Summary
La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.
Abstract
La diffusione metastatica del cancro è una sfortunata conseguenza della progressione della malattia, dei sottotipi di cancro aggressivi e / o della diagnosi tardiva. Le metastasi cerebrali sono particolarmente devastanti, difficili da trattare e conferiscono una prognosi scadente. Mentre l'incidenza precisa delle metastasi cerebrali negli Stati Uniti rimane difficile da stimare, è probabile che aumenti man mano che le terapie extracranici continuano a diventare più efficaci nel trattamento del cancro. Pertanto, è necessario identificare e sviluppare nuovi approcci terapeutici per trattare la metastasi in questo sito. A tal fine, l'iniezione intracranale di cellule tumorali è diventata un metodo ben consolidato in cui modellare la metastasi cerebrale. In precedenza, l'incapacità di misurare direttamente la crescita tumorale è stato un ostacolo tecnico a questo modello; tuttavia, l'aumento della disponibilità e della qualità delle piccole modalità di imaging animale, come la risonanza magnetica (MRI), stanno migliorando notevolmente la capacità di monitorare la crescita del tumore nel tempo e dedurre cambiamenti all'interno del cervello durante il periodo sperimentale. In questo caso, viene dimostrata l'iniezione intracrania di cellule tumorali mammarie murine in topi immunocompetenti seguita da risonanza prima. L'approccio di iniezione presentato utilizza l'anestesia isoflurana e una configurazione stereotassica con un trapano e un'iniezione di ago automatizzati controllati digitalmente per migliorare la precisione e ridurre gli errori tecnici. La risonanza magnetica viene misurata nel tempo utilizzando uno strumento da 9,4 Tesla nella James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource dell'Ohio State University. Le misurazioni del volume tumorale sono dimostrate in ogni momento attraverso l'uso di ImageJ. Nel complesso, questo approccio di iniezione intracranico consente un'iniezione precisa, un monitoraggio giornaliero e misurazioni accurate del volume tumorale, che combinate notevolmente migliorare l'utilità di questo sistema modello per testare nuove ipotesi sui driver delle metastasi cerebrali.
Introduction
Le metastasi cerebrali sono 10 volte più comuni dei tumori del sistema nervoso primario adulto1e sono state riportate in quasi tutti i tipi di tumore solido con cancro ai polmoni, cancro al seno e melanoma che presentano la più alta incidenza2. Indipendentemente dal sito tumorale primario, lo sviluppo della metastasi cerebrale porta a una prognosi scadente spesso associata a declino cognitivo, mal di testa persistente, convulsioni, cambiamenti comportamentali e / o dipersonalità 1,,3,4,5. In termini di cancro al seno, ci sono stati molti progressi nella prevenzione e nel trattamento della malattia. Tuttavia, il 30% delle donne a cui è stato diagnosticato un cancro al seno continuerà a sviluppare metastasi e di quelle con malattia allo stadio IV, circa il 7% (SEER 2010-2013) ha metastasi cerebrale6,7. Le attuali opzioni di trattamento per la metastasi cerebrale comportano resezione chirurgica, radiochirurgia stereotassica e / o radioterapia cerebrale intera. Eppure, anche con questa terapia aggressiva, la sopravvivenza mediana per questi pazienti è di breve 8-11 mesi7,8,9. Queste statistiche cupe sostengono fortemente la necessità di identificare e ae attuazione di nuove ed efficaci strategie terapeutiche. Pertanto, come per tutti i tumori che metastasi al cervello, è essenziale modellare correttamente la metastasi cerebrale associata al cancro al seno (BCBM) in laboratorio per garantire progressi significativi nel campo.
Ad oggi, i ricercatori hanno utilizzato una varietà di metodologie per studiare meccanismi di metastasi al cervello, ognuno con vantaggi elimiti distinti 10,,11. Metodi sperimentali di metastasi come la vena della coda e l'iniezione intracardiaca diffondono cellule tumorali in tutto il corpo e possono causare un immenso carico tumorale in altri siti metastatici a seconda delle cellule iniettate. Questi risultati si confondono se studiano specificamente la metastasi al cervello. Il metodo di iniezione dell'arteria intracarotide è vantaggioso in quanto si rivolge specificamente alla semina cerebrale delle cellule tumorali, ma è limitato in quanto può essere tecnicamente difficile da eseguire. La resezione del tumore primario ortotopico è spesso considerata il modello di metastasi clinicamente più rilevante in quanto riassume l'intera cascata metastatica. Tuttavia, questo approccio prevede periodi di attesa prolungati per la metastasi spontanea con tassi drammaticamente più bassi di metastasi cerebrale rispetto agli altri siti metastatici come il linfonodo, il polmone e il fegato. Spesso, gli animali devono essere rimossi dagli studi a causa del carico tumorale in questi altri siti metastatici prima dello sviluppo della metastasi cerebrale. Altri metodi che coinvolgono linee cellulari tropiche cerebrali sono efficaci nel metastasi al cervello; tuttavia, questi modelli sono limitati in quanto prendono tempo per svilupparsi e spesso perdono il loro tropismo con la propagazione. Date queste limitazioni, i ricercatori hanno regolarmente utilizzato il metodo di iniezione intracranico per modellare la metastasi tumoraleal cervello 11,,12,,13,,14 con metodologie variabili15,,16,,17,,18,,19. È riconosciuto che questo approccio ha allo stesso modo dei limiti, soprattutto in quanto non consente di investigazione dei primi passaggi metastatici tra cui l'intravasazione dal tumore primario, la penetranza attraverso la barriera ematica e la creazione all'interno del cervello. Tuttavia, consente ai ricercatori di testare (1) quali fattori derivati dal tumore mediano la crescita all'interno del cervello (ad esempio, manipolazione genetica di un fattore oncogenico nelle cellule tumorali), (2) come i cambiamenti nel microambiente metastatico alterano la crescita del cancro in questo sito (ad esempio, confronto tra topi transgenici con componenti stromali alterati) e (3) efficacia di nuove strategie terapeutiche sulla crescita di lesioni consolidate.
