Summary
Intrakraniell hjernemetastasemodellering er komplisert av manglende evne til å overvåke tumorstørrelse og respons på behandling med presise og belysende metoder. Den presenterte metodikken par intrakraniell tumor injeksjon med magnetisk resonans imaging analyse, som når kombinert, dyrker presise og konsekvente injeksjoner, forbedret dyr overvåking, og nøyaktige tumor volum målinger.
Abstract
Metastatisk spredning av kreft er en uheldig konsekvens av sykdomsprogresjon, aggressive kreftundertyper og/eller sen diagnose. Hjernemetastaser er spesielt ødeleggende, vanskelige å behandle og gir en dårlig prognose. Mens den nøyaktige forekomsten av hjernemetastaser i USA fortsatt er vanskelig å anslå, er det sannsynlig å øke etter hvert som utenomkranielle terapier fortsetter å bli mer effektive i behandling av kreft. Dermed er det nødvendig å identifisere og utvikle nye terapeutiske tilnærminger for å behandle metastase på dette stedet. For dette formål har intrakraniell injeksjon av kreftceller blitt en veletablert metode for å modellere hjernemetastase. Tidligere har manglende evne til å måle tumorvekst direkte vært en teknisk hindring for denne modellen; Men økende tilgjengelighet og kvalitet på små dyr imaging modaliteter, som magnetisk resonans imaging (MR), er i stor grad bedre evnen til å overvåke tumorvekst over tid og utlede endringer i hjernen i løpet av eksperimentell periode. Heri er intrakraniell injeksjon av murine brysttumorceller i immunkompetentmus etterfulgt av MR demonstrert. Den presenterte injeksjontilnærmingen benytter isoflurananestesi og et stereotaktisk oppsett med en digitalt kontrollert, automatisert drill- og nåleinjeksjon for å forbedre presisjonen og redusere tekniske feil. MR måles over tid ved hjelp av et 9,4 Tesla-instrument i Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumorvolummålinger demonstreres på hvert tidspunkt gjennom bruk av ImageJ. Samlet sett gir denne intrakranielle injeksjonsmetoden presis injeksjon, daglig overvåking og nøyaktige tumorvolummålinger, som kombinert sterkt forbedrer nytten av dette modellsystemet for å teste nye hypoteser om driverne av hjernemetastaser.
Introduction
Hjernemetastaser er 10 ganger vanligere enn voksne primære sentralnervesystemsvulster1, og har blitt rapportert i nesten alle faste tumortyper med lungekreft, brystkreft og melanom som viser høyest forekomst2. Uavhengig av det primære tumorstedet fører utviklingen av hjernemetastase til en dårlig prognose ofte forbundet med kognitiv nedgang, vedvarende hodepine, anfall, atferdsmessige og / eller personlighetsendringer1,3,4,5. Når det gjelder brystkreft, har det vært mange fremskritt i forebygging og behandling av sykdommen. Imidlertid vil 30% av kvinnene diagnostisert med brystkreft fortsette å utvikle metastaser, og av de med stadium IV sykdom, ca 7% (SEER 2010-2013) har hjernen metastase6,7. Nåværende behandlingstilbud for hjernemetastase innebærer kirurgisk reseksjon, stereotaktisk radiokirurgi og/eller hel hjerneradioterapi. Likevel, selv med denne aggressive terapien, er median overlevelse for disse pasientene en kort 8-11 måneder7,8,9. Disse dystre statistikkene støtter sterkt behovet for identifisering og implementering av nye, effektive terapeutiske strategier. Dermed, som med alle kreftformer som metastaserer til hjernen, er det viktig å modellere brystkreft assosiert hjernemetastase (BCBM) i laboratoriet for å sikre betydelige fremskritt i feltet.
