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Methodenartikel

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

10.9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/61143

⸱

13. Juni 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 3The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, 4PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein dynamisches Kultursystem zur Herstellung kontrollierter Größenaggregate menschlicher pluripotenter Stammzellen und zur weiteren Stimulierung der Differenzierung in Kleinhirnorganoiden unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen mit einem Einweg-Bioreaktor.

Zusammenfassung

Das Kleinhirn spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts und der motorischen Koordination, und ein funktioneller Defekt in verschiedenen Kleinhirnneuronen kann eine Hirnfallfunktionsstörung auslösen. Der größte Teil des aktuellen Wissens über krankheitsbedingte neuronale Phänotypen basiert auf postmortalen Geweben, was das Verständnis von Krankheitsprogression und Entwicklung erschwert. Tiermodelle und verewigte Zelllinien wurden auch als Modelle für neurodegenerative Erkrankungen verwendet. Sie rekapitulieren jedoch nicht vollständig menschliche Krankheiten. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben ein großes Potenzial für die Krankheitsmodellierung und bieten eine wertvolle Quelle für regenerative Ansätze. In den letzten Jahren verbesserte die Erzeugung von zerebralen Organoiden aus patientenabgeleiteten iPSCs die Aussichten für die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen. Es fehlen jedoch Protokolle, die eine große Anzahl von Organoiden und eine hohe Ausbeute an ausgereiften Neuronen in 3D-Kultursystemen produzieren. Das vorgestellte Protokoll ist ein neuer Ansatz für die reproduzierbare und skalierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Organoiden unter chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung skalierbarer Einweg-Bioreaktoren, bei denen Organoide die Kleinhirnidentität erlangen. Die erzeugten Organoide zeichnen sich durch die Expression spezifischer Marker sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene aus. Die Analyse spezifischer Gruppen von Proteinen ermöglicht den Nachweis verschiedener Kleinhirnzellpopulationen, deren Lokalisierung für die Bewertung der organoiden Struktur wichtig ist. Organoide Kryosektionen und weitere Immunostainierung von Organoidscheiben werden verwendet, um das Vorhandensein spezifischer Kleinhirnzellpopulationen und ihre räumliche Organisation zu bewerten.

Einleitung

Die Entstehung menschlicher pluripotenter Stammzellen (PSCs) stellt ein ausgezeichnetes Werkzeug für die regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung dar, da diese Zellen in die meisten Zelllinien des menschlichenKörpers1,2unterschieden werden können. Seit ihrer Entdeckung wurde berichtet, dass die PSC-Differenzierung mit verschiedenen Ansätzen verschiedene Krankheiten modelliert, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen3,4,5,6.

Kürzlich gab es Berichte über 3D-Kulturen, die von PSCs abgeleitet wurden, die menschlichen zerebralen Strukturen ähneln; Diese werden Gehirnorganoide3,7,8genannt. Die Erzeugung dieser Strukturen aus gesunden und patientenspezifischen PSCs bietet eine wertvolle Gelegenheit, menschliche Entwicklung und neuroentwicklungsbezogene Störungen zu modellieren. Die Methoden zur Erzeugung dieser gut organisierten Zerebralparese sind jedoch für ihre Großproduktion nur schwer anzuwenden. Um Strukturen zu erzeugen, die groß genug sind, um die Gewebemorphogenese ohne Nekrose innerhalb der Organoide zu rekapitulieren, stützen sich Protokolle auf die anfängliche neuronale Verpflichtung unter statischen Bedingungen, gefolgt von der Verkapselung in Hydrogelen und der nachfolgenden Kultur in dynamischen Systemen3. Solche Ansätze können jedoch den potenziellen Scale-up der organoiden Produktion einschränken. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um die PSC-Differenzierung auf bestimmte Regionen des zentralen Nervensystems zu lenken, einschließlich kortikaler, striataler, Mittelhirn- und Rückenmarksneuronen9,10,11,12, ist die Erzeugung spezifischer Hirnregionen unter dynamischen Bedingungen immer noch eine Herausforderung. Insbesondere die Erzeugung von reifen Kleinhirnneuronen in 3D-Strukturen muss noch beschrieben werden. Muguruma et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Kulturbedingungen, die die frühe Kleinhirnentwicklung13 rekapitulieren, und berichteten kürzlich über ein Protokoll, das es menschlichen embryonalen Stammzellen ermöglicht, eine polarisierte Struktur zu erzeugen, die an das erste Trimester-Kleinhirn7erinnert. Die Reifung von Kleinhirnneuronen in den gemeldeten Studien erfordert jedoch die Dissoziation der Organoide, die Sortierung von Kleinhirnvorläufern und die Kokultur mit Feederzellen in einem monolayern Kultursystem7,14,15,16. Daher ist die reproduzierbare Erzeugung der gewünschten Kleinhirn-Organoide zur Krankheitsmodellierung unter definierten Bedingungen immer noch eine Herausforderung, die mit der Variabilität der Kultur- und Feederquelle verbunden ist.

