Method Article

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

DOI:

10.3791/61496

⸱

June 2nd, 2020

 ,  , 
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traumatische Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) verfügen derzeit nicht über geeignete Behandlungen, um die volle funktionelle Genesung wiederzuerlangen. Schwann-Zellen (SCs), als die wichtigsten Gliazellen des PNS, spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung der PNS-Regeneration, indem sie sich nach einer Verletzung zu einem regenerativen Zellphänotyp verleiten. Der dedifferenzierte Zustand von SCs ist jedoch eine Herausforderung für die Regeneration sanierbare Zeit und wird durch Veränderungen in der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) beeinflusst. Daher ist es von wesentlicher Bedeutung, das komplexe Zusammenspiel zwischen SCs und unterschiedlichem ECM zu bestimmen, um Hinweise auf das regenerative Potenzial von SCs zu liefern. Um diesem Problem zu begegnen, wurde eine Strategie entwickelt, bei der verschiedene ECM-Proteine auf ein abstimmbares Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat adsorbiert wurden, das eine Plattform bot, auf der Steifigkeit und Proteinzusammensetzung moduliert werden können. SCs wurden auf die abstimmbaren Substrate gesät und kritische zelluläre Funktionen, die die Dynamik des SC-Phänotyps darstellen, wurden gemessen. Zur Veranschaulichung des Zusammenspiels zwischen SC-Proteinexpression und zellulärer Morphologie wurden neben individuellen mikrokontaktbedruckten Zellmustern auch unterschiedliche Sädichten von SCs verwendet und durch Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot gekennzeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen mit einer kleineren Verbreitungsfläche und einem höheren Ausmaß der zellulären Dehnung höhere Konzentrationen von SC-regenerativen phänotypischen Markern förderten. Diese Methode beginnt nicht nur, die signifikante Beziehung zwischen dem ECM und der zellulären Funktion von SCs zu entwirren, sondern liefert auch Richtlinien für die zukünftige Optimierung von Biomaterialien in der peripheren Nervenreparatur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) stellen nach wie vor eine große klinische Herausforderung im Gesundheitswesen dar, da sie die Lebensqualität der Patienten gefährden und durch eine Vielzahl sozioökonomischer Faktoren eine signifikante Wirkung erzielen1,2. Schwann-Zellen (SC), als die wichtigsten Gliazellen im PNS, bieten notwendige molekulare und physikalische Hinweise, um die PNS-Regeneration zu induzieren und bei funktionellen Erholungen bei Kurzspaltverletzungen zu helfen. Dies ist auf die bemerkenswerte Fähigkeit von SCs zurückzuführen, sich in einen "Reparatur"-Zellphänotyp von einem myelinisierenden oder Remak-Phänotyp3zu unterscheiden. Die Reparatur SC ist ein unverwechselbarer Zellphänotyp in mehrfacher Hinsicht. Nach der Verletzung erhöhen SCs ihre Proliferationsrate, indem sie wieder in den Zellzyklus eintreten und mit der Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren beginnen, um die Reinnervation zu erleichtern. Diese Faktoren, wie c-Jun und p75 NTR, sind hochreguliert, während myelinierende SC-Marker, wie Myelin-Basisprotein (MBP), nach unten reguliert werden4,5. Darüber hinaus ändern SCs die Morphologie, um sich zu verlängen und aufeinander auszurichten, um Büngner-Bänder über die Verletzungsstelle6zu bilden. Dies bietet einen physikalischen Leitmechanismus für die Axone, um sich auf das richtige distale Ziel7auszudehnen. Trotz der Fähigkeit, die SCs besitzen, um die Nervenregeneration bei Kurzstreckenverletzungen zu fördern, bleibt das Ergebnis der funktionellen Erholung bei schweren Verletzungen schlecht. Dies ist zum Teil auf den Verlust von extrazellulären Matrix (ECM) Leitfäden zurückzuführen, sowie die Unfähigkeit von SCs, den regenerativen Phänotyp über lange Zeiträume zu erhalten8.