Til dags dato har forskere benyttet en rekke metoder for å studere mekanismer for metastase til hjernen, hver med forskjellige fordeler ogbegrensninger 10,11. Eksperimentelle metastase metoder som hale vene og intracardiac injeksjon spre tumorceller i hele kroppen og kan resultere i enorme tumor byrde på andre metastatiske steder avhengig av cellene injisert. Disse resultatene er da forvirrende hvis spesifikt studerer metastase til hjernen. Intracarotid arterie injeksjon metoden er en fordel som det spesifikt rettet mot hjerne-seeding av tumorceller, men er begrenset som det kan være teknisk vanskelig å utføre. Ortotopisk primær tumorreseksjon regnes ofte som den mest klinisk relevante metastasemodellen, da den rekastaterer hele metastatisk kaskade. Likevel innebærer denne tilnærmingen lengre ventetider for spontan metastase å skje med dramatisk lavere forekomst av hjernemetastase sammenlignet med de andre metastatiske stedene som lymfeknuten, lungene og leveren. Ofte må dyr fjernes fra studier på grunn av tumorbyrde på disse andre metastatiske stedene før utviklingen av hjernemetastase. Andre metoder som involverer hjernenstropiske cellelinjer er effektive for metastasering til hjernen; Imidlertid er disse modellene begrenset ved at de tar tid å utvikle og ofte mister sin tropisme med forplantning. Gitt disse begrensningene, forskere har rutinemessig brukt intrakraniell injeksjon metode for å modellere kreft metastase til hjernen11,12,13,14 med varierende metoder15,16,17,18,19. Det er anerkjent at denne tilnærmingen på samme måte har begrensninger, viktigst ved at den ikke tillater undersøkelse av tidlige metastatiske skritt, inkludert intravasasjon ut av den primære svulsten, penetrering gjennom blodhjernebarrieren og etablering i hjernen. Det gjør det imidlertid mulig for forskere å teste (1) hvilke tumoravledede faktorer som medierer vekst i hjernen (f.eks. genetisk manipulering av en onkogen faktor i tumorceller), (2) hvordan endringer i det metastatiske mikromiljøet endrer kreftvekst på dette stedet (f.eks. sammenligning mellom transgene mus med endrede stromale komponenter) og (3) effektivitet av nye terapeutiske strategier på vekst av etablerte lesjoner.
Gitt den potensielle nytten av intrakraniell injeksjonsmodell, er det helt nødvendig å redusere teknisk feil under injeksjon og nøyaktig overvåke tumorvekst over tid. Metoden som er beskrevet her innebærer kontinuerlig nedånding av inhalert gassbedøvelse, og direkte implantasjon av tumorceller i hjernen parenchyma ved hjelp av en stereotaktisk drill og injeksjonsstativ. Administrering av gassbedøvelse gjør det mulig å finjustere dybden og lengden på anestesi, samt sikre en rask og jevn gjenoppretting. Et digitalt kontrollert, automatisert bore- og nåleinjeksjonssystem forbedrer presisjonen på injeksjonsstedet og reduserer tekniske feil som ofte påløper ved boring og frihåndsinjeksjonsmetoder. Bruken av magnetisk resonansavbildning (MR) øker ytterligere presisjonen i overvåking av tumorvekst, tumorvolum, vevsrespons, tumornekrose og respons på behandlingen. MR er bildemodaliteten av valget for bløtvev20,21. Denne bildeteknikken bruker ikke ironerende stråling og foretrekkes fremfor Computertomography (CT), spesielt for flere bildebehandlingsøkter i løpet av en studie. MR har mye større utvalg av tilgjengelig bløtvev kontrast deretter CT eller ultralyd imaging (USG) og presenterer anatomi i større detalj. Det er mer følsomt og spesifikt for abnormiteter i hjernen selv. MR kan utføres i et hvilket som helst bildeplan uten å fysisk flytte motivet som tilfellet er i 2D USG eller 2D optisk bildebehandling. Det er viktig å nevne at skallen ikke demper MR-signalet som i andre bildemodaliteter. MR tillater evaluering av strukturer som kan skjules av gjenstander fra bein i CT eller USG. En ekstra fordel er at det er mange kontrastmidler tilgjengelig for MR, noe som forbedrer lesjonsdeteksjonsgrensen, med relativt lav toksisitet eller bivirkninger. Viktigere, MR tillater overvåking i sanntid i motsetning til histologisk evaluering på tidspunktet for necropsy, som er begrenset i å tyde tumorvolum. Andre bildemodaliteter, som bioluminescerende bildebehandling, er faktisk effektive for tidlig tumordeteksjon og overvåking over tid; Denne metoden krever imidlertid genetisk manipulering (f.eks. luciferase/GFP-merking) av cellelinjer og tillater ikke volumetriske målinger. MR er ytterligere fordelaktig som det speiler pasientovervåking og nedstrøms volumetrisk analyse av MR-bildene er kjent for å være sterkt korrelert med histologiske tumorstørrelse ved necropsy22. Seriell overvåking med MR-screening øker også klinisk overvåking av nevrologiske funksjonsnedsettering, hvis de oppstår.
Samlet sett gjør den presenterte metoden for stereotaktisk intrakraniell tumorinjeksjon etterfulgt av seriell MR oss i stand til å produsere pålitelige, forutsigbare og målbare resultater for å studere mekanismer for hjernemetastase i kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protokoll #2007A0120). Alle gnageroverlevelseskirurgi IACUC-retningslinjer følges, inkludert bruk av sterile teknikker, forsyninger, instrumenter, samt pelsfjerning og steril forberedelse av snittstedet.