Dieses Protokoll stellt optimale Kulturbedingungen für die 3D-Erweiterung und die effiziente Differenzierung menschlicher PSCs in Kleinhirnneuronen mithilfe von einwegvertikalen Radbioreaktoren dar (siehe Materialtabelle für Spezifikationen), im Folgenden Bioreaktoren genannt. Bioreaktoren sind mit einem großen vertikalen Laufrad ausgestattet, das in Kombination mit einem U-förmigen Boden eine homogenere Scherverteilung im Inneren des Gefäßes ermöglicht und eine schonende, gleichmäßige Mischung und Partikelaufhängung mit reduzierten Rührgeschwindigkeiten17ermöglicht. Mit diesem System können Form- und größengesteuerte Zellaggregate gewonnen werden, was für eine homogenere und effizientere Differenzierung wichtig ist. Darüber hinaus kann eine größere Anzahl von iPSC-abgeleiteten Organoiden auf weniger mühsame Weise erzeugt werden.

Das Hauptmerkmal der Organoide, die 3D-Multizellstrukturen sind, die normalerweise aus Stammzellen gebildet werden, ist die Selbstorganisation verschiedener Zelltypen, die spezifische Formen bilden, wie sie bei der menschlichen Morphogenese18,19,20zu sehen sind. Daher ist die organoide Morphologie ein wichtiges Kriterium, das während des Differenzierungsprozesses bewertet werden muss. Die Kryosektion von Organoiden und die weitere Immunfärbung von Organoidscheiben mit einem bestimmten Satz von Antikörpern ermöglichen die räumliche Visualisierung molekularer Marker zur Analyse der Zellproliferation, Differenzierung, Zellpopulationsidentität und Apoptose. Mit diesem Protokoll wird durch immunstainierende organoide Kryosektionen eine anfängliche effiziente neuronale Bindung am7. Tag der Differenzierung beobachtet. Während der Differenzierung werden mehrere Zellpopulationen mit Kleinhirnidentität beobachtet. Nach 35 Tagen in diesem dynamischen System organisiert sich das Kleinhirn-Neuroepithel entlang einer apicobasalen Achse, mit einer apikalen Schicht aus sich ausbreitenden Vorläufern und basal gelegenen postmitotischen Neuronen. Während des Reifungsprozesses sind ab den Tagen 35 bis 90 der Differenzierung verschiedene Arten von Kleinhirnneuronen zu sehen, einschließlich Purkinje-Zellen (Calbindin+), Granulatzellen (PAX6+/MAP2+), Golgi-Zellen (Neurogranin+), unipolare Pinselzellen (TBR2+) und tiefe Kleinhirn-Nuklei-Projektionsneuronen (TBR1+). Auch wird eine nicht signifikante Menge des Zelltodes in den erzeugten Kleinhirn-Organoiden nach 90 Tagen in der Kultur beobachtet.

In diesem System reifen menschliche iPSC-abgeleitete Organoide zu verschiedenen Kleinhirnneuronen und überleben bis zu 3 Monate ohne die Notwendigkeit einer Dissoziation und Feeder-Cokultur, die eine Quelle menschlicher Kleinhirnneuronen für die Krankheitsmodellierung bietet.

