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Cancer Research

इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के माध्यम से मॉडलिंग ब्रेन मेटास्टेस

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61272
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,4, 1, 1,4, 1,2
1The Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Radiation Oncology, The Ohio State University, 3Department of Veterinary Biosciences, The Ohio State University, 4Davis Heart & Lung Research Institute, The Ohio State University

Summary

इंट्राक्रैनियल ब्रेन मेटास्टेसिस मॉडलिंग ट्यूमर के आकार और सटीक और समय पर तरीकों के साथ उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी करने में असमर्थता से जटिल है। चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग विश्लेषण के साथ प्रस्तुत पद्धति जोड़ों इंट्राक्रैनियल ट्यूमर इंजेक्शन, जो संयुक्त, सटीक और लगातार इंजेक्शन, बढ़ाया पशु निगरानी, और सटीक ट्यूमर की मात्रा माप खेती ।

Abstract

कैंसर का मेटास्टैटिक फैलाव रोग प्रगति, आक्रामक कैंसर उपप्रकार, और/या देर से निदान का एक दुर्भाग्यपूर्ण परिणाम है । मस्तिष्क मेटास्टेस विशेष रूप से विनाशकारी होते हैं, इलाज करना मुश्किल होता है, और एक गरीब पूर्वानुमान प्रदान करता है। जबकि संयुक्त राज्य अमेरिका में मस्तिष्क मेटास्टेस की सटीक घटना का अनुमान लगाना कठिन रहता है, यह बढ़ने की संभावना है क्योंकि एक्सट्रानियल उपचार कैंसर के इलाज में अधिक प्रभावोत्पादक बन जाते हैं। इस प्रकार, इस साइट पर मेटास्टेसिस के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों की पहचान करना और विकसित करना आवश्यक है। इस उद्देश्य के लिए, कैंसर कोशिकाओं का इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन एक अच्छी तरह से स्थापित विधि बन गया है जिसमें मस्तिष्क मेटास्टेसिस को मॉडल करना है। पहले, ट्यूमर के विकास को सीधे मापने में असमर्थता इस मॉडल के लिए एक तकनीकी बाधा रही है; हालांकि, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जैसे छोटे पशु इमेजिंग तौर-तरीकों की बढ़ती उपलब्धता और गुणवत्ता, समय के साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी करने और प्रायोगिक अवधि के दौरान मस्तिष्क के भीतर परिवर्तन का अनुमान लगाने की क्षमता में काफी सुधार कर रहे हैं । इसके बाद, एमआरआई के बाद इम्यूनोसक्रिटेंट चूहों में मुरीन स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन का प्रदर्शन किया जाता है। प्रस्तुत इंजेक्शन दृष्टिकोण आइसोफ्लुन एनेस्थीसिया और सटीकता बढ़ाने और तकनीकी त्रुटि को कम करने के लिए डिजिटल रूप से नियंत्रित, स्वचालित ड्रिल और सुई इंजेक्शन के साथ एक स्टीरियोटैक्टिक सेटअप का उपयोग करता है। एमआरआई ओहियो राज्य विश्वविद्यालय जेंस व्यापक कैंसर केंद्र छोटे पशु इमेजिंग साझा संसाधन में एक ९.४ टेस्ला उपकरण का उपयोग कर समय के साथ मापा जाता है । इमेजजे के उपयोग के माध्यम से हर बार बिंदु पर ट्यूमर वॉल्यूम माप का प्रदर्शन किया जाता है। कुल मिलाकर, यह इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन दृष्टिकोण सटीक इंजेक्शन, दिन-प्रतिदिन की निगरानी और सटीक ट्यूमर वॉल्यूम मापन की अनुमति देता है, जो मस्तिष्क मेटास्टेस के ड्राइवरों पर उपन्यास परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए इस मॉडल प्रणाली की उपयोगिता को बहुत बढ़ाता है।

Introduction

मस्तिष्क मेटास्टेस वयस्क प्राथमिक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ट्यूमर की तुलना में 10 गुना अधिक आम हैं1,और फेफड़ों के कैंसर, स्तन कैंसर और मेलानोमा के साथ लगभग हर ठोस ट्यूमर प्रकार में सूचित किया गया है जो उच्चतम घटना2का प्रदर्शन करते हैं। प्राथमिक ट्यूमर साइट के बावजूद, मस्तिष्क मेटास्टेसिस के विकास से अक्सर संज्ञानात्मक गिरावट, लगातार सिरदर्द, दौरे, व्यवहार और/या व्यक्तित्व,परिवर्तन1,3,4,5से जुड़े एक खराब पूर्वानुमान की ओर जाता है ।,, स्तन कैंसर के मामले में, बीमारी की रोकथाम और उपचार में कई प्रगति हुई है। हालांकि, स्तन कैंसर के साथ का निदान महिलाओं के 30% मेटास्टेस विकसित करने पर जाना होगा, और चरण चतुर्थ रोग के साथ उन में से, लगभग 7% (SEER 2010-2013) मस्तिष्क मेटास्टेसिस6,,7है । मस्तिष्क मेटास्टेसिस के लिए वर्तमान उपचार विकल्प शल्य चिकित्सा resection, स्टीरियोटाटिक रेडियोसर्जरी और/या पूरे मस्तिष्क रेडियोथेरेपी शामिल हैं । फिर भी, इस आक्रामक चिकित्सा के साथ, इन रोगियों के लिए औसत अस्तित्व एक छोटी 8-11 महीने7,,8,,9है। ये गंभीर आंकड़े उपन्यास, प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान और कार्यान्वयन की आवश्यकता का पुरजोर समर्थन करते हैं । इस प्रकार, मस्तिष्क में मेटास्टेसाइज करने वाले सभी कैंसर के साथ, क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगशाला में स्तन कैंसर से जुड़े मस्तिष्क मेटास्टेसिस (बीसीबीएम) को ठीक से मॉडल करना आवश्यक है।