Der Nervenregenerations- und Erholungsprozess ist eng mit dem Zustand der Basallamina nach verletzungen verbunden. Die Basallamina ist eine Schicht eCM um den Nerv, die die Führung erleichtert und ECM-gebundene Hinweise für Axone und SCs in Fällen liefert, in denen sie nach Verletzung intakt bleibt9. Der Zustand des ECM und seine Fähigkeit, Matrix gebundene Hinweise an Zellen zu liefern, ist von entscheidender Bedeutung und wurde zuvor in einer Vielzahl von verschiedenen Kontexten10,11,12,13,14untersucht. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Steifigkeit des ECM Zellfunktionen wie Proliferation und Differenzierung11,15,16steuern kann. Die Zusammensetzung des ECM kann auch zu einer deutlichen zellulären Reaktion führen und Zellverhalten wie Migration und Differenzierung durch intrazelluläre Signalwege17,18regulieren. Darüber hinaus spielt die Zellmorphologie, einschließlich Verbreitungsgebiet und zellulärer Dehnung, eine wichtige Rolle bei der Regelung der Funktion und kann durch ECM-gebundene Hinweise19,20geregelt werden. Viele frühere Studien haben sich auf Stammzellen konzentriert, die sich in definierte Abstammungslinien differenzieren, aber SCs besitzen eine ähnliche Fähigkeit, Phänotyp von einem homöostatischen, erwachsenen SC innerhalb eines gesunden Nervs zu einem Reparatur-SC zu verändern, der in der Lage ist, Proteine und Wachstumsfaktoren zu sezernieren, während das ECM nach einer Nervenverletzung5,21umgestaltet wird. Daher ist es besonders wichtig, Mechanismen zu identifizieren, die der Beziehung zwischen der angeborenen SC-Regenerationsfähigkeit und eCM gebundenen Hinweisen für die Einsicht zugrunde liegen, um diese Fähigkeit zur Nervenregeneration letztendlich zu nutzen.

Um diesem Problem zu begegnen, haben wir eine detaillierte Methodik entwickelt, um ein Zellkultursubstrat zu produzieren, bei dem mechanische Steifigkeit und Ligandentyp leicht in physiologisch relevanten Bereichen abgestimmt werden können. Polydimethylsiloxan (PDMS) wurde aufgrund seiner hochgradig einstellbaren Mechanik im Vergleich zu Polyacrylamid-Gel als Substrat gewählt, wobei der maximale Young-Modul etwa 12 kPa beträgt, der mit PDMS bei etwa 1000 kPa22,23,24kontrastiert wird. Dies ist von Vorteil für die vorstehende Arbeit, da neuere Studien gezeigt haben, dass der Young-Modul eines Kaninchen-Ischiasnervs während der Entwicklung 50 kPa überschreiten kann, was darauf hindeutet, dass der Steifigkeitsbereich der Nerven innerhalb des PNS größer ist als bisher untersucht. Verschiedene Proteine sind in der Lage, auf PDMS-Substrate natobieren, um die kombinatorische Regulierung von Mechanik und Liganden auf SC-Verhalten zu analysieren. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer mikroökologischer Hinweise im PNS-Regenerationsprozess und den Vergleich eines hohen Grades an Tunabilität mit der Arbeit, die sich ausschließlich auf die Steifigkeit des Substrats25konzentriert. Darüber hinaus sind diese technisch entwickelten Zellkultursubstrate mit einer Vielzahl von quantitativen Analysemethoden wie Immunhistochemie, Western Blot und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) kompatibel.

Diese entwickelte Zellkulturplattform eignet sich aufgrund der hohen individuellen Abstimmungsfähigkeit jedes ECM-gebundenen Signals hervorragend zur Analyse mechanistischer Bahnen. Darüber hinaus können auf den Substraten gängige Methoden für das Zellmikromusterung, einschließlich des Mikrokontaktdrucks, erreicht werden, um eine kontrollierte zelluläre Haftung zu ermöglichen, um die Zellform im Verhältnis zu anderen ECM-gebundenen Cues24zu analysieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da liniengemusterte Substrate, die die Dehnung in Zellpopulationen fördern, ein Werkzeug zur Nachahmung und Untersuchung von länglichen und regenerativen SCs innerhalb von Büngner-Bändern während der Nervenregeneration darstellen. Darüber hinaus ist die zelluläre Morphologie ein potenter Regler mehrerer Zellfunktionen und kann potenziell verwirrende experimentelle Ergebnisse liefern, wenn sie nicht kontrolliert26,27. Den Mechanismen, die den regenerativen Phänotyp SC gemäß den ECM-Cues28,29,30regeln, wird nun große Aufmerksamkeit geschenkt. Dies ist wichtig, um Einblicke in die Gestaltung von Biomaterialien zu geben, die als Nervenleitschläuche zur Unterstützung der PNS-Nervenregeneration eingesetzt werden können. Diese detaillierten Protokolle können letztlich als potenzielles Werkzeug zur Entschlüsselung der Mechanismen der SC- und anderer Zelltypfunktionen eingesetzt werden, wie sie durch ECM-gebundene Cues reguliert werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tunable Zellkultur Substrat Vorbereitung und Charakterisierung