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Protokoll

1. Passage und Aufrechterhaltung menschlicher iPSCs in der Monolayer-Kultur

  1. Herstellung von Platten
    1. Die Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)bei 4 °C auftauen und 60 L-Aliquots vorbereiten. Einfrieren der Aliquots bei -20 °C.
    2. Um die Brunnen einer 6-Well-Platte zu beschichten, tauen Sie ein Aliquot der Kellermembranmatrix auf Eis auf. Nach dem Auftauen 60 l zu 6 ml DMEM-F12 hinzufügen. Durch Pipettieren nach oben und unten.
    3. Fügen Sie 1 ml verdünnte Kellermembranmatrixlösung zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte hinzu und brüten bei RT mindestens 1 h vor dem Passieren oder lagern Sie bei 4 °C bis zu 1 Woche.
  2. Passage von iPSC-Kolonien mit EDTA
    1. IPSCs in Monolayer-Kultur in 6 Brunnenplatten im Inkubator bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 erhalten.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden drei verschiedene menschliche iPSC-Leitungen verwendet: F002.1A.1321, humane episomale iPSC-Linie (iPSC6.2)22und kommerziell erhaltene iPS-DF6-9-9T.B (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Vor der Passierung die gelagerten Platten (Schritt 1.1) bei Raumtemperatur (RT) 15 min inkubieren und das mTesR1 Medium vorbereiten (Tabelle 1).
    3. Die Lösung mit einer serologischen Pipette von der Platte absaugen und sofort 0,5 ml mTeSR1-Medium zu jedem Brunnen hinzufügen.
    4. Das verbrauchte Medium aus dem Brunnen, der iPSCs enthält, ansaugen und einmal mit 1 ml 0,5 ml EDTA pro Brunnen waschen.
    5. Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei RT für 5 min.
    6. Aspirieren Sie EDTA und entfernen Sie die Zellen aus den Brunnen, indem Sie sanft mTeSR1 Medium hinzufügen und die Kolonien mit einer P1000-Mikropipette pipetieren. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Rohr.
      HINWEIS: Pipette-Zellen nicht mehr als 3x nach oben und unten.
    7. Fügen Sie 1 ml Zellsuspension (verdünnt 1:4) zu jedem Brunnen hinzu, so dass jeder Brunnen 1,5 ml Medium enthält, nachdem die Zellsuspension hinzugefügt wurde. Geben Sie die Zellen bei 5%CO2, 37 °C in den Inkubator zurück.
    8. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium täglich und die Passage alle 3 Tage, wenn 75%–80% Zusammenfluss erreicht wird.

2. Aussaat menschlicher iPSCs im Bioreaktor

  1. Inkubieren Sie iPSCs, die als Monolayer in mTeSR1 angebaut werden, ergänzt durch 10 M ROCK-Hemmer Y-27632 (ROCKi). 1 ml zusätzliches Medium zu jedem Brunnen von einer 6 Brunnengewebekulturplatte hinzufügen und für 1 h bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 brüten.
    HINWEIS: ROCKi wird verwendet, um dissoziierte iPSCs vor Apoptose23zu schützen.
  2. Nach 1 h Inkubation das verbrauchte Medium aus jedem Brunnen ansaugen und 1x mit 1 ml 1× PBS pro Brunnen waschen.
  3. 1 ml des Zellablösungsmediums (siehe Materialtabelle)zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C 7 min brüten, bis sich die Zellen mit sanftem Schütteln leicht von den Brunnen lösen.
  4. Pipette die Zellablösung Medium nach oben und unten mit einer P1000 Mikropipette, bis die Zellen lösen und in einzelne Zellen zu dissoziieren. Fügen Sie jeweils 2 ml komplettes Zellkulturmedium zu jedem Brunnen hinzu, um die enzymatische Verdauung zu inaktivieren und die Zellen sanft in ein steriles konisches Rohr zu pipetten.
  5. Zentrifuge bei 210 × g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
  6. Setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium (d.h. mTeSR1 ergänzt durch 10 M ROCKi) wieder auf und zählen Sie die iPSCs mit einem Hämozytometer mit Trypan-Blaufarbstoff.
  7. Samen 15 × 106 Einzelzellen im Bioreaktor (maximales Volumen von 100 ml) mit 60 ml mTeSR1, ergänzt mit 10 m ROCKi bei einer endg.-Zelldichte von 250.000 Zellen/ml.
  8. Setzen Sie das Gefäß mit den iPSCs in die universelle Basiseinheit ein, die im Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 platziertist.
    ANMERKUNG: Das Bioreaktorrühren wird für 24 h aufrechterhalten, indem die universelle Basiseinheitssteuerung auf 27 Rpm gesetzt wird, um die iPSC-Aggregation zu fördern.