1. Intrakraniell injeksjon av brystkreftceller
MERK: Metoden som er beskrevet her benyttet DB7 murine mammary tumor celle linje avledet fra en primær MMTV-PyMT svulst23. Tidligere studier har etablert intrakraniell injeksjon av DB7-celler som en modell av BCBM med histologi som etterligner den menneskelige sykdommen12. Viktigere, immun-kompetente FVB / N mus brukes for denne modellen som DB7 celler ble avledet fra denne musestammen. Da dette er en brystkreftmodell, brukes voksne kvinnelige mus til disse studiene.
- Forbered celler.
- I en steril hette aspirerer medier fra cellekulturplater ved hjelp av standardteknikker.
- Vask celler med 1x DPBS og trypsinize ved hjelp av produsentens protokoll.
- Legg til et passende volum av FBS-inneholdende medier for å stoppe trypsinreaksjonen og bestemme konsentrasjonen av celler ved hjelp av et hemocytometer eller foretrukket metode.
- Pelletceller ved 300 x g i 4 min ved 4 °C.
- Aspirer utskriftsmateriale, vask med 1x DPBS, re-spinn ved 300 x g i 4 min ved 4 °C.
- Resuspend celler i 1x DPBS til en passende konsentrasjon, ca 50.000 celler per injiserbare volum på 2 μL.
MERK: Cellenummer er avhengig av linjens aggressivitet og må bestemmes av utprøveren. Vi bruker rutinemessig 2 μL, men bruk av volumer <6 μL rapporteres15,,16,,17,,18,,19. Lave volumer er avgjørende for å opprettholde presisjon. - Plasser gjenbrukte celler på isen til de injiseres for å opprettholde levedyktigheten.
- Forbered mus for kirurgi.
- For mus med pels: fjern pels fra kraniet, enten ved hårfjerningskrem / lotion eller ved barbering. Gjør dette innen 24-48 timer før operasjonen som utfører dette trinnet for nær kirurgi kan forstyrre hudens kvalitet og sutur styrke.
MERK: Kvinnelige FVB/N-mus som veier ca. 25 g ble brukt på grunn av studien av metastatisk brystkreft, en overveiende kvinnelig sykdom. - Administrer analgeics som bestemt av IACUC og behandlende veterinær: en subkutan injeksjon av Buprenorfin SR-LAB (0,05-0,1 mg/kg dose, Buprenorfin lager: 0,5 mg/ml for en dose på 0,0025-0,088 ml) minst 24 timer før operasjonen for å gi opptil 72 h analgesi, som kan gjentas 48-72 timer etter første dose, om nødvendig. Administrer også NSAIDs (20% ibuprofen i drikkevann, f.eks. 1 mg/5 ml) minst 24-48 timer før operasjonen og fortsett i 2-7 dager etter operasjonen for å gi minst 72 timer postoperativ analgesi.
MERK: Ved Ohio State University administreres Buprenorfin SR-LAB av University Lab Animal Resources Veterinary ansatte som det er et kontrollert stoff.
- For mus med pels: fjern pels fra kraniet, enten ved hårfjerningskrem / lotion eller ved barbering. Gjør dette innen 24-48 timer før operasjonen som utfører dette trinnet for nær kirurgi kan forstyrre hudens kvalitet og sutur styrke.
- Forbered stereotaktiske enheter for kirurgi.
- Slå på alle anestesimaskiner, digitale Vernier-vekter og digitale injektorer.
MERK: Alle kirurgiske verktøy skal rengjøres og steriliseres tilstrekkelig før operasjonen. - Bruk bedøvelsesmaskiner med induksjonskammertilbehør i et biologisk sikkerhetsskap (figur 1A).
- Kontroller at alle rør fra anestesimaskiner er koblet til stereotaktiske rammer (figur 1B, innfelt 1C) og klemmer på rørene er åpne for alle enheter som brukes. Lukk eventuelle klemmer på rør som går til stereotaktiske rammer som ikke vil bli brukt til kirurgi.
- Sett anestesimaskiner til produsenten anbefalt nesekjeglestrømningshastighet basert på musevekten (f.eks. 25 g dyrevekt: nesekjeglestrømningshastighet 34 ml/min).
MERK: Hodeholderen som er inkludert i dette stereotaktiske oppsettet, anbefales kun for voksne mus. Kontroller at produsentens anbefalinger som følger med stereotaktisk oppsett følges. - Kontroller at riktig bedøvelse (f.eks. isofluran) som er ferdigfylt i sprøyten, er festet til anestesimaskinen (figur 1B).
MERK: Over-priming sprøyten kan føre til for mye anestesi som skal leveres til musene under operasjonen og resultere i en bedøvelse overdose. - Forbered borene ved å vri scenelåsen, sette inn en borkronadapter og en 1 mm borkrone i hver drill og låse boret ved å stramme bitlåsen manuelt.
- Fest borene på stereotaktiske rammer (figur 1C).