  1. Substratvorbereitung
    1. Mischen Sie das PDMS-Basiselastomer und die Härtungsmittel mit einer Pipettenspitze kräftig im Verhältnis zwischen 10:1 und 60:1, bis Blasen in der Mischung homogen dispergiert werden. Entfernen Sie Blasen mit Vakuum-Austrocknung, bis Blasen abgeführt werden.
      HINWEIS: Während der PDMS-Polymerisation kreuzt das Härtungsmittel mit dem Basiselastomer, um die gewünschten mechanischen Eigenschaften des endgültigen Polymers zu liefern. Crosslink-Verhältnisse können angepasst werden, um die PDMS-Steifigkeit zu ändern.
    2. Legen Sie einen Tropfen (0,2 ml) der getrockneten PDMS-Mischung auf einen quadratischen oder kreisförmigen Deckslip (z. B. 22 mm x 22 mm) und drehen Sie den Deckelaufschuh auf einem Spincoater bei 2500 U/min für 30 s.
    3. Inkubieren Sie den Deckelinrutsch entweder in einem Ofen bei 60 °C für 1-2 h oder Raumtemperatur über Nacht, damit PDMS erstarren kann.
    4. Behandeln Sie den Deckelrutsch mit UV-Ozonreiniger für 7 min (UV-Wellenlänge: 185 nm und 254 nm), um die Oberflächenhydrophilitizität zu erhöhen. Legen Sie es in eine sterilisierte 6-Well-Platte.
    5. Vor der Verwendung für die Zellkultur, inkubieren Substrate in 70% Ethanol für mindestens 30 min.
      VORSICHT: UV-Ozonreiniger kann für den Menschen schädliches Ozon erzeugen. Arbeiten Sie in einer chemischen Dunstabzugshaube oder mit irgendeiner Form der Belüftung.
    6. Eintauchen in die Proteinlösung (10 g/ml Kollagen I, Fibronectin oder Laminin) für 60 min in einem sterilen Inkubator bei 37 °C.
      HINWEIS: Nach der UV-Ozon-Behandlung kann die PDMS-Oberfläche noch hydrophob sein. Drehen Sie die Wellplatte, um sicherzustellen, dass jeder Coverslip mit der Proteinlösung abgedeckt ist.
    7. Die Proteinlösung ansaugen und den Deckelschlupf mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) 3x waschen.
    8. Re-suspend RT4-D6P2T Schwann Zelllinie (SCs) von Passaging Schale mit handelsüblichen EDTA-Lösung (1x) mit 2,5% Trypsin und zählen Zellen mit Hämozytometer. Seed SCs auf der abstimmbaren PDMS-Oberfläche bei der gewünschten Zelldichte. SC-Saatdichten können für jede Anwendung variieren.
    9. Halten Sie Zellen in den gewünschten Zellkulturparametern (90% Luftfeuchtigkeit, 5%CO2, 37 °C, etc.) für die Dauer des Experiments. Verwenden Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin als Zellkulturmedium.
  2. Mikromuster-Substratpräparation
    1. Zeichnen Sie die gewünschten Geometrie- und Zellklebstoffflächen (900 m2, 1.600 m2 und 2.500m2) mit computergestützter Design-Software (CAD). Erstellen Sie eine Chrom-Fotomaske basierend auf diesen Mustern von einem kommerziellen Anbieter.
    2. Verwenden Sie in einem Reinraum oder in einer staubfreien Umgebung Standard-Photolithographie-Techniken, um Siliziumwafer herzustellen (Protokolle werden an anderer Stelle detailliert beschrieben31). Kritische Parameter für diese spezielle Anwendung sind wie folgt: Photoresist: SU-8 2010; Spin-Profil, um den Photoresist zu zerstreuen: 500 U/min für 10 s mit einer Beschleunigung von 100 U/min/ s, dann 3500 U/min für 30 s mit einer Beschleunigung von 300 U/min; Belichtungsenergie von UV-Licht: 130 mJ/cm2.