3. Differenzierung und Reifung menschlicher iPSC-abgeleiteter Aggregate in Kleinhirnorganoiden

  1. Definieren Sie den Tag der Einzelzellsaatierung als Tag 0.
  2. Sammeln Sie am ersten Tag 1 ml der iPSC-Aggregateprobe mit einer serologischen Pipette. Halten Sie den Bioreaktor wie bisher unter Rührung, indem Sie die universelle Basiseinheit mit dem Bioreaktor, der die Aggregate enthält, vor dem Sammeln der Probe in einem sterilen Fluss platzieren. Die Zellaufhängung in einer ultraniedrigen Aufsatz 24 WellPlatte. Überprüfen Sie, ob iPSC-abgeleitete Aggregate gebildet werden.
  3. Erfassen Sie Bilder mit einem optischen Mikroskop mit einer Gesamtvergrößerung von 40x oder 100x, um den Aggregatdurchmesser zu messen.
  4. Messen Sie den Bereich der Aggregate in jedem Bild mit FIJI-Software.
    1. Wählen Sie "Analysieren | Stellen Sie Die Messungen" aus der Menüleiste fest und klicken Sie auf "Bereich" und "OK".
    2. Wählen Sie "Datei | Öffnen Sie" aus der Menüleiste, um eine gespeicherte Bilddatei zu öffnen. Wählen Sie das in der Werkzeugleiste angezeigte Linienauswahlwerkzeug aus, und erstellen Sie eine gerade Linie über der im Bild dargestellten Maßstabsleiste. Wählen Sie "Analysieren | Set scale" aus der Menüleiste.
    3. Fügen Sie in "Known distance"die Weite des Maßstabsbalkens des Bildes in 'm' hinzu. Definieren Sie die "Längeneinheit" als 'm. Klicken Sie auf "Global", um die Einstellungen beizubehalten und "OK". Wählen Sie Ovale Auswahl in der Werkzeugleiste aus.
    4. Für jedes Aggregat wird der Bereich mit dem ovalen Werkzeug abgrenzt. Wählen Sie "Analysieren | Maß". Berechnen Sie ihren Durchmesser basierend auf der gemessenen Fläche, wenn man bedenkt, dass Aggregate mit
      figure-protocol-1
      mit A als Bereich des Aggregats.
  5. Wenn der durchschnittliche Durchmesser der Aggregate 100 m beträgt, ersetzen Sie 80 % des verbrauchten Mediums durch frischem mTeSR1 ohne ROCKi. Wenn die Aggregate einen Durchmesser von 200–250 m erreichen, ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium durch gfCDM (Tabelle 1), sodass sich die Organoide am boden des Bioreaktors absetzen können.
    HINWEIS: Wenn der durchschnittliche Aggregatdurchmesser 350 m überschreitet, starten Sie das Differenzierungsprotokoll nicht. Wiederholen Sie die Aussaat einzelner Zellen. Im Allgemeinen dauert es etwa 1 Tag, bis das Aggregat einen durchschnittlichen Durchmesser von 100 m erreicht.
  6. Legen Sie den Bioreaktor, der die Aggregate enthält, in die universelle Basiseinheit ein, die im Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 %CO2platziert wird.
  7. Verringern Sie die Bioreaktor-Agitation auf 25 Rpm.
  8. Wiederholen Sie am 2. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4, um den Aggregatdurchmesser zu bewerten. Fügen Sie 30 l FGF2 (Endkonzentration, 50 ng/ml) und 60 l SB431542 (Endkonzentration, 10 m) bis 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium hinzu (Tabelle 1). Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch das ergänzte gfCDM. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
    HINWEIS: SB431542 ist entscheidend, um die mesendodermale Differenzierung zu hemmen und neuronale Differenzierung24zu induzieren. FGF2 wird verwendet, um die Kaudalisierung des neuroepithelialeGewebes zufördern 25 .
  9. Wiederholen Sie am 5. Tag die Schritte 3.2, 3.3, 3.4 und 3.8.
    HINWEIS: Die Aggregatgröße sollte während des Differenzierungsprotokolls erhöht werden. Der Durchmesser ist jedoch nur kritisch, wenn die Differenzierung beginnt, da dieser Parameter die Wirksamkeit der Differenzierung beeinflussen könnte.
  10. Wiederholen Sie am 7. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. FGF2 und SB431542 auf 2/3 verdünnen: Fügen Sie 20 L FGF2 und 40 l SB431542 bis 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium hinzu. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch ergänztes gfCDM. Wiederholen Sie Schritt 3.6 und erhöhen Sie die Bioreaktor-Agitation auf 30 Rpm.
  11. Wiederholen Sie am 14. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Fügen Sie 60 l FGF19 (Endkonzentration, 100 ng/ml) auf 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium hinzu. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch gfCDM, ergänzt durch FGF19. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
    HINWEIS: FGF19 wird verwendet, um die Polarisation von Mittel-Hinterhirnstrukturen zu fördern26.
  12. Wiederholen Sie am 18. Tag die Schritte 3.2, 3.3, 3.4 und 3.11.
  13. Wiederholen Sie am 21. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch ein komplettes neurobasales Medium (Tabelle 1). Wiederholen Sie Schritt 3.6.
    HINWEIS: Neurobasales Medium ist ein Basalmedium, das verwendet wird, um die neuronale Zellpopulation innerhalb des Organoids7aufrechtzuerhalten.
  14. Wiederholen Sie am 28. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Fügen Sie 180 l SDF1 (Endkonzentration, 300 ng/ml) zu 60 ml vollständiges neurobasales Medium hinzu. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch ein komplettes neurobasales Medium, das durch SDF1 ergänzt wird. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
    HINWEIS: SDF1 wird verwendet, um die Organisation von verschiedenen Zellschichten zu erleichtern27.
  15. Wiederholen Sie am 35. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch kompletteBrainPhys Medium (Tabelle 1). Wiederholen Sie Schritt 3.6.
    HINWEIS: BrainPhys ist ein neuronales Medium, das synaptisch aktive Neuronenunterstützt 28.
  16. Ersetzen Sie 1/3 des Gesamtvolumens alle 3 Tage durch komplette BrainPhys Medium bis Tag 90 der Differenzierung.