- Rengjør Hamilton sprøyter med 5 vekslende vasker av 1x DPBS, deretter 70% etanol, deretter igjen i 1x DPBS. Plasser til side til dyret er klargjort til injeksjon.
- Sett digital injektor til å levere med en hastighet på 0,4 μL/min og et mål på 2 μL. Denne hastigheten og volumet tillater langsom innføring av tumorceller i hjernen, noe som reduserer trykk og tilhørende skade.
- Slå på alle anestesimaskiner, digitale Vernier-vekter og digitale injektorer.
- Plasser mus på stereotaktiske rammer.
- Bedøve mus (f.eks. isofluran) ved hjelp av det nevnte induksjonskammeret.
- Oppretthold mus gjennom hele prosedyren på et dypt bedøvelsesplan. % anestesi administrert av maskinen avhenger av en rekke faktorer, inkludert: strømningshastighet, grad av stimulering og kroppstemperatur. Overvåk musene ofte gjennom hele prosedyren for anestesid ved å evaluere for rytmiske respirasjoner (dyret gisper ikke); mangel på palpebral refleks (flagrende øyelokkene når stimulert med en bomullstuppapplikator); og mangel på tåklem (tilbaketrekking av lem på den skadelige stimulansen av å klemme tærne).
MERK: Ulike stammer av mus vil ha en annen respons på anestesi. - Etter at mus er på et passende, dypt bedøvelsesplan, overfør musene til stereotaktisk enhet. Bruk en varmepute mens musen er på stereotaktisk maskin for å opprettholde kroppstemperatur og et passende bedøvelsesplan.
MERK: For å oppnå lav profil bruker vi luftaktiverte håndvarmere plassert i en omvendt pipettespissboks (musehøyende boks i figur 1D). - Åpne musens munn og plasser tennene i munnstangen som ligger på nesestykket på den stereotaktiske rammen (figur 2A). Skyv nesekjeglen over musens nese/munn (figur 2B).
- Plasser mus med hodet på nivå til munnlinjen. Åpne forsiktig munnen med den stumpe enden av en bomullstuppapplikator og skyv på plass. Sørg for at nesekjeglen er helt over musens nese eller anestesi vil ikke bli levert riktig. Nesekjeglen vil ikke engasjere seg i nesen hvis tennene ikke sitter i dette sporet (Inngående figur 2A).
- Bruk en steril bomullspinne til å plassere øyesmøremiddel på hver av musens øyne. Påføring av øyesmøremiddel reduserer tørking av hornhinnen og reduserer sjansen for hornhinneskade og postoperative komplikasjoner relatert til hornhinnen traumer.
- Stabiliser musens hodeskalle ved å trykke venstre ørestang opp mot mediale canthus i venstre øre, låse den på plass ved hjelp av skruen på stereotaktisk ramme. Skyv deretter høyre ørestang mot mediale canthus i høyre øre og skru fast på stereotaktisk ramme (figur 2B).
MERK: Kontroller at musens hode er jevnt og rett når du plasserer ørestengene. Hvis hodet er skjevt eller vinklet, vil injeksjonen være på feil sted i hjernen. Ørestengene skal kun strammes til skallen er immobilisert ved stimulering med moderat manuell sondering.
- Lag et calvarial vindu.
- Forbered og rengjør hodebunnen med 3x vekslende passerer hver av en betadinløsning og 70% etanol. På grunn av nærheten til operasjonsstedet til øynene, bruk betadinløsningen over kirurgisk skrubb.
- Ved hjelp av en steril skalpell, gjør et 3 mm snitt gjennom huden langs det sentrale medianaspektet av kraniet (etter sagittal suturlinjen). Blødning ved snittet bør være minimal. Skulle det oppstå, bruk konsekvent, fast trykk på blødningsstedet med en steril bomullsspissapplikator i > 30 sekunder.
- Identifiser og orienter drillen vinkelrett på bregma (figur 2C), og sørg for å tilbakestille den digitale Vernier-skalaen til null.
- Flytt boret 2 mm lateral til sagittalsuguren og 1 mm fremre til koronal suturen (figur 2C). For reproduserbarhet, sørg for at plasseringen til venstre eller høyre for sagittal suturlinjen forblir konsistent for alle dyr.
- Vri boret på høyeste hastighet. Sørg for at huden flyttes bort fra boret for å unngå vevsskader forårsaket av den roterende biten og start boret forsiktig på skallen. Bor et hull omtrent 0, 5 mm dypt gjennom calvaria, noe som resulterer i calvarial vinduet. Vær forsiktig så du ikke senker boret for langt, ellers vil den bore inn i hjernen. Hvis du slipper steril saltvann på borestedet mens boret er i bevegelse, kan det oppveie all varme som genereres av maskinen som kan forårsake termisk skade på det omkringliggende vevet.