आज तक, शोधकर्ताओं ने मस्तिष्क के लिए मेटास्टेसिस के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया है, प्रत्येक को अलग-अलग लाभ और सीमाओं के साथ10,,11। प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस विधियां जैसे पूंछ नस और इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन पूरे शरीर में ट्यूमर कोशिकाओं को फैलाते हैं और इंजेक्शन की कोशिकाओं के आधार पर अन्य मेटास्टैटिक साइटों पर ट्यूमर का भारी बोझ हो सकता है। ये परिणाम तब भ्रमित होते हैं जब विशेष रूप से मस्तिष्क में मेटास्टेसिस का अध्ययन किया जाता है। इंट्राक्राट्यूटेड धमनी इंजेक्शन विधि लाभप्रद है क्योंकि यह विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं के मस्तिष्क-सीडिंग को लक्षित करता है लेकिन सीमित है क्योंकि यह तकनीकी रूप से प्रदर्शन करना मुश्किल हो सकता है। ऑर्थोटोपिक प्राथमिक ट्यूमर रीसेक्शन को अक्सर मेटास्टेसिस का सबसे चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल माना जाता है क्योंकि यह पूरे मेटास्टैटिक झरना को फिर से रीकैपिटेट करता है। फिर भी, इस दृष्टिकोण में लिम्फ नोड, फेफड़े और जिगर जैसे अन्य मेटास्टैटिक साइटों की तुलना में मस्तिष्क मेटास्टेसिस की नाटकीय रूप से कम दरों के साथ होने के लिए सहज मेटास्टेसिस के लिए लंबे समय तक प्रतीक्षा अवधि शामिल है। अक्सर, जानवरों को मस्तिष्क मेटास्टेसिस के विकास से पहले इन अन्य मेटास्टैटिक साइटों पर ट्यूमर के बोझ के कारण अध्ययन से हटा दिया जाना चाहिए। मस्तिष्क रेखा कोशिका रेखाओं को शामिल करने वाले अन्य तरीके मस्तिष्क के मेटास्टेसिंग में प्रभावी हैं; हालांकि, ये मॉडल सीमित हैं कि उन्हें विकसित होने में समय लगता है और अक्सर प्रचार के साथ अपना ट्रोपिज्म खो देते हैं। इन सीमाओं को देखते हुए शोधकर्ताओं ने नियमित रूप से कैंसर मेटास्टेसिस को मस्तिष्क,11 , 12 ,13,13,14में अलग - अलग तरीकों के साथ मॉडल करने के लिए इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन विधि का उपयोग किया है15,16,17,18,,19.14 यह स्वीकार किया जाता है कि इस दृष्टिकोण में इसी तरह की सीमाएं हैं, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्राथमिक ट्यूमर से बाहर इंट्रावेशन सहित प्रारंभिक मेटास्टैटिक चरणों की जांच की अनुमति नहीं देता है, रक्त मस्तिष्क बाधा के माध्यम से पेनेट्रेस, और मस्तिष्क के भीतर स्थापना। हालांकि, यह शोधकर्ताओं के लिए परीक्षण करने की अनुमति देता है (1) क्या ट्यूमर व्युत्पन्न कारक मस्तिष्क के भीतर विकास मध्यस्थता (उदाहरण के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं में एक ऑन्कोजेनिक कारक के आनुवंशिक हेरफेर), (2) कैसे मेटास्टैटिक माइक्रोएनवायरमेंट में परिवर्तन इस साइट पर कैंसर के विकास को बदल (जैसे, बदल stromal घटकों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों के बीच तुलना) और (3) स्थापित lesions के पर उपंयास चिकित्सीय विकास की प्रभावशीलता ।

इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन मॉडल की संभावित उपयोगिता को देखते हुए, इंजेक्शन के दौरान तकनीकी त्रुटि को कम करना और समय के साथ ट्यूमर के विकास की सटीक निगरानी करना बिल्कुल आवश्यक है। यहां वर्णित विधि में सांस गैस संज्ञाहरण की निरंतर डोजिंग, और एक स्टीरियोटाक्टिक ड्रिल और इंजेक्शन स्टैंड का उपयोग करके मस्तिष्क परेंचिमा में ट्यूमर कोशिकाओं का प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण शामिल है। गैस एनेस्थेटिक का प्रशासन संज्ञाहरण की गहराई और लंबाई को ठीक ट्यूनिंग के साथ-साथ त्वरित और चिकनी वसूली सुनिश्चित करने की अनुमति देता है। एक डिजिटल नियंत्रित, स्वचालित ड्रिल और सुई इंजेक्शन प्रणाली इंजेक्शन साइट परिशुद्धता को बढ़ाता है और अक्सर ड्रिलिंग और मुक्त हाथ इंजेक्शन तरीकों द्वारा किए गए तकनीकी त्रुटि को कम कर देता है । चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग ट्यूमर के विकास, ट्यूमर की मात्रा, ऊतक प्रतिक्रिया, ट्यूमर परिगलन, और उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी में सटीकता को बढ़ाता है। एमआरआई20 , 21,नरम ऊतकों के लिए पसंद की इमेजिंग तौर -तरीकाहै । यह इमेजिंग तकनीक आयनीकरण विकिरण का उपयोग नहीं करती है और विशेष रूप से अध्ययन के दौरान कई इमेजिंग सत्रों के लिए गणना टोमोग्राफी (सीटी) पर पसंद की जाती है। एमआरआई उपलब्ध नरम ऊतक विपरीत तो सीटी या अल्ट्रासाउंड इमेजिंग (यूएसजी) की बहुत अधिक रेंज है और अधिक से अधिक विस्तार में शरीर रचना विज्ञान प्रस्तुत करता है । यह मस्तिष्क के भीतर ही असामान्यताओं के लिए अधिक संवेदनशील और विशिष्ट है। एमआरआई शारीरिक रूप से विषय को स्थानांतरित करने के लिए बिना किसी भी इमेजिंग विमान में किया जा सकता है जैसा कि 2D यूएसजी या 2डी ऑप्टिकल इमेजिंग में मामला है। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि खोपड़ी एमआरआई सिग्नल को अन्य इमेजिंग तौर-तरीकों की तरह क्षीण नहीं करती है। एमआरआई संरचनाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो सीटी या यूएसजी में हड्डी से कलाकृतियों द्वारा अस्पष्ट हो सकते हैं। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एमआरआई के लिए कई कंट्रास्ट एजेंट उपलब्ध हैं, जो अपेक्षाकृत कम विषाक्तता या दुष्प्रभावों के साथ घाव का पता लगाने की सीमा को बढ़ाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एमआरआई नेक्रॉप्सी के समय हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के विपरीत वास्तविक समय में निगरानी की अनुमति देता है, जो ट्यूमर की मात्रा को समझने में सीमित है। बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग जैसे अन्य इमेजिंग तौर-तरीके, समय के साथ शुरुआती ट्यूमर का पता लगाने और निगरानी के लिए वास्तव में प्रभावी हैं; हालांकि, इस विधि को सेल लाइनों के आनुवंशिक हेरफेर (जैसे, लूसिफ़ेरेस/जीएफपी टैगिंग) की आवश्यकता होती है और वॉल्यूमेट्रिक माप के लिए अनुमति नहीं देती है। एमआरआई और लाभप्रद है क्योंकि यह रोगी की निगरानी और एमआर छवियों के डाउनस्ट्रीम वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण को नेक्रॉप्सी22में हिस्टोलॉजिक ट्यूमर के आकार से दृढ़ता से सहसंबद्ध माना जाता है। एमआरआई स्क्रीनिंग के साथ धारावाहिक निगरानी भी न्यूरोलॉजिक हानि की नैदानिक निगरानी बढ़ जाती है, वे पैदा करना चाहिए ।

कुल मिलाकर, सीरियल एमआरआई के बाद स्टीरियोटाटिक इंट्राक्रैनियल ट्यूमर इंजेक्शन की प्रस्तुत विधि हमें कैंसर में मस्तिष्क मेटास्टेसिस के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय, पूर्वानुमानित और मापने योग्य परिणाम पैदा करने में सक्षम बनाती है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी (पी. आई जीना Sizemore) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है; प्रोटोकॉल #2007A0120) । सभी कृंतक अस्तित्व सर्जरी IACUC नीतियों का पालन किया जाता है, जिसमें बाँझ तकनीकों, आपूर्ति, उपकरणों के उपयोग के साथ-साथ चीरा साइट के फर हटाने और बाँझ तैयारी शामिल है।