Data la potenziale utilità del modello di iniezione intracranico, è assolutamente necessario ridurre l'errore tecnico durante l'iniezione e monitorare con precisione la crescita del tumore nel tempo. Il metodo descritto nel presente documento prevede il dosamento continuo dell'anestesia del gas inalato e l'impianto diretto di cellule tumorali nel parenchima cerebrale utilizzando un trapano stereotattico e un supporto di iniezione. La somministrazione dell'anestetico gassoso consente di perfezionare la profondità e la lunghezza dell'anestesia e di garantire un recupero rapido e fluido. Un sistema di iniezione automatizzata di trapani e aghi controllato digitalmente migliora la precisione del sito di iniezione e riduce gli errori tecnici spesso sostenuti dalla perforazione e dai metodi di iniezione a mano libera. L'uso della risonanza magnetica (MRI) aumenta ulteriormente la precisione nel monitoraggio della crescita del tumore, del volume tumorale, della risposta dei tessuti, della necrosi tumorale e della risposta al trattamento. La risonanza magnetica è la modalità di imaging preferita per i tessutimolli 20,,21. Questa tecnica di imaging non utilizza radiazioni ionizzanti ed è preferita rispetto alla tomografia computerizzata (CT), specialmente per più sessioni di imaging durante il corso di uno studio. La risonanza magnetica ha una gamma molto più ampia di contrasto dei tessuti molli disponibili rispetto alla TC o all'imaging ad ultrasuoni (USG) e presenta l'anatomia in modo più dettagliato. È più sensibile e specifico per le anomalie all'interno del cervello stesso. La risonanza magnetica può essere eseguita su qualsiasi piano di imaging senza dover spostare fisicamente il soggetto, come nel caso dell'imaging ottico 2D USG o 2D. È importante ricordare che il cranio non attenua il segnale MRI come in altre modalità di imaging. La risonanza valutazione consente la valutazione di strutture che possono essere oscurate da artefatti di osso in CT o USG. Un ulteriore vantaggio è che ci sono molti agenti di contrasto disponibili per la risonanza prima, che migliora il limite di rilevamento della lesione, con tossicità relativamente bassa o effetti collaterali. È importante sottolineare che la risonanza prima è possibile monitorare in tempo reale a differenza della valutazione istologica al momento della necroscopia, che è limitata nella decifrazione del volume tumorale. Altre modalità di imaging, come l'imaging bioluminescente, sono effettivamente efficaci per il rilevamento e il monitoraggio precoce del tumore nel tempo; tuttavia, questo metodo richiede la manipolazione genetica (ad esempio, l'etichettatura luciferasi/GFP) delle linee cellulari e non consente misurazioni volumetriche. La risonanza istologica è ulteriormente vantaggiosa in quanto rispecchia il monitoraggio del paziente e l'analisi volumetrica a valle delle immagini mr è nota per essere fortemente correlata alla dimensione istologica del tumore allanecroscopia 22. Il monitoraggio seriale con screening mri aumenta anche il monitoraggio clinico delle menomazioni neurologiche, in caso di insorgere.
Nel complesso, il metodo presentato di iniezione di tumore intracranico stereotassico seguito dalla risonanza prima seriale ci consente di produrre risultati affidabili, prevedibili e misurabili per studiare i meccanismi della metastasi cerebrale nel cancro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protocollo #2007A0120). Vengono seguite tutte le politiche della chirurgia di sopravvivenza dei roditori IACUC, incluso l'uso di tecniche sterili, forniture, strumenti, nonché la rimozione della pelliccia e la preparazione sterile del sito di incisione.
1. Iniezione intracranale di cellule tumorali del seno
NOTA: Il metodo descritto nel presente documento ha utilizzato la linea cellulare tumorale mammaria murina DB7 derivata da un tumore MMTV-PyMT primario23. Studi precedenti hanno stabilito l'iniezione intracranale di cellule DB7 come modello di BCBM con istologia che imita quella della malattia umana12. È importante sottolineare che per questo modello vengono utilizzati topi FVB/N immuno-competenti poiché le cellule DB7 sono state derivate da questo ceppo di topo. Poiché questo è un modello di cancro al seno, i topi femmine adulti vengono utilizzati per questi studi.
