Undersøgelse virkninger af cigaretrøg på Pseudomonas infektion i lung epitelceller
Summary
Beskrevet her er en protokol til at undersøge, hvordan cigaretrøg ekstrakt påvirker bakteriel kolonisering i lunge epitelceller.
Abstract
Cigaretrygning er den vigtigste ætiv årsag til lungeemfysem og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). Cigaretrygning fremmer også modtagelighed for bakterielle infektioner i åndedrætssystemet. Men, virkningerne af cigaretrygning på bakterielle infektioner i menneskelige lunge epitelceller er endnu ikke blevet grundigt undersøgt. Beskrevet her er en detaljeret protokol for fremstilling af cigaretrygning ekstrakter (CSE), behandling af menneskelige lunge epitelceller med CSE, og bakteriel infektion og infektion bestemmelse. CSE blev udarbejdet med en konventionel metode. Lungeepitelceller blev behandlet med 4% CSE i 3 timer CSE-behandlede celler blev derefter smittet med Pseudomonas ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10. Bakteriebelastninger af cellerne blev bestemt ved tre forskellige metoder. Resultaterne viste, at CSE øget Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokol, derfor, giver en enkel og reproducerbar tilgang til at undersøge effekten af cigaretrøg på bakterielle infektioner i lunge epitelceller.
Introduction
Cigaretrygning påvirker folkesundheden for millioner af mennesker verden over. Mange skadelige sygdomme, herunder lungekræft og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er rapporteret at være relateret tilcigaretrygning 1,,2. Cigaretrygning øger modtageligheden af akutte mikrobielle infektioner i åndedrætssystemet3,4,5. Desuden, stigende beviser viser, at cigaretrygning øger patogenese af mange kroniske lidelser6,7,8. For eksempel, cigaretrygning kan øge virale eller bakterielle infektioner, der forårsager KOL forværring9. Blandt de bakterielle patogener, der etiologisk bidrager til akut forværring af KOL, en opportunistisk gram-negative bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, forårsager infektioner, der korrelerer med dårlige prognoser og højere dødelighed10,11. KOL-forværring forværrer sygdommen ved at accelerere patologisk progression. Der findes ingen effektive behandlinger mod COPD-forværring bortset fra den antisymptomatiske ledelse12. KOL-forværring fremmer patientdødelighed, sænker livskvaliteten og øger den økonomiske byrde for samfundet13.
Luftvejene er et åbent system, kontinuerligt udsat for forskellige mikrobielle patogener til stede eksternt. Opportunistiske bakteriepatogener påvises normalt i de øvre luftveje, men observeres nogle gange i de nedreluftveje 14,15. I dyremodeller kan P. aeruginosa påvises i alveolær sække, så snart 1 time efter infektion16. Som en stor forsvarsmekanisme, immunceller såsom makrofager eller neutrofiler fjerne bakterier i luftvejene. Lunge epitelceller, som den første fysiologiske barriere, udføre en unik rolle i værten forsvar mod mikrobielle infektioner. Lunge epitelceller kan regulere mikrobiel invasion, kolonisering, eller replikation uafhængig af immunceller17. Nogle molekyler findes i epitelceller, herunder PPARg, udøve antibakterielle funktioner, og dermed regulere bakteriel kolonisering og replikation i lunge epitelceller18. Cigaretrygning kan ændre molekylerne og forringe den normale forsvarsfunktion i lunge epitelceller19,20. Nylige undersøgelser rapporterede direkte eksponering af cigaretrøg til lunge epitelceller ved hjælp af robot rygningapparat 21,22. Eksponering for røg kan udføres på andre måder, dog, herunder anvendelse af CSE. Fremstilling af CSE er en reproducerbar tilgang med potentielle anvendelser i andre celletyper, herunder vaskulære endotelceller, der indirekte udsættes for cigaretrøg.
Denne rapport beskriver en protokol til at generere cigaretrøg ekstrakt til at ændre bakteriel belastning i lunge epitelceller. CSE øger bakteriel belastning af P. aeruginosa, og det kan bidrage til en gentagelse af bakterielle infektioner normalt ses i KOL-forværring. Der anvendes en konventionel metode til fremstilling af cse. Lunge epitelceller, på deres eksponentielle vækstfase, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolag-kultiverede lunge epitelceller være direkte udsat for cigaretrøg i en luft-væske interface. CSE-behandlede celler udfordres derefter med Pseudomonas ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10. Bakterierne formeres med en særlig rystehastighed for at sikre, at morfologien af deres flagella forbliver intakt for at bevare deres fulde invasive kapacitet. Gentamycin er ansat til at dræbe de bakterier tilbage i kulturmediet, hvilket reducerer den potentielle forurening under den efterfølgende bestemmelse af bakteriebelastningen. Protokollen bruger også GFP-mærket Pseudomonas, som er blevet udnyttet som et kraftfuldt værktøj til at studere Pseudomonas infektion i forskellige modeller. En repræsentativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden af infektion eller bakteriel belastning efter CSE behandling bestemmes på tre måder: drop plade metode med koloni optælling, kvantitativ PCR ved hjælp af Pseudomonas 16S rRNA-specifikke primere, eller flow cytometri i celler inficeret med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokol er en enkel og reproducerbar tilgang til at studere effekten af cigaretrøg på bakterielle infektioner i lunge epitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriel invasion i lunge epitelceller er et afgørende skridt i patogenesen af bakterielle infektioner. Processen med bakteriel invasion i cellerne kan opdeles i følgende tre trin: For det første, bakterierne kontakt og holde sig til overfladen af epitelcellen ved hjælp af deres flagella. For det andet, bakterierne enten gennemgå internalisering eller trænge ind i cellulære membran. Endelig bakterier replikere og kolonisere cellerne, hvis de med held undslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25</su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvis støttet af et nationalt institut for sundhed R01 tilskud HL125435 og HL142997 (til CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
Referenzen
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