1. स्तन कैंसर कोशिकाओं का इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन

नोट: यहां वर्णित विधि एक प्राथमिक MMTV-PyMT ट्यूमर23से व्युत्पन्न DB7 murine स्तन ट्यूमर सेल लाइन का उपयोग किया । पिछले अध्ययनों ने बीसीबीएम के मॉडल के रूप में डीबी7 कोशिकाओं के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन की स्थापना की है जो मानव रोग12की नकल करता है । महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा सक्षम FVB/N चूहों इस मॉडल के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में DB7 कोशिकाओं को इस माउस तनाव से प्राप्त किया गया । चूंकि यह एक स्तन कैंसर मॉडल है, वयस्क महिला चूहों का उपयोग इन अध्ययनों के लिए किया जाता है।

  1. कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. एक बाँझ हुड में, मानक तकनीकों का उपयोग करके सेल संस्कृति प्लेटों से मीडिया को एस्पिरेट करें।
    2. 1x डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके ट्रिप्सिनाइज करें।
    3. ट्राइप्सिन प्रतिक्रिया को रोकने और हीमोसाइटोमीटर या पसंदीदा विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एफबीएस युक्त मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर गोली कोशिकाएं।
    5. एस्पिरेट मीडिया, 1x डीपीबीएस के साथ धोएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर फिर से स्पिन करें।
    6. 1x डीपीबीएस में कोशिकाओं को उचित एकाग्रता के लिए पुनर्सुर्ण करें, लगभग 50,000 कोशिकाएं प्रति इंजेक्शन 2 माइक्रोन की मात्रा।
      नोट: सेल नंबर लाइन की आक्रामकता पर निर्भर है और अन्वेषक द्वारा निर्धारित करने की जरूरत है । हम नियमित रूप से 2 माइक्रोल का उपयोग करते हैं, लेकिन वॉल्यूम और एलटी;6 माइक्रोन का उपयोग15,16, 17,,,18,,,19की सूचना है।18 कम मात्रा परिशुद्धता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
    7. व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए इंजेक्शन तक बर्फ पर पुनः निलंबित कोशिकाओं को रखें।
  2. सर्जरी के लिए चूहों को तैयार करें।
    1. फर के साथ चूहों के लिए: कपाल से फर को हटा दें, या तो डिपिलेटरी क्रीम/लोशन द्वारा या शेविंग करके। सर्जरी से पहले 24-48 घंटे के भीतर ऐसा करें क्योंकि सर्जरी के बहुत करीब इस कदम को करने से त्वचा की गुणवत्ता और सीवन की ताकत में हस्तक्षेप हो सकता है।
      नोट: महिला FVB/N लगभग 25 ग्राम वजनी चूहों मेटास्टैटिक स्तन कैंसर, एक मुख्य रूप से महिला रोग के अध्ययन के कारण इस्तेमाल किया गया ।
    2. आईएसीयूसी द्वारा निर्धारित और पशुचिकित्सक में भाग लेने के रूप में एनाल्जेसिक का प्रशासन: बुप्रेनोरफिन एसआर-लैब का एक चमड़े का इंजेक्शन (0.05-0.1 मिलीग्राम/किलो खुराक, बुप्रेनोरफिन स्टॉक: 0.0025-0.088 एमएल की खुराक के लिए 0.5 मिलीग्राम/एमएल) सर्जरी से कम से कम 24 घंटे पहले 72 एच एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए, जिसे पहली खुराक के बाद 48-72 घंटे दोहराया जा सकता है, यदि आवश्यक हो। सर्जरी से पहले कम से कम 24-48 घंटे में NSAIDs (पीने के पानी में 20% आईबुप्रोफेन) का प्रशासन करें और सर्जरी के बाद 2-7 दिनों तक न्यूनतम 72 घंटे पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए जारी रखें।
      नोट: ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में, Buprenorphine एसआर लैब विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु संसाधन पशु चिकित्सा कर्मचारियों द्वारा प्रशासित के रूप में यह एक नियंत्रित पदार्थ है ।
  3. सर्जरी के लिए स्टीरियोटाटिक यूनिट तैयार करें।
    1. सभी संज्ञाहरण मशीनों, डिजिटल वर्नियर तराजू, और डिजिटल इंजेक्टर चालू करें।
      नोट: सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को सर्जरी से पहले पर्याप्त रूप से साफ और निष्फल किया जाना चाहिए।
    2. जैविक सुरक्षा कैबिनेट(चित्रा 1 ए)में इंडक्शन चैंबर अटैचमेंट के साथ एनेस्थेटिक मशीनों का उपयोग करें।
    3. सुनिश्चित करें कि एनेस्थीसिया मशीनों से सभी ट्यूब स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम(चित्रा 1 बी, इनसेट 1C)से जुड़े हुए हैं और उपयोग की जा रही सभी इकाइयों के लिए ट्यूबों पर क्लैंप खुले हैं। स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में जाने वाली ट्यूबों पर किसी भी क्लैंप को बंद करें जिसका उपयोग सर्जरी के लिए नहीं किया जाएगा।
    4. निर्माता के लिए संज्ञाहरण मशीनों सेट माउस वजन के आधार पर नाक शंकु प्रवाह दर की सिफारिश की (उदाहरण के लिए, 25 ग्राम पशु वजन: नाक शंकु प्रवाह दर ३४ एमएल/मिनट) ।
      नोट: इस स्टीरियोटाटिक सेट अप में शामिल हेड होल्डर की सिफारिश केवल वयस्क चूहों के लिए की जाती है। सुनिश्चित करें कि स्टीरियोटाटिक सेट अप के साथ शामिल निर्माता सिफारिशों का पालन किया जाता है।
    5. सुनिश्चित करें कि सिरिंज में पूर्वतृप्त उपयुक्त एनेस्थेटिक (जैसे, आइसोफ्लोरैन) एनेस्थीसिया मशीन(चित्रा 1B)से जुड़ा हुआ है।
      नोट: सिरिंज को अधिक भड़काने से सर्जरी के दौरान चूहों को बहुत अधिक संज्ञाहरण दिया जा सकता है और परिणामस्वरूप एनेस्थेटिक ओवरडोज हो सकता है।
    6. स्टेज लॉक घुमा कर अभ्यास तैयार करें, प्रत्येक ड्रिल में ड्रिल बिट एडाप्टर और 1 मिमी ड्रिल बिट डालें और बिट-लॉक को मैन्युअल रूप से कसकर ड्रिल को लॉक करें।
    7. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम(चित्रा 1C)पर अभ्यास संलग्न करें।
    8. 1x डीपीबीएस के 5 बारी वॉश के साथ हैमिल्टन सीरिंज साफ, तो 70% इथेनॉल, तो एक बार फिर 1x DPBS में। जब तक जानवर इंजेक्शन के लिए प्रीप्ड न हो जाए तब तक अलग रखें।
    9. 0.4 μL/मिनट की दर से देने के लिए डिजिटल इंजेक्टर सेट करें और 2 माइक्रोन का लक्ष्य निर्धारित करें। यह दर और मात्रा मस्तिष्क में ट्यूमर कोशिकाओं की धीमी गति से परिचय के लिए अनुमति देते हैं, जो दबाव और संबंधित क्षति को कम करता है।
  4. चूहों को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर रखें।
    1. उपरोक्त प्रेरण कक्ष का उपयोग करके चूहों (उदाहरण के लिए, आइसोफ्लुन) को एनेस्थेटाइज करें।
    2. एक गहरी संवेदनाहारी विमान में प्रक्रिया के दौरान चूहों को बनाए रखें। मशीन द्वारा प्रशासित% संज्ञाहरण सहित कई कारकों पर निर्भर करता है: प्रवाह दर, उत्तेजना की डिग्री, और शरीर का तापमान। लयबद्ध श्वसन के लिए मूल्यांकन करके संज्ञाहरण की गहराई के लिए प्रक्रिया के दौरान चूहों की अक्सर निगरानी करें (जानवर हांफने वाला नहीं है); पालपेब्रल पलटा की कमी (कपास टिप एप्लिकेटर के साथ उत्तेजित होने पर पलकों का फहराता); और पैर के अंगुली चुटकी की कमी (पैर की उंगलियों चुटकी के हानिकारक उत्तेजना पर अंग की वापसी) ।
      नोट: चूहों के विभिन्न उपभेदों संज्ञाहरण के लिए एक अलग प्रतिक्रिया होगी।
    3. चूहों के एक उपयुक्त, गहरे संवेदनाहारी विमान में होने के बाद, चूहों को स्टीरियोटैक्टिक इकाई में स्थानांतरित करें। शरीर के तापमान और एक उपयुक्त संवेदनाहारी विमान को बनाए रखने के लिए माउस स्टीरियोटाटिक मशीन पर है, जबकि एक हीटिंग पैड का उपयोग करें।
      नोट: लो प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए हम एक उल्टे पिपेट टिप बॉक्स (चित्र 1Dमें माउस उत्थान बॉक्स) के भीतर रखे गए एयर-एक्टिवेटेड हैंड वार्मर का उपयोग करते हैं।