- Preparare le celle.
- In un cappuccio sterile, aspirare i supporti dalle piastre di coltura cellulare utilizzando tecniche standard.
- Lavare le celle con 1x DPBS e tripinare utilizzando il protocollo del produttore.
- Aggiungere un volume appropriato di mezzi contenenti FBS per interrompere la reazione della tripina e determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro o un metodo preferito.
- Celle a pellet a 300 x g per 4 min a 4 °C.
- Aspirare i supporti, lavare con 1x DPBS, ruotare a 300 x g per 4 min a 4 °C.
- Resuspend cellule in 1x DPBS ad una concentrazione appropriata, circa 50.000 cellule per volume iniettabile di 2 μL.
NOTA: Il numero di cellulare dipende dall'aggressività della linea e deve essere determinato dallo sperimentatore. Usiamo regolarmente 2 μL, ma l'uso di volumi <6 μL è riportato15,,16,17,,18,19. I volumi bassi sono fondamentali per mantenere la precisione. - Posizionare le cellule resuspended sul ghiaccio fino a quando non vengono iniettate per mantenere la vitalità.
- Preparare i topi per l'intervento chirurgico.
- Per topi con pelliccia: rimuovere la pelliccia dal cranio, sia per crema /lozione depilatoria che per rasatura. Fallo entro 24-48 ore prima dell'intervento chirurgico poiché eseguire questo passaggio troppo vicino all'intervento chirurgico può interferire con la qualità della pelle e la forza della sutura.
NOTA: Topi FVB/N femminili del peso di circa 25 g sono stati utilizzati a causa dello studio del cancro al seno metastatico, una malattia prevalentemente femminile. - Somministrare analgesici come determinato dalla IACUC e veterinario curante: iniezione sottocutanea di Buprenorfina SR-LAB (dose di 0,05-0,1 mg/kg, Stock di buprenorfina: 0,5 mg/mL per un dosaggio di 0,0025-0,088 mL) almeno 24 ore prima dell'intervento chirurgico per fornire fino a 72 h di analgesia, che può essere ripetuta 48-72 ore dopo la prima dose, se necessario. Somministrare anche FANS (20% di ibuprofene in acqua potabile, ad esempio, 1 mg /5 mL) almeno 24-48 ore prima dell'intervento chirurgico e continuare per 2-7 giorni dopo l'intervento chirurgico per fornire un'analgesia post-operatoria minima di 72 ore.
NOTA: Presso la Ohio State University, Buprenorphine SR-LAB è amministrata dal personale veterinario dell'University Lab Animal Resources in quanto è una sostanza controllata.
- Per topi con pelliccia: rimuovere la pelliccia dal cranio, sia per crema /lozione depilatoria che per rasatura. Fallo entro 24-48 ore prima dell'intervento chirurgico poiché eseguire questo passaggio troppo vicino all'intervento chirurgico può interferire con la qualità della pelle e la forza della sutura.
- Preparare unità stereotattiche per l'intervento chirurgico.
- Accendi tutte le macchine per anestesia, le bilance Vernier digitali e gli iniettori digitali.
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere adeguatamente puliti e sterilizzati prima dell'intervento chirurgico. - Utilizzare macchine anestetiche con un attacco a camera di induzione in un armadio di sicurezza biologico (Figura 1A).
- Assicurarsi che tutti i tubi delle macchine per anestesia siano collegati ai telai stereotassici (Figura 1B, inserto 1C) e che i morsetti sui tubi siano aperti per tutte le unità utilizzate. Chiudere eventuali morsetti sui tubi che vanno a fotogrammi stereotassici che non verranno utilizzati per l'intervento chirurgico.
- Impostare le macchine per l'anestesia sulla portata consigliata del cono del naso raccomandata in base al peso del mouse (ad esempio, 25 g di peso animale: portata del cono del naso 34 mL / min).
NOTA: Il portacapo incluso in questo set up stereotattico è raccomandato solo per topi adulti. Assicurarsi che le raccomandazioni del produttore incluse nella configurazione stereotassiva siano seguite. - Assicurarsi che l'anestetico appropriato (ad esempio, isoflurane) preriempito nella siringa sia collegato alla macchina per anestesia(Figura 1B).
NOTA: L'troppo adescamento della siringa può causare la consegna di troppa anestesia ai topi durante l'intervento chirurgico e causare un sovradosaggio anestetico. - Preparare i trapani ruotando il blocco del palco, inserendo un adattatore per punte bit e una punta di perforazione da 1 mm in ogni trapano e bloccare il trapano stringendo manualmente il blocco del bit.
- Collegare trapani ai telai stereotassici (Figura 1C).
- Pulire le siringhe Hamilton con 5 lavaggi alternati di 1x DPBS, quindi il 70% di etanolo, quindi ancora una volta in 1x DPBS. Mettere da parte fino a quando l'animale non è precondizione per l'iniezione.
