulin in 25mM HEPES, pH 8,2, BioReagenz, steril filtriert, geeignet für Zellkultur
Manuelle hydraulische Presse	Specac, USA
Marine Kieselalge Phaeodactylum tricornutum	Roscoff Kultursammlung	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinpropansulfonsäure	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L milliQ Wasser (pH 7,3)
Optisches Mikroskop
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Lagertemperatur: Flüssigstickstoffdampf Temperatur
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Lösungsstabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen
Pipette-boy			25 mL-, 10 mL- und 5 mL sterile Kunststoffpipetten
Planktonkulturprodukte, Mf Medium: Meersalze	Sigma-Aldrich	S9883	40 g/l milliQ Wasser. Zusammensetzung: Cl- 19,29 g, Na+ 10,78 g, SO42- 2,66 g, Mg2+ 1,32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8,8 mg, BO2- 5,6 mg, Br- 56 mg, I- 0,24 mg, Li+ 0,3 mg, F- 1 mg
Kunststoffpinzette	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modifikation)	GIBCO	A10491-01	Lösung mit 4,5 g/l D-Glucose, 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 110 mg/l (1 mM) Natriumpyruvat, 2,388 g/l (10 mM) HEPES-Puffer und 300 mg/l L-Glutamin für Forschungszwecke
Selen-Nanopartikel (Se-NPs), BSA-beschichtet, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilisierte Se-NPs-Lösung. Durchschnittliche Größe ca. 30 nm. Gelagert bei 4°; C im Dunkeln, geschützt vor Licht.
Selen-Nanopartikel (Se-NPs), Chitosan-beschichtet, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan-stabilisierte Se-NPs-Lösung. Durchschnittliche Größe ca. 30 nm. Gelagert bei 4°; C im Dunkeln, geschützt vor Licht.
Natriummetasilikat-Pentahydrat	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22,8 mg/L MilliQ Wasser
Natriumnitrat	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L MilliQ Wasser
Natriumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L MilliQ Wasser
T-75 Kolben
Gewebekulturhaube
Spurenmetall-Stamm	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L milliQ Wasser (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypanblau-Lösung (0,4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	GIBCO	25300-054
Vitaminstock	Sigma-Aldrich	T1270 für Thiamin, B4639 für Biotin, V6629 für B12	1 mL/L milliQ Wasser (Thiamin HCl 20 mg/L, Biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Wasserbad 37°; C