4. Herstellung von Organoiden für Kryosektionundierung und Immunhistochemie

  1. Sammlung von Organoiden zur Immunfärbung
    1. Sammeln Sie 1 ml Probe von Medium, das Organoide enthält, mit einer serologischen Pipette aus dem Bioreaktor zu einem 15 ml konischen Rohr.
      HINWEIS: Organoide sollten zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt werden, um die Wirksamkeit der Differenzierung zu bewerten, einschließlich der Tage 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 und 90.
    2. Den Überstand entfernen und einmal mit 1 ml 1× PBS waschen.
      HINWEIS: Zentrieren Sie die Organoide nicht. Lassen Sie die Organoide am Boden des Rohres durch Schwerkraft absetzen.
    3. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Bei 4 °C 30 min inkubieren. Entfernen Sie die verbrauchte PFA, und fügen Sie 1 ml von 1× PBS hinzu.
    4. Die Organoide in 1 ml 1× PBS bei 4 °C bis zur Verarbeitung zum Kryosektionen aufbewahren.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Organoide in 1x PBS nicht mehr als 1 Woche nach der Fixierung auf.
  2. Zubereitung von Organoiden zur Kryosektion
    1. Entfernen Sie den Überstand aus den gespeicherten Organoiden. 1 ml 15% Saccharose hinzufügen (w/v, in 1× PBS verdünnt), durch sanftes Wirbeln gut mischen und über Nacht bei 4 °C brüten.
    2. Bereiten Sie eine Lösung von 15% Saccharose/7,5% Gelatine(Tabelle 2) vor und halten Sie sie während der Zubereitung bei 37 °C, um eine Verfestigung der Gelatine zu vermeiden.
    3. Entfernen Sie die 15% Saccharoselösung, fügen Sie 1 ml 15% Saccharose/7,5% Gelatine zu den Organoiden hinzu und mischen Sie schnell durch sanftes Wirbeln. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
    4. Fügen Sie 15% Saccharose/7,5% Gelatinelösung in einen Kunststoffbehälter bis zur Hälfte seines Volumens. Warten Sie auf die Erstarrung bei RT.
    5. Nach einer 1 h Inkubation vorsichtig einen Saccharose-/Gelatinetropfen mit den Organoiden auf die erstarrte Gelatine mit einer Pasteurpipette legen. Bei RT ca. 15 min erstarren lassen. Achten Sie darauf, Blasenbildung zu vermeiden.
    6. 15% Saccharose/7,5% Gelatine auf die Organoide legen, bis der Behälter gefüllt ist. Warten Sie auf die vollständige Erstarrung bei RT.
    7. Nach erstarren 20 min bei 4 °C inkubieren.
    8. Die Gelatine in einen Würfel schneiden, der die Organoide in der Mitte enthält, und den Gelatinewürfel auf einem Stück Pappe mit einem Tropfen O.C.T.-Verbindung fixieren.
    9. 250 ml Isopentan in einen 500 ml Becher geben und einen entsprechenden Behälter mit flüssigem Stickstoff füllen. Mit Zangen und dicken Handschuhen die Tasse mit Isopentan sorgfältig auf die Oberfläche von flüssigem Stickstoff legen und das Isopentan auf -80 °C abkühlen.
    10. Wenn -80 °C erreicht ist, legen Sie den Gelatinewürfel in den Becher mit Isopentan, bis er gefriert, wobei die Temperatur bei -80 °C bleibt. Je nach Größe des Würfels kann es 1–2 min dauern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Temperaturen unter -80 °C oder übermäßige Gefrierzeit, da dies zu Rissen des Würfels führen kann.