- Impostare l'iniettore digitale per la consegna ad una velocità di 0,4 μL/min e un obiettivo di 2 μL. Questo tasso e volume consentono una lenta introduzione delle cellule tumorali nel cervello, che riduce la pressione e i danni associati.
- Accendi tutte le macchine per anestesia, le bilance Vernier digitali e gli iniettori digitali.
- Posizionare i topi su fotogrammi stereotassici.
- Anestetizzare i topi (ad esempio, isoflurane) usando la suddetta camera di induzione.
- Mantenere i topi durante tutta la procedura su un piano anestetico profondo. L'anestesia % somministrata dalla macchina dipende da una serie di fattori tra cui: portata, grado di stimolazione e temperatura corporea. Monitorare frequentemente i topi durante tutta la procedura per la profondità dell'anestesia valutando le respirazioni ritmiche (l'animale non sta ansimando); mancanza di riflesso palpebrale (svolazzante delle palpebre quando stimolato con un applicatore a punta di cotone); e mancanza di dito del piedi (ritiro dell'arto sul noxious stimolo di pizzicare le dita dei piedi).
NOTA: Diversi ceppi di topi avranno una risposta diversa all'anestesia. - Dopo che i topi sono su un piano anestetico appropriato e profondo, trasferire i topi all'unità stereotassica. Utilizzare un tappetino riscaldante mentre il mouse si trova sulla macchina stereotassica per mantenere la temperatura corporea e un piano anestetico appropriato.
NOTA: Per ottenere un profilo basso utilizziamo scaldamani attivati dall'aria posizionati all'interno di una scatola di punta della pipetta rovesciata (scatola di elevamento del mouse nella figura 1D). - Aprire la bocca del mouse e posizionare i denti nel trogolo della barra della bocca situato sul nasello sul telaio stereotattico (Figura 2A). Far scorrere il cono del naso sul naso/bocca del topo (Figura 2B).
- Posizionare i topi con la testa livellata sulla barra della bocca. Aprire delicatamente la bocca con l'estremità smussata di un applicatore a punta di cotone e scivolare in posizione. Assicurarsi che il cono del naso sia completamente sopra il naso del mouse o che l'anestesia non venga consegnata correttamente. Il cono del naso non si innesta con il naso se i denti non sono seduti all'interno di questa scanalatura (Figura insorgenza 2A).
- Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, posizionare il lubrificante per gli occhi su ciascuno degli occhi del mouse. L'applicazione del lubrificante per gli occhi mitiga l'essiccazione della cornea e riduce la possibilità di danni corneali e complicanze postoperatorie legate al trauma corneale.
- Stabilizzare il cranio del mouse deprimendo la barra dell'orecchio sinistra contro il canthus mediale dell'orecchio sinistro, bloccandolo in posizione usando la vite sul telaio stereotattico. Quindi far scorrere la barra dell'orecchio destra contro il canthus mediale dell'orecchio destro e avvitare stretto sul telaio stereotattico (Figura 2B).
NOTA: Assicurarsi che la testa del mouse sia livellata e dritta quando si posizionano le barre dell'orecchio. Se la testa è storta o angolata, l'iniezione sarà nel posto errato nel cervello. Le barre dell'orecchio devono essere serrate SOLO fino a quando il cranio non viene immobilizzato dopo la stimolazione con un moderato sondaggio manuale.
- Crea una finestra calvariale.
- Preparare e pulire il cuoio capelluto con 3 passaggi alternati ciascuno di una soluzione di betadina e 70% di etanolo. A causa della vicinanza del sito chirurgico agli occhi, utilizzare la soluzione di betadina sopra lo scrub chirurgico.
- Utilizzando un bisturi sterile, fare un'incisione di 3 mm attraverso la pelle lungo l'aspetto mediano centrale del cranio (seguendo la linea di sutura sagittale). Sanguinare all'incisione dovrebbe essere minimo. In caso di incidente, applicare una pressione costante e ferma nel sito di sanguinamento con un applicatore sterile della punta di cotone per >30 secondi.
- Identificare e orientare il trapano perpendicolarmente al bregma (Figura 2C), assicurandosi di azzerare la scala Vernier digitale.
- Spostare il trapano 2 mm laterale nella sutura sagittale e 1 mm anteriore alla sutura coronale (Figura 2C). Per la riproducibilità, assicurarsi che la posizione a sinistra o a destra della linea di sutura sagittale rimanga coerente per tutti gli animali.
- Ruotare il trapano alla massima velocità. Assicurarsi che la pelle sia allontanata dal trapano per evitare danni ai tessuti causati dalla punta rotante e avviare attentamente il trapano sul cranio. Praticare un foro profondo circa 0,5 mm attraverso la calvaria, con conseguente finestra calvariale. Fai attenzione a non abbassare troppo il trapano o perforerà il cervello. Far cadere la salina sterile nel sito di perforazione mentre il trapano è in movimento può compensare qualsiasi calore generato dalla macchina che può causare danni termici al tessuto circostante.