    4. माउस के मुंह को खोलें और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम(चित्रा 2A)पर नाक के टुकड़े पर स्थित मुंह पट्टी के गर्त में दांत रखें। माउस की नाक/मुंह(चित्रा 2B)पर नाक शंकु स्लाइड ।
      1. मुंह बार करने के लिए उनके सिर के स्तर के साथ चूहों रखें। धीरे-धीरे एक कपास टिप एप्लिकेटर के कुंद अंत के साथ मुंह खोलें और जगह में स्लाइड करें। सुनिश्चित करें कि नाक शंकु पूरी तरह से माउस की नाक पर है या संज्ञाहरण ठीक से वितरित नहीं किया जाएगा। नाक शंकु नाक के साथ संलग्न नहीं होगा अगर दांत इस नाली के भीतर नहीं बैठे है (इनसेट चित्रा 2A)।
    5. एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करना, माउस की आंखों में से प्रत्येक पर आंख स्नेहक जगह है । आंखों के स्नेहक का आवेदन कॉर्निया के सूखने को कम करता है और कॉर्नियल आघात से संबंधित कॉर्नियल क्षति और पश्चात जटिलताओं की संभावना को कम करता है।
    6. बाएं कान के मध्याह्न के खिलाफ बाएं कान के बार को निराशाजनक बनाकर माउस की खोपड़ी को स्थिर करें, स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर स्क्रू का उपयोग करके इसे जगह में लॉक करें। फिर दाहिने कान के मध्यनिर्धारित कैंटस के खिलाफ दाहिने कान के बार को स्लाइड करें और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम(चित्रा 2B)पर तंग पेंच करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कान की सलाखों को रखते समय माउस का सिर स्तर और सीधे होता है। यदि सिर टेढ़ा या कोण है, तो इंजेक्शन मस्तिष्क में गलत जगह पर होगा। कान की सलाखों को केवल तब तक कड़ा किया जाना चाहिए जब तक खोपड़ी को मध्यम मैनुअल जांच के साथ उत्तेजना पर स्थिर न किया जाए।
  5. एक कैलवरियल विंडो बनाएं।
    1. 3x बारी के साथ खोपड़ी को तैयार और साफ करें एक बीटाडीन समाधान और 70% इथेनॉल से गुजरता है। आंखों के लिए शल्य चिकित्सा साइट के करीब निकटता के कारण, सर्जिकल स्क्रब पर बीटाडीन समाधान का उपयोग करें।
    2. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, कपाल के केंद्रीय औसत पहलू (सगित्तल सीवन रेखा के बाद) के साथ त्वचा के माध्यम से 3 मिमी चीरा बनाएं। चीरा पर रक्तस्राव कम से कम होना चाहिए। यह हो जाना चाहिए, और >30 सेकंड के लिए एक बाँझ कपास टिप applicator के साथ रक्तस्राव की साइट पर लगातार, दृढ़ दबाव लागू होते हैं ।
    3. डिजिटल वर्नियर स्केल को शून्य पर रीसेट करना सुनिश्चित करें, ब्रेग्मा(चित्रा 2सी)के लिए ड्रिल लंबवत पहचानें और उन्मुख करें।
    4. ड्रिल 2 मिमी पार्श्व को सगितल सीवन और 1 मिमी पूर्वकाल को कोरोनल सीवन(चित्रा 2 सी)में ले जाएं। प्रजनन क्षमता के लिए, यह सुनिश्चित करें कि धनु सीवन रेखा के बाईं या दाईं ओर स्थान सभी जानवरों के लिए सुसंगत रहता है।
    5. ड्रिल को अपनी उच्चतम गति पर चालू करें। सुनिश्चित करें कि त्वचा को घूर्णन बिट के कारण ऊतक क्षति से बचने के लिए ड्रिल से दूर ले जाया जाता है और ध्यान से खोपड़ी पर ड्रिल शुरू करें। कैल्वरिया के माध्यम से लगभग 0.5 मिमी गहरी छेद करें, जिसके परिणामस्वरूप कैल्वरियाल खिड़की होती है। ड्रिल को बहुत दूर तक कम न करें या यह मस्तिष्क में ड्रिल न करे। ड्रिल साइट पर बाँझ खारा छोड़ने जबकि ड्रिल गति में है किसी भी मशीन है कि आसपास के ऊतकों को थर्मल नुकसान का कारण हो सकता है द्वारा उत्पन्न गर्मी ऑफसेट कर सकते हैं ।
    6. एक बार कैल्वरियल विंडो बनाने के बाद, सावधानी से ड्रिल बढ़ाएं और इसे स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से हटा दें।
    7. 70% इथेनॉल का उपयोग करके ड्रिल बिट्स को साफ करें और फिर से उपयोग किए जाने पर अलग सेट करें। यदि नहीं, तो ड्रिल बिट्स को हटा दें और 70% इथेनॉल में डूबे।
  6. मस्तिष्क में कैंसर की कोशिकाओं इंजेक्शन
    1. स्टीरियोटैक्टिक उपकरण(चित्रा 1D)के लिए स्वचालित इंजेक्टर इकाई संलग्न करें।
    2. एक साफ हैमिल्टन सिरिंज में 1x डीपीबीएस में अच्छी तरह से निलंबित कोशिकाओं के और gt;2 μL खींचो । झुरमुट गठन को कम करने और एक समरूप कोशिका घोल सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज भरने से तुरंत पहले कोशिकाओं को फिर से रिस्पन करना सुनिश्चित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सेल वॉल्यूम के 6-8μL को खींचने के लिए आदर्श है कि कोई हवा की जेब/
    3. इंजेक्टर उपकरण पर हैमिल्टन सिरिंज प्लेस, और एक डिस्पोजेबल बाँझ कपड़ा पर मात्रा की एक छोटी राशि वितरण के द्वारा इंजेक्शन के लिए सुई प्रधानमंत्री को सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्टर ठीक से काम कर रहा है । एक कॉटन टिप एप्लिकेटर(चित्रा 1D, इनसेट)के साथ 70% इथेनॉल के साथ सिरिंज को पोंछें। यह सुई शाफ्ट के बाहरी बैरल से ट्यूमर कोशिकाओं को निकालता है जिससे इंजेक्शन ट्रैक्ट के साथ ट्यूमर सेल सीडिंग का खतरा कम हो जाता है।
    4. सुई टिप को कैल्वरियल विंडो के केंद्र में संरेखित करें, लगभग उजागर सेरेब्रम को छूएं।
    5. डिजिटल वर्नियर स्केल को शून्य पर रीसेट करें।
    6. धीरे-धीरे सुई को मस्तिष्क में 3 मिमी की गहराई में डालें और सुई को आगे बढ़ने से पहले कम से कम 60 सेकंड तक मस्तिष्क में रहने दें। इस समय सीमा मस्तिष्क परेन्चिमा सुई के आसपास अनुरूप करने के लिए अनुमति देता है, जो वापस दबाव और सुई पथ के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के संभावित निष्कासन को कम कर देता है ।
    7. इंजेक्शन साइट के लिए कोशिकाओं की डिलीवरी शुरू करने के लिए इंजेक्टर स्क्रीन पर चलाने का चयन करें। इस मात्रा को इंजेक्ट करने में लगभग 5 मिनट का समय लगेगा। इस कदम के लिए लंबे समय तक मस्तिष्क परेन्चिमा पर इंजेक्शन बल के कारण द्वितीयक क्षति को कम करने के लिए है।
    8. एक बार इंजेक्शन प्रोटोकॉल समाप्त हो जाने के बाद, सुई को कम से कम 3 मिनट के लिए मस्तिष्क में आराम करने की अनुमति दें, फिर से मस्तिष्क पैरेंचिमा को इंजेक्शन को स्वीकार करने की अनुमति दें।
    9. कम से कम 3 मिनट के बाद, 0.75 मिमी/ सुई पथ पर नज़र रखने के लिए वापस दबाव और ट्यूमर को कम करने के लिए एक बेहद धीमी और सुसंगत तरीके से ऐसा करें।
    10. एक बार सुई मस्तिष्क से बाहर निकल गया है, ध्यान से इंजेक्टर से हैमिल्टन सिरिंज को हटाने और साफ के रूप में कदम १.२.८ में वर्णित है ।
    11. एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर कैल्वरियल खिड़की पर गर्म हड्डी मोम लागू करें। हड्डी मोम खोपड़ी के भीतर ट्यूमर रखने के लिए एक शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है।
    12. चीरा बंद करें (उदाहरण के लिए, 5-0 पीडीएस भंग टांके एक साधारण बाधित पैटर्न या सीवन क्लिप में, जो भी सर्जन के लिए सबसे आरामदायक है)।
    13. संज्ञाहरण के प्रशासन को रोकें और कान की सलाखों को अनलॉक करके और फिसलने से उपकरण से माउस को हटा दें, माउस से नाक शंकु फिसलने, और मुंह के बार से दांतों को अलग करें।
    14. माउस को एक साफ पिंजरे में रखें जो वसूली के लिए गर्म सेट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर है। वसूली के दौरान चूहों की निगरानी करें, जो आमतौर पर संज्ञाहरण बंद होने के 10-15 मिनट बाद होता है।
    15. माउस बरामद होने के बाद, मेजबान संस्था के IACUC द्वारा निर्धारित प्रारंभिक हटाने के मापदंड के लिए निगरानी करें।