    11. Beim Einfrieren den Gelatinewürfel schnell bei -80 °C lagern und bis zum Kryosektionen aufbewahren.
  3. Kryosektionierung von Organoiden
    1. Schalten Sie den Kryostat ein und definieren Sie sowohl Probentemperaturen (OT) als auch Kryokammertemperaturen (CT) bei -25 °C.
    2. Wenn sich beide Temperaturen stabilisieren, fixieren Sie den Gelatinewürfel, der die Organoide auf der Probe enthält, mit O.C.T.-Verbindung.
    3. Definieren Sie die Schnittdicke bei 12 m.
    4. Schneiden Sie den Würfel und sammeln Sie 3–4 Scheiben auf Haftmikroskop-Dias (siehe Tabelle der Materialien).
    5. Bei -20 °C bis zur Verwendung lagern.
  4. Immunostainierung von Organoidscheiben
    1. Legen Sie die Mikroskopschlitten mit organoiden Abschnitten in ein Copling-Glas mit 50 ml vorgewärmten 1x PBS, die bis zu 10 Dias von hinten nach hinten halten.
      HINWEIS: Alle organoiden Abschnitte sollten mit Flüssigkeit untergetaucht werden.
    2. 45 min bei 37 °C inkubieren, um Dias zu degelatinisieren.
    3. 1x mit 50 ml 1× PBS für 5 min bei RT waschen: Die Dias in ein Copling-Glas mit frischem 1× PBS geben.
    4. Die Dias in ein Copling-Glas mit 50 ml frisch zubereitetem Glycin (Tabelle 2) geben und 10 min bei RT brüten.
    5. Die Dias in ein Copling-Glas mit 50 ml 0,1% Triton (Tabelle 2) übertragen und 10 min bei RT permeabilisieren.
    6. Waschen Sie mit 1× PBS für 5 min 2x.
    7. Bereiten Sie die Immunostaining Schale mit 3 mm Papier in 1× PBS getränkt. Trocknen Sie mit einem Gewebe um die Scheiben herum und legen Sie sie auf 3 mm Papier. Mit einer Pasteur-Pipette die gesamte Oberfläche der Dias mit einer Blockierlösung (Tabelle 2) mit 0,5 ml pro Schlitten abdecken. 30 min bei RT inkubieren.
    8. Entfernen Sie überschüssige Blockierlösung und trocknen Sie die Dias mit einem Gewebe um die Scheiben herum. Den primärantikörper (Tabelle 3) in einer Blockierlösung verdünnt über die Abschnitte legen und mit den Abdeckungen abdecken. Die Scheiben in eine zuvor vorbereitete Immunostaining-Schale geben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    9. Die Dias in ein Copling-Glas mit 50 ml TBST (Tabelle 2)geben, die Abdeckungen fallen lassen und mit TBST für 5 min 3x waschen.
    10. Legen Sie 50 l des sekundären Antikörpers in einer Blockierlösung über die Abschnitte und decken Sie mit den Abdeckungen ab. Die Scheiben in die zuvor vorbereitete Immunostaining-Schale geben. 30 min bei RT inkubieren, lichtgeschützt.
    11. Die Dias wieder in ein Copling-Glas geben und mit 50 ml TBST für 5 min 3x waschen.
    12. Trocknen Sie die Rutschen mit einem Gewebe um die Scheiben herum und legen Sie die Scheiben in eine zuvor vorbereitete Immunostaining-Schale. Fügen Sie 0,5 ml DAPI-Lösung über die gesamte Oberfläche der Dias mit einer Pasteur Pipette hinzu. 5 min bei RT inkubieren.
    13. Wiederholen Sie Schritt 4.4.9.
    14. Trocknen Sie die Dias vorsichtig mit einem Gewebe. Fügen Sie 50 l Montagemedium Tropfen für Tropfen entlang der Folie hinzu und senken Sie dann vorsichtig einen Deckelschlupf auf jeden Schlitten, wobei Sie ihn leicht biegen, um Blasen zu vermeiden.