- Una volta realizzata la finestra calvariale, sollevare attentamente il trapano e rimuoverlo dal telaio stereotattico.
- Pulire le punte utilizzando il 70% di etanolo e mettere da parte se utilizzate di nuovo. In caso meno, rimuovere le punte di perforazione e immergere nel 70% di etanolo.
- Iniettare cellule tumorali nel cervello
- Collegare l'unità di iniettore automatico all'apparato stereotattico (Figura 1D).
- Tirare su >2 μL di cellule completamente rimostrate in 1x DPBS in una siringa Hamilton pulita. Assicurarsi di rimospendare le cellule immediatamente prima di riempire la siringa per ridurre la formazione di ciuffi e garantire un liquame cellulare omogeneo. È ideale per estrarre 6-8μL di volume cellulare per garantire che non ci siano sacche d'aria / bolle.
- Posizionare la siringa Hamilton sull'apparato iniettore e innescare l'ago per l'iniezione erogando una piccola quantità di volume su un drappo sterile monouso per assicurarsi che l'iniettore funzioni correttamente. Pulire la siringa con il 70% di etanolo con un applicatore a punta di cotone(Figura 1D, inserto). Ciò rimuove le cellule tumorali dal barile esterno dell'albero dell'ago riducendo il rischio di semina delle cellule tumorali lungo il tratto di iniezione.
- Allineare la punta dell'ago al centro della finestra calvariale, quasi toccando il cerebro esposto.
- Reimposta la scala Vernier digitale su zero.
- Inserire lentamente l'ago a una profondità di 3 mm nel cervello e lasciare che l'ago rimanga nel cervello per almeno 60 secondi prima di procedere. Questo lasso di tempo consente al parenchima cerebrale di conformarsi intorno all'ago, il che riduce la contro pressione e la potenziale espulsione delle cellule tumorali lungo il tratto dell'ago.
- Selezionare Esegui nella schermata dell'iniettore per iniziare la consegna delle celle al sito di iniezione. Ci vogliono circa 5 minuti per iniettare questo volume. Il tempo prolungato per questo passaggio è quello di ridurre i danni secondari causati dalla forza di iniezione sul parenchima cerebrale.
- Una volta terminato il protocollo di iniezione, lasciare riposare l'ago nel cervello per almeno 3 minuti, consentendo nuovamente al parenchima cerebrale di acclimatarsi all'iniezione.
- Dopo almeno 3 minuti, sollevare l'ago dal cervello ad una velocità di 0,75 mm / min. Fallo in modo estremamente lento e coerente per ridurre la contro pressione e il tumore che traccia il tratto dell'ago.
- Una volta che l'ago è uscito dal cervello, rimuovere con cura la siringa Hamilton dall'iniettore e pulire come descritto al passaggio 1.2.8.
- Applicare la cera ossea calda sulla finestra calvariale utilizzando un batuffolo di cotone sterile. La cera ossea funge da barriera fisica per mantenere il tumore all'interno del cranio.
- Chiudere l'incisione (ad esempio, suture dissolubili 5-0 PDS in un semplice motivo interrotto O clip di sutura, a seconda di quale sia più comodo per il chirurgo).
- Interrompere la somministrazione di anestesia e rimuovere il mouse dall'apparecchio sbloccando e scivolando fuori dalle barre dell'orecchio, facendo scorrere il cono del naso dal mouse e sganciando i denti dalla barra della bocca.
- Posizionare il mouse in una gabbia pulita che si trova su un set più caldo a 37 °C per il recupero. Monitorare i topi durante il recupero, che in genere si verifica 10-15 minuti dopo che l'anestesia è stata interrotta.
- Dopo il recupero del mouse, monitorare i criteri di rimozione anticipata determinati dall'IACUC dell'istituto ospitante.
2. Risonanza magnetica
- Somministrare l'agente di contrasto a base di gadolinio (topo di peso corporeo 100 μL/20 g di 0,1 M multihance) ai topi mediante iniezione intraperitoneale standard24 10-20 minuti prima dell'imaging. Quindi anestetizzare utilizzando una camera di induzione con un anestetico inalato (ad esempio, isoflurane) miscelato con il 95% O2 e il 5% di CO2 (cioè gas aria ambiente in dotazione).
- Posizionare il mouse su un supporto riscaldato per mantenere la temperatura corporea. Fissare la testa con le sporgenze dell'orecchio e una barra mordente e posizionare il supporto nel magnete da 9,4 T dotato di una bobina di superficie cerebrale del mouse. Mantenere l'anestesia durante il tempo di imaging, uno studio richiede in genere circa 20 minuti per mouse. Monitora la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca (~ 70 bpm) durante tutta la procedura utilizzando un cuscino pneumatico e un piccolo sistema di monitoraggio degli animali.
- Ottenere un'immagine localizzatore, quindi immagini il cervello del mouse usando una sequenza RARE ponderata T2 (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, dimensione matrice = 256 x 256, 1 mm o 0,5 mm spessore fetta, NA=2-4, 15-30 fette contigue) e contrasto post gadolinium Sequenza RARA ponderata T1 (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, RARE Factor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, dimensione matrice = 256 x 256, 1 mm o 0,5 mm di spessore della fetta, NA=2-4, 15-30 fette contigue).