2. चुंबकीय अनुलाता इमेजिंग

  1. मानक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन24 10-20 मिनट इमेजिंग से पहले चूहों को 0.1 मीटर मल्टीहंस के 100 माइक्रोल/20 ग्राम शरीर वजन माउस) को गडोलिनियम-आधारित कंट्रास्ट एजेंट (100 माइक्रोन/20 ग्राम शरीर का वजन माउस) प्रशासित करें। फिर एक साँस एनेस्थेटिक (जैसे, आइसोफ्लोरैन) के साथ एक इंडक्शन चैंबर का उपयोग करके एनेस्थेटाइज करें, 95% O2 और 5% सीओ2 (यानी, आपूर्ति किए गए कमरे की वायु गैस) के साथ मिलाया गया।
  2. शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक गर्म धारक पर माउस रखें। कान के शूल और एक काटने बार के साथ सिर सुरक्षित, और एक माउस मस्तिष्क सतह कुंडली से लैस 9.4 टी चुंबक में धारक जगह है। इमेजिंग समय के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखें, एक अध्ययन आमतौर पर प्रति माउस लगभग 20 मिनट लेता है। वायवीय तकिया और छोटे पशु निगरानी प्रणाली का उपयोग करके प्रक्रिया के दौरान श्वसन दर और हृदय गति (~ 70 बीपीएम) की निगरानी करें।
  3. एक स्थानीयता छवि प्राप्त करें, और फिर एक T2-भारित दुर्लभ अनुक्रम (TR = 3500-4228 एमएस, TE = 12 एमएस, दुर्लभ कारक = 8, का उपयोग कर माउस मस्तिष्क छवि, FOV= 2.0 x 2.0 सेमी, मैट्रिक्स आकार = 256 x 256, 1 मिमी या 0.5 मिमी स्लाइस मोटाई, एनए = 2-4, 15-30 समीपस्थ स्लाइस) और पोस्ट गाडोलिनियम आधारित कंट्रास्ट टी 1-भारित दुर्लभ अनुक्रम (टीआर = 1200 एमएस, TE = 7.5 ms, Factor4 , FOV = 2.0 x 2.0 सेमी, मैट्रिक्स आकार = 256 x 256, 1 मिमी या 0.5 मिमी स्लाइस मोटाई, एनए = 2-4, 15-30 समीपस्थ स्लाइस)।
  4. पोस्ट इमेजिंग, वसूली के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म सेट पर एक पिंजरे में माउस रखें।