- Når kalkvinduet er laget, hev boret forsiktig og fjern den fra stereotaktisk ramme.
- Rengjør borkronene med 70 % etanol og sett til side hvis de brukes igjen. Hvis ikke, fjern borkroner og senk ned i 70% etanol.
- Injisere kreftceller i hjernen
- Fest den automatiske injektorenheten til det stereotaktiske apparatet (figur 1D).
- Trekk opp > 2 μL celler grundig resuspended i 1x DPBS i en ren Hamilton sprøyte. Pass på å bruke celler umiddelbart før du fyller sprøyten for å redusere klumpdannelse og sikre en homogen celleslam. Det er ideelt å trekke opp 6-8μL cellevolum for å sikre at det ikke er luftlommer / bobler.
- Plasser Hamilton-sprøyten på injektorapparatet, og prime nålen til injeksjon ved å føre en liten mengde volum på en engangssteril drapering for å sikre at injektoren fungerer som den skal. Tørk av sprøyten med 70 % etanol med enbomullsspissapplikator ( figur 1D, innside). Dette fjerner tumorceller fra den ytre fat av nåleakselen redusere risikoen for tumorcelle seeding langs injeksjonskanalen.
- Juster nålespissen til midten av calvarialvinduet, og betent nesten den eksponerte cerebrum.
- Tilbakestill den digitale Vernier-skalaen til null.
- Sett nålen langsomt inn i en dybde på 3 mm inn i hjernen og la nålen forbli i hjernen i minst 60 sekunder før du fortsetter. Denne tidsrammen gjør at hjernen parenchyma å tilpasse seg rundt nålen, noe som reduserer tilbaketrykk og potensiell utvisning av tumorceller langs nålekanalen.
- Velg Kjør på injektorskjermen for å starte levering av celler til injeksjonsstedet. Det vil ta ca 5 min å injisere dette volumet. Den lange tiden for dette trinnet er å redusere sekundær skade forårsaket av injeksjonskraft på hjernen parenchyma.
- Når injeksjonsprotokollen er ferdig, la nålen hvile i hjernen i minst 3 min, igjen slik at hjernen parenchyma å akklimatisere seg til injeksjonen.
- Etter minst 3 min, løft nålen fra hjernen med en hastighet på 0, 75 mm / min. Gjør dette på en ekstremt langsom og konsekvent måte for å redusere ryggtrykk og tumorsporing opp nålekanalen.
- Når nålen har gått ut av hjernen, fjern forsiktig Hamilton sprøyten fra injektoren og rengjør som beskrevet i trinn 1.2.8.
- Påfør varm beinvoks på calvarialvinduet ved hjelp av en steril bomullspinne. Beinvoksen fungerer som en fysisk barriere for å holde svulsten i skallen.
- Lukk snittet (f.eks. 5-0 PDS oppløselige suturer i et enkelt avbrutt mønster ELLER suturklemmer, den som er mest behagelig for kirurgen).
- Stopp administrasjonen av anestesi og fjern musen fra apparatet ved å låse opp og skyve ut ørelinjene, skyve nesekjeglen av musen og løsne tennene fra munnstangen.
- Plasser musen i et rent bur som er på et varmere sett til 37 °C for gjenoppretting. Overvåk mus under utvinning, som vanligvis oppstår 10-15 minutter etter at anestesi er avviklet.
- Etter at musen er gjenopprettet, kan du overvåke for tidlige fjerningskriterier som bestemmes av vertsinstitusjonens IACUC.
2. Magnetisk resonansavbildning
- Administrer Gadolinium-basert kontrastmiddel (100 μL/20 g kroppsvektmus på 0,1 M MultiHance) til mus ved standard intraperitoneal injeksjon24 10-20 minutter før bildebehandling. Bedøv deretter ved hjelp av et induksjonskammer med innåndet bedøvelse (f.eks. isofluran) blandet med 95 % O2 og 5 % CO2 (f.eks. medfølgende luftgass).
- Plasser musen på en oppvarmet holder for å opprettholde kroppstemperaturen. Fest hodet med ørepropper og en bitebar, og plasser holderen i 9,4 T magneten utstyrt med en mushjerneoverflatespole. Opprettholde anestesi under bildebehandling tid, en studie tar vanligvis ca 20 min per mus. Overvåk respirasjonsfrekvens og hjertefrekvens (~70 bpm) gjennom hele prosedyren ved hjelp av en pneumatisk pute og et lite dyreovervåkingssystem.