- Dopo l'imaging, posizionare il mouse in una gabbia su uno scaldante impostato su 37 °C per il recupero.
3. Misurazioni del tumore volumetrico
- Ottenere il volume totale del tumore
- Aprire il file di dati MRI DICOM in ImageJ, un software di elaborazione delle immagini disponibile come download gratuito tramite il National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
NOTA: ImageJ consente la visualizzazione di file DICOM, che è necessario per utilizzare le dimensioni dei pixel incorporate per i calcoli del volume tumorale (vedi Immagine, Proprietà in cui "unità di lunghezza" può essere impostata come desiderato (ad esempio, mm)). - Utilizzare lo strumento Selezioni a mano libera per disegnare un contorno attorno al tumore. Esegui queste selezioni in una stanza buia per migliorare la visibilità. Non regolare la luminosità/contrasto per mantenere la coerenza tra le sessioni.
- Nella scheda Analizza selezionare Misura per ottenere l'area dell'area selezionata. Se l'unità di millimetri è stata scelta nel passaggio 3.1.1., l'area verrà data in millimetri cubi. Se lo si desidera, incorporare la selezione a mano libera selezionando CTRL+D. Modificare il colore di output andando a Modifica | Opzioni | Colore. Convertire l'immagine in un'immagine RGB (Image | Proprietà Type | Colore RGB) prima di salvare come file .tif file.
- Procedere con la misurazione di tutte le fette contenenti tumore per un singolo mouse e copiare i valori in un programma software di analisi dei dati appropriato (ad esempio, Microsoft Excel o GraphPad Prism).
- Sommare le aree da ogni fetta per ottenere il volume totale del tumore. Assicurarsi di correggere l'area in base allo spessore della fetta (area/spessore).
- Completare i passaggi 3.1.1.-3.1.5. fino a quando tutti i topi non hanno un volume tumorale totale. Data la natura un po 'soggettiva di delineare i tumori, è ideale se la stessa metodologia viene ripetuta più volte e mediata per ridurre l'errore tecnico.
- Per impostare le barre di scala, aprire il file di dati DICOM e passare ad Analyze | Strumenti | Barra di scala. Poiché le quote sono già incorporate nel file DICOM, basta scegliere la lunghezza/larghezza desiderata. Sotto copertura di un'immagine RGB (Image | Proprietà Type | Colore RGB) prima di salvare come file .tif file.
- Aprire il file di dati MRI DICOM in ImageJ, un software di elaborazione delle immagini disponibile come download gratuito tramite il National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 3 mostra la quantificazione del volume tumorale per un singolo topo in due punti di tempo (giorno 7 e giorno 10) dopo l'iniezione di cellule tumorali mammarie murine. Per questo esperimento, sono state iniettate 50.000 cellule DB7, e il cervello dell'animale è stato valutato dalla risonanza prima. Per ogni scansione sono state catturate 30 fette (spessore 0,5 mm). La valutazione delle 30 fette per scansione ha rivelato che al giorno 7 dopo l'iniezione, 5 fette mostravano un carico tumorale (Figura 3A) e al giorno 10 dopo l'iniezione, 9 fette mostravano un carico tumorale (Figura 3B). Ogni immagine è stata valutata per l'area tumorale come descritto e l'area per ogni fotogramma è raffigurata nella Figura 3C. Il volume totale del tumore viene determinato e regolato per lo spessore della fetta. La figura 4 illustra i dati rappresentativi in formato pubblicazione, comprese le immagini rappresentative (Figura 4A) e un istogramma del volume tumorale nel tempo (Figura 4B).