3. वॉल्यूमेट्रिक ट्यूमर माप

  1. कुल ट्यूमर की मात्रा प्राप्त करना
    1. इमेजजे में एमआरआई DICOM डेटा फ़ाइल खोलें, एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (https://imagej.nih.gov/ij/)25के माध्यम से एक मुफ्त डाउनलोड के रूप में उपलब्ध है ।
      नोट: इमेजजे DICOM फ़ाइलों को देखने की अनुमति देता है, जो ट्यूमर वॉल्यूम गणना के लिए एम्बेडेड पिक्सेल आयामों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है (छविदेखें, गुण जहां "लंबाई की इकाई" वांछित (उदाहरण के लिए, मिमी)) के रूप में सेट किया जा सकता है।
    2. ट्यूमर के चारों ओर एक रूपरेखा आकर्षित करने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें। दृश्यता बढ़ाने के लिए एक अंधेरे कमरे में इन चयनों का प्रदर्शन करें। सत्रों के बीच स्थिरता बनाए रखने के लिए चमक/विपरीत को समायोजित न करें ।
    3. विश्लेषण टैब के तहत, चयनित क्षेत्र के क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए उपाय का चयन करें। यदि मिलीमीटर की इकाई को चरण 3.1.1 में चुना गया था, तो क्षेत्र घन मिलीमीटर में दिया जाएगा। यदि वांछित है, तो सीटीआरएल + डीका चयन करके फ्रीहैंड चयन को एम्बेड करें। संपादित करने के लिए जा रहा द्वारा आउटपुट रंग बदलें । विकल्प । रंग। छवि को आरजीबी छवि में परिवर्तित करें (छवि । टाइप । आरजीबी रंग) .tif फ़ाइल के रूप में बचत करने से पहले।
    4. एक व्यक्ति माउस और कॉपी मूल्यों के लिए सभी ट्यूमर युक्त स्लाइस को एक उपयुक्त डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (जैसे, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या ग्राफपैड चश्मे) में मापने के साथ आगे बढ़ें।
    5. कुल ट्यूमर की मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक स्लाइस से क्षेत्रों का योग करें। स्लाइस मोटाई (क्षेत्र/मोटाई) के आधार पर क्षेत्र को सही करना सुनिश्चित करें।
    6. पूर्ण चरण 3.1.1.-3.1.5। जब तक सभी चूहों में कुल ट्यूमर की मात्रा नहीं होती है। ट्यूमर रूपरेखा के कुछ व्यक्तिपरक प्रकृति को देखते हुए, यह आदर्श है अगर एक ही पद्धति कई बार दोहराया है और तकनीकी त्रुटि को कम करने के लिए औसत है ।
    7. स्केल बार सेट करने के लिए, DICOM डेटा फ़ाइल खोलें और विश्लेषण करने के लिए जाएं । उपकरण । स्केल बार। चूंकि आयाम पहले से ही DICOM फ़ाइल में एम्बेडेड हैं, बस वांछित लंबाई/चौड़ाई चुनें । एक आरजीबी छवि के लिए गुप्त(छवि । टाइप । आरजीबी रंग) .tif फ़ाइल के रूप में बचत करने से पहले।

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Representative Results

चित्रा 3 दो समय अंक (दिन 7 और दिन 10) के बाद मुरीन स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन पर एक ही माउस के लिए ट्यूमर की मात्रा मात्रा का अवलोकन करता है । इस प्रयोग के लिए ५०,००० डीबी7 कोशिकाओं को इंजेक्ट किया गया और एमआरआई द्वारा जानवर के मस्तिष्क का मूल्यांकन किया गया । प्रत्येक स्कैन के लिए, 30 स्लाइस (0.5 मिमी मोटाई) पर कब्जा कर लिया गया था। स्कैन प्रति 30 स्लाइस के मूल्यांकन से पता चला है कि दिन में 7 के बाद इंजेक्शन, 5 स्लाइस ट्यूमर बोझ(चित्रा 3A)का प्रदर्शन किया और दिन में 10 के बाद इंजेक्शन, 9 स्लाइस ट्यूमर बोझ(चित्रा 3B)का प्रदर्शन किया । प्रत्येक छवि का मूल्यांकन ट्यूमर क्षेत्र के लिए किया गया था जैसा कि वर्णित है और प्रत्येक फ्रेम के लिए क्षेत्र को चित्र 3सीमें चित्रित किया गया है। कुल ट्यूमर की मात्रा निर्धारित और टुकड़ा मोटाई के लिए समायोजित किया जाता है। चित्रा 4 प्रतिनिधि छवियों(चित्रा 4A)और समय के साथ ट्यूमर की मात्रा का एक हिस्टोग्राम(चित्रा 4B)सहित प्रकाशन प्रारूप में प्रतिनिधि डेटा को दर्शाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: स्टीरियोटैक्टिक और एनेस्थीसिया सिस्टम। (ए)बायोलॉजिकल सेफ्टी कैबिनेट के भीतर एनेस्थीसिया इंडक्शन चैंबर सेटअप। (ख)स्टीरियोटैक्टिक एनेस्थेटिक डिलीवरी सेटअप एनेस्थेटिक मशीन से स्टीरियोटैक्टिक उपकरण पर नाक शंकु तक संज्ञाहरण टयूबिंग को हाइलाइट करता है (इनसेट इनसेट(सी))देखें। हरे तीर से संकेत मिलता है कि संवेदनाहारी गैस ट्यूबिंग दी जाती है, और नीले तीर मैला गैस ट्यूबिंग का संकेत देते हैं। (ग)ड्रिल अटैचमेंट के साथ स्टीरियोटाटिक स्टैंड । इनसेट एनेस्थेटिक ट्यूबिंग (हरे और नीले तीर), मुंह बार, और कान सलाखों से पता चलता है। (घ)स्वचालित सिरिंज पंप और माउस उत्थान बॉक्स के साथ स्टीरियोटाटिक स्टैंड । बॉक्स एक उल्टे पिपेट टिप बॉक्स है जिसमें हाथ वार्मर होते हैं जो माउस को उचित ऊंचाई तक ऊंचाई पर ले जाते हैं और शरीर के तापमान को बनाए रखते हैं। इनसेट स्वचालित इंजेक्शन उपकरण में हैमिल्टन सिरिंज के अभिविन्यास को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक स्टीरियोटैक्टिक डिवाइस पर दांत प्लेसमेंट का सचित्र प्रतिनिधित्व, कान की सलाखों का स्थान, और ब्रेग्मा के सापेक्ष कैल्वेरियल विंडो। }Aनाक के शंकु पर दांत के पायदान में मैक्सिलरी चीरों का सचित्र। (ख)संबंधित कानों के मध्याह्न के भीतर बाएं और दाएं कान की सलाखों का स्थान। (ग)एक तीर ब्रेग्मा को इंगित करता है और एक लाल बिंदु उस स्थान को इंगित करता है जहां कैल्वरियल विंडो बनाई जानी चाहिए (सगित्तल सीवन के लिए 2 मिमी पार्श्व और कोरोनल सीवन के लिए 1 मिमी पूर्ववर्ती)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: दो समय अंक के बाद इंजेक्शन पर एक ही माउस के लिए ट्यूमर की मात्रा मात्रा का उदाहरण । (ए)दिन 7 और(बी)दिन 10 के बाद इंजेक्शन पर ट्यूमर युक्त स्लाइस की छवियां । पीला इमेजजे में मात्रा निर्धारित ट्यूमर क्षेत्र को दर्शाता है। (ग)स्लाइस क्षेत्र और इमेजजे में निर्धारित कुल वॉल्यूमेट्रिक मात्राकरण (*=स्लाइस मोटाई (0.5 मिमी) के लिए सुधार)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रकाशन प्रारूप में प्रतिनिधि ट्यूमर मात्रा मात्राकरण। (A)स्केल बार (= 2 मिमी) के साथ प्रतिनिधि छवियां। (ख)दो बार के अंकों के लिए ट्यूमर की मात्रा(एमएम 3)का चित्रण करने वाला हिस्टोग्राम । गुना परिवर्तन नोट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एमआरआई के साथ धारावाहिक निगरानी के बाद इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन का उपयोग समय के साथ ट्यूमर की मात्रा सटीकता के साथ ट्यूमर विकास की कल्पना करने की अनूठी क्षमता प्रदान करता है। डिजिटल इमेजिंग विश्लेषण का अनुप्रयोग ट्यूमर की मात्रा, रक्तस्राव, परिगलन और उपचार के जवाब के लिए मस्तिष्क के घावों की व्याख्या के लिए अनुमति देता है।