      ANMERKUNG: Die Höhe der Muster auf den Siliziumwafern beträgt ca. 10 m nach diesen Parametern. Potenzielle Risse am Rand außerhalb der rechteckigen oder dreieckigen Muster können mit einem Lichtmikroskop nach Schritt 1.2.2 beobachtet werden. Das Backen des Siliziumwafers bei 190 °C für 30 min hilft, die Risse zu beseitigen.
    3. Legen Sie den gemusterten Siliziumwafer in eine kreisförmige 150 mm Durchmesser x 15 mm Höhe Petrischale und gießen Sie entgastiertes PDMS (Mischverhältnis 10:1) wie in Schritt 1.1.1 auf den Siliziumwafer vorbereitet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dicke von PDMS mindestens 5 mm beträgt, um die Handhabung während der Druckschritte mit Mikrokontakt zu vereinfachen.
    4. VERfestigen SIE PDMS auf Siliziumwafer n. Chr. bei 60 °C über Nacht. PDMS auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Präzise geschnittene Stempel von 30 mm x 30 mm Quadraten, die die richtigen Muster aus dem Siliziumwafer mit einem chirurgischen Skalpell enthalten. Beschädigen Sie den Siliziumwafer nicht.
      HINWEIS: Siliziumwafer können an dieser Stelle mehrmals wiederverwendet werden, um nach der Reinigung mit Isopropanol mehr Stempel zu produzieren.
    5. Sterilisieren Sie PDMS-Stempel und die abstimmbaren Abdeckungen (in Schritt 1.1.1 bis 1.1.3) durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 min.
    6. Um die Wirksamkeit von Mikromustern durch PDMS-Stempel nach Mikrokontaktdruck zu bestätigen, trocknen Sie die Oberfläche von PDMS-Stempeln mit einem gefilterten Luftstrom und einer Pipetten-Lösung 50 g/ml BSA (Texas Red conjugated), um die gesamte gemusterte Seite des PDMS-Stempels abzudecken.
    7. Inkubieren Sie PDMS-Stempel mit BSA-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur, um eine Proteinadsorption zu ermöglichen.
    8. Trocknen Sie die Oberfläche der abstimmbaren Abdeckungen mit einem gefilterten Luftstrom, erhöhen Sie die Oberflächenhydrophiliität, wie in Schritt 1.1.5 beschrieben.
    9. Trocknen Sie die PDMS-Stempel an die Luft, um die verbleibende BSA-Lösung zu entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die BSA-Lösung vollständig aus dem Stempel entfernt wird, da jede verbleibende Lösung dazu führt, dass Während des Mikrokontaktdrucks Stempel auf dem Deckblatt gleiten.
    10. Bringen Sie die gemusterte Seite des Stempels in konformen Kontakt mit dem abstimmbaren Deckschein für die BSA-Adsorption auf der Deckslip-Oberfläche. Drücken Sie den Stempel vorsichtig 5 min gegen den Deckel.
      HINWEIS: Wenden Sie keine übermäßige Kraft auf den Stempel an, da er sich verbiegt und einen unspezifischen Kontakt zwischen Stempel und Deckblatt verursacht. Die entsprechende Kraft, die auf den Stempel ausgeübt wird, ist für den erfolgreichen Mikrokontaktdruck unerlässlich.
    11. Untersuchen Sie das Mikromuster mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Filter (Fluorescein isothiocyanate).
    12. Um Zellklebeflächen statt fluoreszierender Muster zu drucken, ersetzen Sie Laminin gegen BSA-Protein und wiederholen Sie Schritt 1.2.5 bis 1.2.10.
    13. Stempel von Coverlips entfernen, Coverlips in eine sterilisierte 6-Well-Platte übertragen. Fügen Sie 2 ml 0,2% mit pluronischer F-127-Lösung in jeden Brunnen ein, um die Oberfläche des Deckels zu bedecken und 1 h bei Raumtemperatur zu brüten.
      HINWEIS: Pluronische F-127 kann auf PDMS-Oberfläche adsorbiert werden, was die Hydrophobie der PDMS-Oberfläche erhöht, um Zellen vor der Haftung zu blockieren.