- Få et localizerbilde, og deretter bilde av musehjernen ved hjelp av en T2-vektet SJELDEN-sekvens (TR = 3500-4228 ms, TE = 12 ms, RARE Factor = 8, FOV = 2,0 x 2,0 cm, matrisestørrelse = 256 x 256, 1 mm eller 0,5 mm skivetykkelse, NA = 2-4, 15-30 sammenhengende skiver) og post Gadolinium-basert kontrast T1-vektet SJELDEN sekvens (TR = 1200 ms, TE = 7,5 ms, SJELDEN faktor = 4 , FOV= 2,0 x 2,0 cm, matrisestørrelse = 256 x 256, 1 mm eller 0,5 mm skivetykkelse, NA = 2-4, 15-30 sammenhengende skiver).
- Etter bildebehandling, plasser musen i et bur på et varmere sett til 37 ° C for utvinning.
3. Målinger av volumetrisk svulst
- Oppnå totalt tumorvolum
- Åpne MR DICOM datafil i ImageJ, en bildebehandling programvare tilgjengelig som en gratis nedlasting gjennom National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
MERK: ImageJ tillater visning av DICOM-filer, som er nødvendig for å utnytte de innebygde pikseldimensjonene for tumorvolumberegninger (se Bilde, Egenskaper der "lengdeenhet" kan stilles inn etter ønske (f.eks. mm)). - Bruk verktøyet Frihåndsvalg til å tegne en oversikt rundt svulsten. Utfør disse valgene i et mørkt rom for å forbedre synligheten. Ikke juster lysstyrken/kontrasten for å opprettholde konsistensen mellom øktene.
- Velg Mål under Analyser-fanen for å få tak i området i det valgte området. Hvis enhet av millimeter ble valgt i trinn 3.1.1., vil området bli gitt i kubikkmillimeter. Hvis du vil, bygger du inn frihåndsvalget ved å merke ctrl+D. Endre utdatafargen ved å gå til Rediger | Alternativer | Farge. Konvertere bildet til et RGB-bilde (Bilde | Type | RGB-farge) før du lagrer som .tif fil.
- Fortsett med å måle alle tumorholdige skiver for en individuell mus og kopiere verdier til et passende dataanalyseprogram (f.eks. Microsoft Excel eller GraphPad Prisme).
- Sum områdene fra hver skive for å få totalt tumorvolum. Pass på å korrigere området basert på skivetykkelse (areal/tykkelse).
- Fullfør trinn 3.1.1.-3.1.5. til alle mus har et totalt tumorvolum. Gitt den noe subjektive karakteren av å skissere svulstene, er det ideelt hvis samme metodikk gjentas flere ganger og i gjennomsnitt for å redusere teknisk feil.
- Hvis du vil angi skaleringslinjer, åpner du DICOM-datafilen og går til Analyser | Verktøy | Skaleringslinjen. Siden dimensjonene allerede er innebygd i DICOM-filen, velger du bare ønsket lengde/bredde. Skjult til et RGB-bilde (Bilde | Type | RGB-farge) før du lagrer som .tif fil.
- Åpne MR DICOM datafil i ImageJ, en bildebehandling programvare tilgjengelig som en gratis nedlasting gjennom National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 oversikter tumorvolum kvantifiseringen for en enkelt mus på to tidspunkter (dag 7 og dag 10) etter injeksjon av murine brysttumorceller. For dette eksperimentet ble 50 000 DB7-celler injisert, og dyrets hjerne ble evaluert av MR. For hver skanning ble 30 skiver (0,5 mm tykkelse) tatt. Evaluering av de 30 skiver per skanning viste at på dag 7 etter injeksjon, 5 skiver utstilt tumor byrde (Figur 3A) og på dag 10 post-injeksjon, 9 skiver utstilt tumor byrde (Figur 3B). Hvert bilde ble evaluert for tumorområdet som beskrevet, og området for hver ramme er avbildet i figur 3C. Det totale tumorvolumet bestemmes og justeres for skivetykkelse. Figur 4 viser representative data i publiseringsformat, inkludert representative bilder (figur 4A) og et histogrammet tumorvolum over tid (figur 4B).