किसी भी प्रक्रिया के साथ के रूप में, वहां महत्वपूर्ण कदम है कि सफलता के लिए पालन किया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, स्टीरियोटाटिक उपकरणों का सावधानीपूर्वक सेटअप इस तकनीक की सफलता के लिए जरूरी है। मुरीन कपाल के छोटे आकार के कारण, मामूली असंगति ट्यूमर विकास दर पर नाटकीय रूप से अलग प्रभाव में परिणाम और प्रयोगात्मक जानवरों में ले जा सकते हैं । इस प्रकार, इन उपकरणों के उपयोग पर उचित प्रशिक्षण आवश्यक है । दूसरा, प्रक्रिया के दौरान एक हीटिंग स्रोत यह सुनिश्चित करता है कि एनेस्थेटिक विमान बहुत कम नहीं गिरा। कम शरीर के तापमान में कमी दवा चयापचय और संज्ञाहरण के अनजाने ओवरडोज और/या वसूली के समय को लम्बा कर सकते है के कारण संज्ञाहरण के तहत अचानक मरने का खतरा जानवरों जगह है । पूर्वनिर्मित हीटिंग पैड भारी और स्टीरियोटैक्टिक मशीन पर चारों ओर पैंतरेबाज़ी करने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन छोटे, हवा सक्रिय हाथ किसी भी वाणिज्यिक विक्रेता के माध्यम से खरीदा warmers तापमान बनाए रखने और काफी छोटे करने के लिए उल्टे पिपेट टिप बॉक्स के भीतर रखा जा करने के लिए स्टीरियोटेक्टिक सेटअप के लिए उचित स्तर तक चूहों तरक्की का इस्तेमाल किया । अंत में, मात्रा सीधा है, लेकिन अक्सर निर्धारित क्या ट्यूमर बनाम क्या ट्यूमर नहीं है चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यह सिफारिश की जाती है कि जांचकर्ता सटीक मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग स्टाफ के साथ परामर्श करें। यह त्रुटि को कम करने के लिए कई बार ट्यूमर वॉल्यूम माप दोहराने में भी सहायक है। साथ ही, प्रत्येक अध्ययन सभी छवियों के लिए एक ही व्यक्ति द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता वरीयताओं के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, इंजेक्शन संज्ञाहरण (जैसे, केटामाइन/जाइलाज़ीन) का उपयोग आम है और निश्चित रूप से अन्वेषक वरीयता के आधार पर एक साँस संज्ञाहरण (जैसे, आइसोफ्लुन) के बदले में उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, एक साँस संज्ञाहरण के फायदों पर विचार करना महत्वपूर्ण है: (1) एक नियंत्रित पदार्थ नहीं, (2) संज्ञाहरण के स्तर को समय के साथ समायोजित किया जा सकता है (पशु वजन द्वारा निर्धारित केटामाइन की अग्रिम खुराक की तुलना में), और (3) वसूली केटामाइन/जाइलाज़ीन की तुलना में अपेक्षाकृत जल्दी होती है। दूसरा, स्वचालित ड्रिल का उपयोग सटीकता का एक उच्च स्तर प्रदान करता है, लेकिन स्थापित करने के लिए और नीचे इकाई आंसू की जरूरत समय दिया प्रक्रिया के लिए समय कहते हैं । यदि वांछित हो तो मुफ्त सौंपने की तकनीक का उपयोग करना निश्चित रूप से उचित है।

यह प्रोटोकॉल एक स्टीरियोटाटिक सेटअप के साथ-साथ एमआरआई के उपयोग दोनों का उपयोग करता है, दोनों बढ़ी हुई लागत से जुड़े होते हैं। इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के लिए वैकल्पिक तरीके पहले15 , 16,17,18,19वर्णित19किए गए हैं . इनमें से कुछ तरीके भी यदि पसंद किए जाते हैं तो पूरे अध्ययन में ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के उपयोग को भी नियोजित करते हैं।

जैसा कि ऊपर बताया गया है, मॉडल प्रणाली का अध्ययन किए जाने के आधार पर इंजेक्शन के लिए उचित सेल नंबर निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। एक इम्यूनोसंप्यूटेंट होस्ट में मुरीन कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए एक इम्यूनोडिफिशिएंसी मेजबान में मानव कोशिकाओं के इंजेक्शन की तुलना में कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। एमआरआई द्वारा इंजेक्शन ट्यूमर बोझ निगरानी के बाद यह निर्धारित करने में मदद करता है कि इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या उचित है के रूप में यह देखने के लिए जब ट्यूमर एक निश्चित मात्रा तक पहुंचने और किस बिंदु पर चूहों जल्दी हटाने के मापदंड तक पहुंचने शुरू संभव है ।