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Ergebnisse

Das Protokoll wurde durch Förderung der Zellaggregation mit den 0,1 L-Bioreaktoren initiiert (Abbildung 1A). Die Einzelzellimpfung der iPSCs wurde durchgeführt, wobei 250.000 Zellen/ml in 60 ml Medium mit einer Rührgeschwindigkeit von 27 R/min gesät wurden. Dies wurde als Tag 0 definiert. Nach 24 h bildeten die Zellen effizient sphäroidförmige Aggregate (Tag 1, Abbildung 1B), und die Morphologie war bis Tag 5 gut erhalten, mit einer allmählichen Vergrößerung, wa...

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Diskussion

Der Bedarf an großen Zellzahlen sowie definierten Kulturbedingungen zur Generierung spezifischer Zelltypen für Arzneimittelscreenings und regenerative Medizinanwendungen hat die Entwicklung skalierbarer Kultursysteme vorangetrieben. In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen die skalierbare Generation von neuronalen Vorläufern und funktionellen Neuronen32,33,34berichtet, was signifikante Fortschritte bei der Entwicklung neuer M...

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Offenlegungen

Die Autoren YH und SJ sind Mitarbeiter von PBS Biotech. Der Autor BL ist CEO und Mitbegründer von PBS Biotech, Inc. Diese kooperierenden Autoren waren an der Entwicklung der im Manuskript verwendeten Bioreaktoren beteiligt. Dies ändert nichts an der Einhaltung aller Richtlinien der Zeitschrift für den Austausch von Daten und Materialien. Alle anderen Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 durch Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 an T.P.S und PD/BD/128376/2017 an D.E.S.N.), von FEDER kofinanzierte Projekte (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) und FCT durch Gewährung PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 und CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Außerdem wurden Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Grant Agreement-Nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017 bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3MM PapierWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigmaZellablösemedium
Anti-BARHL1 AntikörperHPA004809Atlas Antikörper
Anti-Calbindin D-28k AntikörperCB28Millipore
Anti-MAP2 AntikörperM4403Sigma
Anti-N-Cadherin Antikörper610921BD Transduktions-Anti-NESTIN-Antikörper
MAB1259-SPR& D
Anti-OLIG2 AntikörperMABN50Millipore
Anti-PAX6 AntikörperPRB-278PCovance
Anti-SOX2 AntikörperMAB2018R& D
Anti-TBR1 AntikörperAB2261Millipore
Anti-TBR2 Antikörperab183991Abcam
Anti-TUJ1 Antikörper801213Biolegend
Apo-TransferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mLStammzelltechnik Chemisch definiertes
Lipidkonzentrat11905031ThermoFisher
Deckgläser 24x60mm631-1575VWR
Kristallisationsgereinigtes BSA5470Sigma
DAPI10236276001Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Fötales RinderserumA3840001ThermoFisher
Gelatine aus RinderhautG9391Sigma
Glass Copling JarE94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlycinMB014001NZYtech
Schinken' s F1221765029ThermoFisher
Episomale iPSC-LinieA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulin91077CSigma
iPS DF6-9-9T. BWiCell
Iso-PentanPHR1661-2MLSigma
L-AscorbinsäureA-92902Sigma
Matrigel354230CorningBasalmembranmatrix
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904MilliporeEindeckmedium
mTeSR185850 -500mlStammzelltechnologien
N2 Ergänzung17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyd158127Sigma
PBS-0.1 EinweggefäßArtikelnummer: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base UnitArtikelnummer: ia-uni-b-501PBS Biotech
Rekombinant human BDNF450-02Peprotech
Rekombinant human bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Rekombinant human FGF19100-32Peprotech
Rekombinant human GDNF450-10Peprotech
Rekombinant human SDF1300-28APeprotech
ROCK Inhibitor Y-2763272302Stammzelltechnologien
SB431542S4317Sigma
SaccharoseS7903Sigma
SuperFrost Objektträger12372098ThermoFisherAdhäsionsmikroskop Objektträger
Tissue-Tek O.C.T. Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,015575020ThermoFisher

Referenzen

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