Figur 1: Stereotaktiske og anestesisystemer. (A)Anestesi induksjonskammer oppsett i et biologisk sikkerhetsskap. (B)Stereotaktisk bedøvelse levering oppsett fremhever anestesi rør fra bedøvelse maskinen til nesen kjegle på stereotaktisk apparatet (se inntreden (C)). Grønne piler indikerer levertbedøvelse gassrør, og blå piler indikerer scavenged gassrør. (C) Stereotaktisk stativ med borfeste. Innfelt viser bedøvelsesrør (grønne og blå piler), munnlinje og ørestenger. (D)Stereotaktisk stativ med automatisert sprøytepumpe og musehøyeboks. Boksen er en omvendt pipettespissboks som inneholder håndvarmere som brukes til å heve musen til riktig høyde og opprettholde kroppstemperaturen. Inndata viser retningen på Hamilton-sprøyten i det automatiserte injeksjonsapparatet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilderepresentasjon av tannplasseringen på en stereotaktisk enhet, plassering av ørestenger og calvarial vindu i forhold til Bregma. (A)Bildet av de maksillære fortennene i tannhakket på nesekjeglen. (B) Plasseringen av venstre og høyre ørebarer innenfor mediale canthus av de respektive ørene. (C) En pil indikerer bregma og en rød prikk indikerer plasseringen der kalkalvinduet skal gjøres (2 mm lateral til sagittal sutur og 1 mm fremre til koronal sutur). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på tumorvolum kvantifisering for en enkelt mus over to tidspunkter etter injeksjon. Bilder av skiver som inneholder svulst på (A) dag 7 og (B) dag 10 etter injeksjon. Gul betegner tumorområdet kvantifisert i ImageJ. (C) Skjærareal og total volumetrisk kvantifisering som bestemt i ImageJ (*=korreksjon for skivetykkelse (0,5 mm)). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ tumorvolum kvantifisering i publiseringsformat. (A) Representative bilder med skalalinjer (= 2 mm). (B)Histogrammet som viser tumorvolum (mm3) for de to tidspunktene. Fold endring er notert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utnyttelsen av intrakraniell injeksjon etterfulgt av seriell overvåking med MR gir den unike evnen til å visualisere tumorvekst med tumorvolumnøyaktighet over tid. Anvendelsen av digital bildeanalyse muliggjør tolkning av hjernelesjoner for tumorvolum, blødning, nekrose og respons på behandlingen.
Som med alle prosedyrer, er det viktige trinn som må følges for å lykkes. For det første er forsiktig oppsett av stereotaktiske enheter avgjørende for suksessen til denne teknikken. På grunn av den lille størrelsen på murine kraniet, kan små uoverensstemmelser resultere i dramatisk forskjellige effekter på tumorvekst og ta i eksperimentelle dyr. Som sådan er riktig opplæring på bruk av disse instrumentene nødvendig. For det andre sikrer en varmekilde gjennom hele prosedyren at bedøvelsesplanet ikke faller for lavt. Lave kroppstemperaturer plasserer dyrene i fare for plutselig å dø under anestesi på grunn av redusert stoffskifte og utilsiktet overdose av anestesi og/ eller kan forlenge gjenopprettingstiden. De prefabrikkerte varmeputene kan være store og vanskelige å manøvrere rundt på den stereotaktiske maskinen, men små, luftaktiverte håndvarmere kjøpt gjennom enhver kommersiell leverandør opprettholder temperaturen og er små nok til å plasseres i den omvendte pipettetippboksen som brukes til å heve musene til riktig nivå for det stereotaktiske oppsettet. Til slutt er kvantifisering grei, men ofte bestemme hva som er svulst versus hva som ikke er svulst kan være utfordrende. Det anbefales at etterforskerne rådfører seg med bildebehandlingspersonalet for å sikre nøyaktig vurdering. Det er også nyttig å gjenta tumorvolummålinger flere ganger for å redusere feil. I tillegg bør hver studie analyseres av samme person for alle bilder.
Den presenterte protokollen kan endres avhengig av brukerens preferanser. For det første er bruk av injiserbare anestesi (f.eks. ketamin/xylazin) vanlig og kan sikkert benyttes i stedet for en inhalert anestesi (f.eks. isofluran) avhengig av utprøverpreferanse. Det er imidlertid viktig å vurdere fordelene med en inhalert anestesi: (1) ikke et kontrollert stoff, (2) nivået av anestesi kan justeres over tid (sammenlignet med en forhåndsdose ketamin bestemt av dyrevekt), og (3) utvinning er relativt rask sammenlignet med ketamin / xylazin. For det andre gir bruken av den automatiske drillen et høyt nivå av nøyaktighet, men legger tid til prosedyren gitt tiden som trengs for å sette opp og rive ned enheten. Det er absolutt rimelig å bruke en fri håndteknikk hvis ønskelig.
Denne protokollen benytter både et stereotaktisk oppsett samt bruk av MR, begge er forbundet med økte kostnader. Alternative metoder for intrakraniell injeksjon er beskrevet tidligere15,16,17,18,19. Noen av disse metodene bruker også bruk av bioluminescerende bildebehandling for å overvåke tumorvekst gjennom hele studien hvis ønskelig.
Som nevnt ovenfor er det viktig å bestemme riktig cellenummer for injeksjon avhengig av modellsystemet som studeres. Injeksjon av murine celler i en immunkompetent vert har en tendens til å kreve færre celler enn injeksjon av menneskelige celler i en immunsviktfull vert. Post-injeksjon tumor byrde overvåking av MR bidrar til å avgjøre om antall celler injisert er hensiktsmessig som det er mulig å se når svulster nå et visst volum og på hvilket tidspunkt mus begynner å nå tidlig fjerning kriterier.