गैर - विकासात्मक निगरानी के लिए एमआरआई की उपयोगिता और व्यापक अनुप्रयोग का उपयोग अन्य लोगों द्वारा लघु पशु अनुसंधान अध्ययन26में किया गया है । जबकि एमआरआई पहले से ही चर्चा के रूप में कई फायदे प्रदान करता है, वहां वास्तव में उल्लेख के लायक सीमाएं हैं । पहला, मशीन का उपयोग कोर सेवा कर्मियों और मशीन की उपलब्धता पर निर्भर है। दूसरा, उपयोग महंगा हो सकता है। यदि ये चिंताएं हैं, तो बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग का उपयोग ट्यूमर की निगरानी के लिए एक वैध विकल्प है17,,19। तीसरा, ट्यूमर और आसपास के ऊतकों (यानी, मस्तिष्क) के बीच विपरीत विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं; हालांकि, यह पद्धति सेल लेबलिंग की अनुपस्थिति में वीवो में ट्यूमर की पहचान करने का सबसे बड़ा मौका प्रदान करती है। अंत में, एमआरआई अपने संकल्प में सीमित है, जो ट्यूमर की मात्रा डेटा को तिरछा कर सकता है जहां ऐसा लगता है कि वास्तव में विकास रैखिक है। वहां भी एक अधिकतम ट्यूमर की मात्रा है कि एमआर इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह एक चिंता का विषय कम है क्योंकि यह संभावना नहीं है एक माउस ऊपरी छोर पर एक ट्यूमर बच सकता है । ट्यूमर का पता लगाने की सीमा मस्तिष्क में ट्यूमर के प्रकार और स्थान पर निर्भर करती है, चाहे रक्त मस्तिष्क बाधा रिसाव हो, और क्या ट्यूमर अच्छी तरह से घिरा हुआ है या आसपास के ऊतकों में घुसपैठ कर रहा है। यह इस बात पर भी निर्भर करता है कि क्या यह एक कंट्रास्ट बढ़ाने ट्यूमर है और एमआर इमेजिंग प्रोटोकॉल किस प्रकार का उपयोग किया जाता है। हमारे अनुभव में, 78x78 माइक्रोन के इन-प्लेन वोक्सल आकार और 0.5 मिमी स्लाइस मोटाई के साथ, हम 0.3 मिमी के आसपास न्यूनतम सीमा के साथ नियमित रूप से 0.5 मिमी व्यास ट्यूमर का निरीक्षण कर सकते हैं।

इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के बारे में, विचार करने के लिए कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन मेटास्टैटिक झरना को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं जिसमें वे प्राथमिक ट्यूमर के भीतर मेटास्टैटिक गुणों के विकास को पूरी तरह से बाईपास करते हैं, रक्तप्रवाह में अंतरण करते हैं, और रक्त मस्तिष्क बाधा11के माध्यम से प्रवेश करते हैं। दूसरा, सीधे मस्तिष्क में इंजेक्शन देकर यह विधि सूजन लाती है, जो न्यूरोइंफ्लैमेशन से जुड़े निष्कर्षों को भ्रमित कर सकती है। अंत में, इस साइट पर प्रत्यक्ष इंजेक्शन समय की एक छोटी अवधि में तेजी से विकास में परिणाम कर सकते हैं । हिंद अंग पक्षाघात, सुस्ती और एटैक्सिया सहित न्यूरोलॉजिकल लक्षणों के लिए चूहों की निगरानी करना महत्वपूर्ण है।

सभी माना जाता है, मस्तिष्क में सीधे इंजेक्शन ट्यूमर की निगरानी के लिए दर ले, जो विशेष रूप से इस मेटास्टेटिक साइट के भीतर विकास के बारे में शोधकर्ता को सूचित कर सकते है और साथ ही मस्तिष्क मेटास्टेटिक माइक्रोएनवायरमेंट के साथ बातचीत की अनुमति देता है । इसके अलावा, समय के साथ ट्यूमर बोझ की निगरानी अन्वेषक को सीधे बदल ट्यूमर फेनोटाइप, बदल माइक्रोएनवायरनमेंट फेनोटाइप और प्रयोगात्मक चिकित्सीय रणनीतियों की प्रतिक्रिया की तुलना करने की अनुमति देता है। माउस मॉडल में सहज और प्रयोगात्मक मस्तिष्क मेटास्टेसिस दोनों की अपेक्षाकृत कम घटनाओं को देखते हुए, इंट्राक्रैनियल तकनीक वास्तव में एक मूल्यवान उपकरण है।

मस्तिष्क के लिए कैंसर मेटास्टेसिस एक भयावह निदान है जिसमें वर्तमान उपचार रणनीतियों के प्रति खराब प्रतिक्रिया होती है1,11,27. जबकि स्तन कैंसर महिलाओं में मस्तिष्क मेटास्टेसिस का प्रमुख कारण है और यहां ध्यान केंद्रित है, फेफड़ों का कैंसर सभी कैंसर रोगियों में मस्तिष्क मेटास्टेसिस का सबसे आम कारण है2। इसके अलावा, ठोस ट्यूमर प्रकार की एक सरणी के साथ का निदान रोगियों में मस्तिष्क मेटास्टेस की सूचना दी गई है, और यह उंमीद है कि घटना को बढ़ाने के रूप में चिकित्सा के लिए एक्सट्राक्रैनियल रोग के इलाज में सुधार जारी रहेगा । इस प्रकार, जबकि इस प्रस्ताव का ध्यान बीसीबीएम पर है, इंट्राक्रैनियल कैंसर इंजेक्शन और एमआरआई विश्लेषण अन्य ठोस ट्यूमर प्रकारों के मस्तिष्क मेटास्टेस के साथ-साथ प्राथमिक ब्रेन ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए लागू होता है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन मॉडल का उपयोग शोधकर्ताओं को बेहतर रोगी की देखभाल की उम्मीद में अनुसंधान प्रश्नों की एक किस्म का परीक्षण करने के लिए जानवरों के बड़े साथियों में रोग का पुनर्पूंजीकरण करने में सक्षम बनाता है । एमआरआई द्वारा प्राप्त उच्च संकल्प डिजिटल छवियों के साथ इस मॉडल को युग्मन करके, कई समय बिंदुओं पर ट्यूमर की मात्रा के साथ-साथ चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया की निगरानी करना संभव है।

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Disclosures

लेखपालों के पास कोई खुलासे नहीं होते।

Acknowledgments

प्रतिनिधि डेटा राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (K22CA218472 से जी.M. के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था । इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर टारगेट वेरीफिकेशन शेयर्ड रिसोर्स (डायरेक्टर - डॉ रीना शाक्य) में किए जाते हैं और एमआरआई ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर स्मॉल एनिमल इमेजिंग शेयर्ड रिसोर्स (डायरेक्टर - डॉ किरली पॉवेल) में पूरा होता है। दोनों साझा संसाधनों को OSUCCC के माध्यम से वित्त पोषित किया जाता है, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (P30 CA016058) से OSUCCC कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट, ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेजों और विभागों के साथ साझेदारी, और स्थापित चार्जबैक सिस्टम।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Materials
Betadine Purdue Products 19-027132 Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax Surgical Specialities 903 Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab ZooPharm N/A Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators Puritan 25-806 10WC Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment Puralube 17033-211-38 Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers Hothands HH2 Air-activated heat packs
Ibuprofen Up & Up 094-01-0245 100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane Henry Schein INC 1182097 Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels Integra Miltex 4-410 #10 disposable scalpel blade
Skin Glue Vetbond 1469SB Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing TIDI Products 25-517 Individually packed sterile drapes
Suture Covidien SP5686G 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom) Kopf Model 1474 Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Model 923-B Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars Kopf Model 922 Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument Kopf Model 940 Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe Hamilton 80366 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump KD Scientific P/N: 788130 Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer Kent Scientific SS-01 Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice Kent Scientific SOMNO-MSEKIT Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Geisler, J. A., Spehar, J. M., Steck, S. A., Bratasz, A., Shakya, R., Powell, K., Sizemore, G. M. Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61272, doi:10.3791/61272 (2020).

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