Figura 1: Sistemi stereotassici e di anestesia. ( A )Installazionedella camera di induzione dell'anestesia all'interno di un armadio biologico di sicurezza. (B) Impostazione di erogazione anestetica stereotassica che evidenzia i tubi di anestesia dalla macchina anestetica al cono del naso sull'apparato stereotattico (vedi inserto in (C)). Le frecce verdi indicano i tubi del gas anestetici consegnati e le frecce blu indicano tubi di gas scavengati. (C) Supporto stereotattico con attacco di perforazione. L'interno mostra tubi anestetici (frecce verdi e blu), barra della bocca e auricolari. (D) Supporto stereotattico con pompa automatica per siringhe e scatola di elevamento del mouse. La scatola è una scatola di punta della pipetta rovesciata contenente scaldamani utilizzati per elevare il mouse all'altezza appropriata e mantenere la temperatura corporea. Inset mostra l'orientamento della siringa Hamilton nell'apparato di iniezione automatizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione pittorica del posizionamento del dente su un dispositivo stereotattico, posizione delle barre dell'orecchio e finestra calvariale rispetto a Bregma. (A) Il pittorico degli incisivi mascellari nella tacca del dente sul cono del naso. (B) La posizione delle barre dell'orecchio sinistro e destro all'interno del canthus mediale delle rispettive orecchie. (C) Una freccia indica il bregma e un punto rosso indica il luogo in cui deve essere realizzata la finestra calvariale (2 mm lateralmente alla sutura sagittale e 1 mm anteriore alla sutura coronale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di quantificazione del volume tumorale per un singolo topo su due punti di tempo dopo l'iniezione. Immagini delle fette contenenti tumore al (A) giorno 7 e (B) giorno 10 dopo iniezione. Il giallo indica l'area tumorale quantificata in ImageJ. (C) Superficie della fetta e quantificazione volumetrica totale determinata in ImageJ (*=correzione per lo spessore della fetta (0,5 mm)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione rappresentativa del volume tumorale in formato pubblicazione. (A) Immagini rappresentative con barre di scala (=2 mm). (B) Istogramma raffigurante il volume tumorale (mm3)per i due punti di tempo. Si nota un cambiamento di piegatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'utilizzo dell'iniezione intracranici seguita dal monitoraggio seriale con risonanza prima è la capacità unica di visualizzare la crescita del tumore con precisione del volume tumorale nel tempo. L'applicazione dell'analisi digitale dell'imaging consente l'interpretazione delle lesioni cerebrali per volume tumorale, emorragia, necrosi e risposta al trattamento.
Come per qualsiasi procedura, ci sono passaggi chiave che devono essere seguiti per il successo. In primo luogo, un'attenta configurazione dei dispositivi stereotassici è imperativa per il successo di questa tecnica. A causa delle piccole dimensioni del cranio murino, lievi incongruenze possono causare effetti drammaticamente diversi sul tasso di crescita del tumore e assumere animali da esperimento. In quanto tale, è necessaria una formazione adeguata sull'uso di questi strumenti. In secondo luogo, una fonte di riscaldamento durante tutta la procedura garantisce che il piano anestetico non slissi troppo basso. Le basse temperature corporee vengono a rischio di morire improvvisamente in anestesia a causa della diminuzione del metabolismo dei farmaci e del sovradosaggio involontario di anestesia e / o possono prolungare i tempi di recupero. Le pastiglie di riscaldamento prefabbricate possono essere ingombranti e difficili da manovrare sulla macchina stereotassica, ma piccoli scaldamani attivati dall'aria acquistati tramite qualsiasi fornitore commerciale mantengono la temperatura e sono abbastanza piccoli da essere posizionati all'interno della scatola di punta della pipetta rovesciata utilizzata per elevare i topi al livello appropriato per la configurazione stereotassica. Infine, la quantificazione è semplice, ma spesso determinare cos'è il tumore rispetto a ciò che non è tumore può essere impegnativo. Si raccomanda agli investigatori di consultarsi con il personale addetto alle immagini per garantire una valutazione accurata. È anche utile ripetere più volte le misurazioni del volume tumorale per ridurre l'errore. Inoltre, ogni studio dovrebbe essere analizzato dalla stessa persona per tutte le immagini.
Il protocollo presentato può essere modificato in base alle preferenze dell'utente. In primo luogo, l'uso dell'anestesia iniettabile (ad esempio, ketamina/xiazina) è comune e può certamente essere utilizzato al posto di un'anestesia inalato (ad esempio, isoflurane) a seconda delle preferenze del ricercatore. Tuttavia, è importante considerare i vantaggi di un'anestesia inalato: (1) non una sostanza controllata, (2) il livello di anestesia può essere regolato nel tempo (rispetto a una dose iniziale di ketamina determinata dal peso animale) e (3) il recupero è relativamente rapido rispetto alla chetamina / xiazina. In secondo luogo, l'uso del trapano automatico fornisce un alto livello di precisione, ma aggiunge tempo alla procedura dato il tempo necessario per impostare e abbattere l'unità. È certamente ragionevole utilizzare una tecnica di consegna libera, se lo si desidera.
Questo protocollo utilizza sia una configurazione stereotattica che l'uso della risonanza totale, entrambi sono associati a un aumento dei costi. Metodi alternativi per l'iniezione intracraniciale sono stati descrittiin precedenza 15,16,17,18,19. Alcuni di questi metodi utilizzano anche l'uso di imaging bioluminescente per monitorare la crescita tumorale durante lo studio, se lo si preferisce.
Come accennato in precedenza, è importante determinare il numero di cellulare corretto per l'iniezione a seconda del sistema di modelli in esame. L'iniezione di cellule murine in un ospite immunocompetente tende a richiedere meno cellule dell'iniezione di cellule umane in un ospite immunodifeso. Il monitoraggio del carico tumorale post-iniezione da parte della risonanza prima dell'iniezione aiuta a determinare se il numero di cellule iniettate è appropriato in quanto è possibile vedere quando i tumori raggiungono un certo volume e a che punto i topi iniziano a raggiungere i criteri di rimozione precoce.