Verktøyet og bred anvendelse av MR for ikke-invasiv overvåking har blitt brukt av andre i små dyreforskningsstudier26. Mens MR gir flere fordeler som allerede diskutert, er det faktisk begrensninger verdt å nevne. For det første er bruk av maskinen avhengig av kjerneservicepersonell og maskintilgjengelighet. For det andre kan bruk være kostbart. Hvis dette er bekymringer, er bruk av bioluminescerende bildebehandling et gyldig alternativ for tumorovervåking17,19. For det tredje kan kontrasten mellom svulst og det omkringliggende vevet (det vil si hjerne) variere mellom forskjellige cellelinjer; Denne metodikken gir imidlertid størst sjanse for å identifisere tumor in vivo i fravær av cellemerking. Til slutt er MR begrenset i sin oppløsning, noe som kan forvrenge tumorvolumdata til der det virker som om det er eksponentiell vekst når veksten faktisk er lineær. Det er også et maksimalt tumorvolum som kan oppnås gjennom MR-avbildning, men dette er mindre av en bekymring fordi det er usannsynlig at en mus kan overleve en svulst i den øvre enden. Tumordeteksjonsgrensen avhenger av typen og plasseringen av svulsten i hjernen, om det er blodhjernebarrierelekkasje, og om svulsten er godt omskrevet eller infiltrerer inn i det omkringliggende vevet. Det er også avhengig av om det er en kontrastforsterkende svulst og hvilken type MR-bildeprotokoll som brukes. Etter vår erfaring, med en voxelstørrelse på 78 x 78 μm og en tykkelse på 0,5 mm, kan vi observere en svulst med 0,5 mm diameter rutinemessig med en minimumsgrense rundt 0,3 mm.
Når det gjelder intrakraniell injeksjon, er det flere begrensninger å vurdere. For det første speiler ikke intrakranielle injeksjoner metastatisk kaskade ved at de helt omgår utviklingen av metastatiske egenskaper i den primære svulsten, intravasasjon i blodet og penetrasjon gjennom blodhjernebarrieren11. For det andre, ved å injisere direkte inn i hjernen, induserer denne metoden betennelse, noe som kan forvirre funn forbundet med nevrobetennelse. Til slutt, direkte injeksjon på dette stedet kan resultere i rask vekst over en kort periode. Det er viktig å overvåke mus for nevrologiske symptomer, inkludert baklemlammelse, sløvhet og ataksi.
Alle vurdert, injeksjon direkte inn i hjernen gjør det mulig å overvåke tumor ta hastighet, som kan informere forskeren om vekst spesielt innenfor dette metastatiske området samt interaksjon med hjernen metastatisk mikromiljø. Videre gjør overvåking av tumorbyrde over tid utprøver å direkte sammenligne endrede tumorfenotyper, endrede mikromiljøfenotyper og respons på eksperimentelle terapeutiske strategier. Gitt den relativt lave forekomsten av både spontan og eksperimentell hjernemetastase i musemodeller, er intrakraniell teknikk faktisk et verdifullt verktøy.
Kreftmetastase til hjernen er en katastrofal diagnose med dårlig respons på dagens behandlingsstrategier1,11,27. Mens brystkreft er den dominerende årsaken til hjernemetastase hos kvinner og fokuset her, er lungekreft den vanligste årsaken til hjernemetastase hos alle kreftpasienter2. Videre har hjernemetastaser blitt rapportert hos pasienter diagnostisert med en rekke faste tumortyper, og det forventes at forekomsten vil fortsette å øke etter hvert som behandlingene fortsetter å forbedre seg for å behandle ekstrakranisk sykdom. Dermed, mens fokuset på dette forslaget er på BCBM, gjelder intrakraniell kreftinjeksjon og MR-analyse for å studere hjernemetastaser av andre faste tumortyper samt primære hjernesvulster. Ved hjelp av intrakraniell injeksjonsmodell av hjernemetastase gjør det mulig for forskere å rekafulere sykdom i store kohorter av dyr for å teste en rekke forskningsspørsmål i håp om bedre pasientbehandling. Ved å koble denne modellen med høyoppløselige digitale bilder oppnådd av MR, er det mulig å overvåke tumorvolum på flere tidspunkter, samt tumorrespons på terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Representative data ble finansiert gjennom National Cancer Institute (K22CA218472 til G.M.S.). Intrakranielle injeksjoner utføres i The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Validation Shared Resource (Director - Dr. Reena Shakya) og MR er fullført i The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (Direktør - Dr. Kimerly Powell). Begge delte ressurser finansieres gjennom OSUCCC, OSUCCC Cancer Center Support Grant fra National Cancer Institute (P30 CA016058), partnerskap med The Ohio State University høyskoler og avdelinger, og etablerte tilbakeføringssystemer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M.
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