L'utilità e l'ampia applicazione della RISONANZA per il monitoraggio non invasivo sono state utilizzate da altri in piccoli studi di ricerca suglianimali 26. Mentre la MENTO offre diversi vantaggi, come già discusso, ci sono effettivamente limitazioni denota. In primo luogo, l'uso della macchina dipende dal personale di assistenza principale e dalla disponibilità della macchina. In secondo luogo, l'uso può essere costoso. Se si tratta di preoccupazioni, l'uso dell'imaging bioluminescente è una valida alternativa per il monitoraggiodel tumore 17,,19. In terzo luogo, il contrasto tra il tumore e il tessuto circostante (cioè il cervello) può variare tra le diverse linee cellulari; tuttavia, questa metodologia offre le maggiori possibilità di identificare il tumore in vivo in assenza di etichettatura cellulare. Infine, la risonanza prima è limitata nella sua risoluzione, che può distorcere i dati del volume tumorale dove sembra che ci sia una crescita esponenziale quando in realtà la crescita è lineare. C'è anche un volume massimo di tumore che può essere ottenuto attraverso l'imaging MR, ma questo è meno preoccupante perché è improbabile che un topo possa sopravvivere a un tumore all'estremità superiore. Il limite di rilevamento del tumore dipende dal tipo e dalla posizione del tumore nel cervello, se c'è una perdita di barriera eencefalica e se il tumore è ben circoscritto o si sta infiltrando nel tessuto circostante. Dipende anche dal fatto che si tratti di un tumore che migliora il contrasto e dal tipo di protocollo di imaging MR utilizzato. Nella nostra esperienza, con una dimensione voxel in piano di 78x78 μm e uno spessore della fetta di 0,5 mm, possiamo osservare regolarmente un tumore di 0,5 mm di diametro con un limite minimo di circa 0,3 mm.
Per quanto riguarda l'iniezione intracraniciale, ci sono diverse limitazioni da considerare. In primo luogo, le iniezioni intracranici non rispecchiano la cascata metastatica in quanto ignorano completamente lo sviluppo di proprietà metastatiche all'interno del tumore primario, l'intravasazione nel flusso sanguigno e la penetrazione attraverso la barrieraepatica 11. In secondo luogo, iniettando direttamente nel cervello questo metodo induce infiammazione, che può confondere i risultati associati alla neuroinfiammazione. Infine, l'iniezione diretta in questo sito può comportare una rapida crescita in un breve periodo di tempo. È fondamentale monitorare i topi per i sintomi neurologici tra cui paralisi degli arti posteriori, letargia e asassia.
Tutto considerato, l'iniezione direttamente nel cervello consente il monitoraggio del tasso di presa del tumore, che può informare il ricercatore sulla crescita specificamente all'interno di questo sito metastatico e sull'interazione con il microambiente metastatico cerebrale. Inoltre, il monitoraggio del carico tumorale nel tempo consente allo sperimentatore di confrontare direttamente fenotipi tumorali alterati, fenotipi di microambiente alterati e risposta a strategie terapeutiche sperimentali. Data l'incidenza relativamente bassa della metastasi cerebrale sia spontanea che sperimentale nei modelli di topo, la tecnica intracraniciale è davvero uno strumento prezioso.
La metastasi del cancro al cervello è una diagnosi catastrofica con scarsa risposta alle attuali strategiedi trattamento 1,11,27. Mentre il cancro al seno è la causa predominante della metastasi cerebrale nelle donne e l'attenzione qui, il cancro ai polmoni è la causa più comune di metastasi cerebrale in tutti i pazientioncologici 2. Inoltre, le metastasi cerebrali sono state riportate in pazienti a cui è stata diagnosticata una serie di tipi di tumore solido e si prevede che l'incidenza continuerà ad aumentare man mano che le terapie continuano a migliorare per trattare le malattie extracranici. Pertanto, mentre l'attenzione di questa proposta è rivolta al BCBM, l'iniezione intracranale di cancro e l'analisi della risonanza primari sono applicabili allo studio delle metastasi cerebrali di altri tipi di tumore solido e dei tumori cerebrali primari. L'utilizzo del modello di iniezione intracranico della metastasi cerebrale consente ai ricercatori di ricapitolare la malattia in grandi coorti di animali per testare una varietà di domande di ricerca nella speranza di una migliore cura del paziente. Accoppiando questo modello con immagini digitali ad alta risoluzione ottenute dalla risonanza prima, è possibile monitorare il volume tumorale in più punti di tempo e la risposta tumorale alla terapia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno alcuna divulgazione.
Acknowledgments
I dati rappresentativi sono stati finanziati attraverso il National Cancer Institute (da K22CA218472 a G.M.S.). Le iniezioni intracranici vengono eseguite in The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Validation Shared Resource (Director – Dr. Reena Shakya) e la risonanza magnetica è completata nell'Ohio State University Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (Director – Dr. Kimerly Powell). Entrambe le risorse condivise sono finanziate attraverso l'OSUCCC, l'OSUCCC Cancer Center Support Grant del National Cancer Institute (P30 CA016058), partnership con college e dipartimenti dell'Ohio State University e sistemi di chargeback consolidati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M.
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