    14. Aspirieren Pluronische F-127 Lösung und waschen 5x mit PBS und 1x mit dem Zellkulturmedium vor der Aussaat zellen. Eine typische Sädichte für SCs beträgt 1.000 Zellen/cm2.
    15. 45 min nach dem Aussaat der Zelle, entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie Abdeckungen mit PBS 2x, um zu verhindern, dass mehrere SCs an demselben Muster haften. Bewahren Sie Zellen in der gewünschten Zellkulturumgebung für 48 h vor der Quantifizierung.
    16. Um liniengemusterte Zellkultursubstrate zu erstellen, um ausgerichtete Zellen zu untersuchen, führen Sie Schritt 1.2.1 bis 1.2.4 aus, um Stempel für den Mikrokontaktdruck zu erstellen.
      ANMERKUNG: Die Abmessungen der Nut/Grat der gefütterten Muster auf Stempel sind 50 x 50 m für die umrissenen Zellen. Die Gesamtabmessungen des Stempels betragen 10 mm x 10 mm.
    17. Schneiden Sie Stempel in Maße, die nur gewünschte Linienmuster enthalten.
      HINWEIS: Beim Erstellen von Stempeln in CAD entspricht der ungemusterte Bereich des Stempels um die Linienmuster dem Zellklebstoffbereich nach dem Mikrokontaktdruck. Daher ist es notwendig, ungemusterte Bereiche beim Ausschneiden des Stempels zu beseitigen, um sicherzustellen, dass jeder SC, der auf der Oberfläche gesät wird, den Mustern folgt.
    18. Folgen Sie Schritt 1.1.1 bis 1.1.3, um eine abstimmbare PDMS-Oberflächenbeschichtung von zwei Petrischalen vorzubereiten.
      HINWEIS: Dies wird PDMS, das die Petrischale Oberfläche selbst und nicht auf einem Deckschein bedeckt.
    19. Folgen Sie Schritt 1.2.5 bis 1.2.10, um Mikrokontaktdruck durchzuführen, um liniengemusterte Zellklebstoffbereiche auf einem der PDMS-beschichteten Petrischalen zu drucken.
      HINWEIS: Die Oberfläche einer 60 mm x 15 mm Petrischale kann liniengemusterte Flächen aus 6 PDMS-Stempeln enthalten.
    20. Stempel entfernen und die Petrischale mit 4 ml 0,2% mit Pluronischer F-127 Lösung füllen und 1 h brüten.
    21. Nach dem Mikrokontaktdruck spülen Sie jede Seite der PDMS-Stempel mit 70% Ethanol 3x und trocknen Sie mit Luft. Drehen Sie PDMS-Stempel und folgen Sie Schritt 1.2.5 bis 1.2.10, um den ungemusterten Zellklebstoffbereich mit der ungemusterten Seite des Stempels auf der zweiten Petrischale zu drucken. Wiederholen Sie Schritt 1.2.13.
    22. Aspirat F-127 Lösung aus Geschirr, waschen 3x mit PBS gefolgt mit 1x Waschen mit frischer Zellkultur Medium. Samen SCs auf Geschirr.
      HINWEIS: Die Saatdichte für eine liniengemusterte Schale beträgt 5.000 Zellen/cm2 und für eine ungemusterte Schale 10.000 Zellen/cm2.
    23. Verwalten Sie SCs zu den gewünschten Bedingungen für 48 h und befolgen Sie Protokolle, um SC-Lysatevorzubereiten 32.
      HINWEIS: Die Zellsädichte für ungemusterte Gerichte ist 2x höher als die für liniengemusterte Gerichte, da die liniegemusterte Schale nur die Hälfte der Zellklebstofffläche der ungemusterten Schale hat.
      1. Zur Herstellung von Lysaten einen ausreichenden Radioimmunpräzipitations-Assay (RIPA) auf ein 10 ml konisches Zentrifugenrohr übertragen. Protease- und Phosphatase-Inhibitor (100x) im Verhältnis 1:100 im RIPA-Puffer verdünnen, durch Pipettieren gut vermischen.
      2. Waschen Sie Zellen mit eiskaltem PBS (1x) für 2 min, fügen Sie 80 l der Lösung, die ab Schritt 1.2.23.1 hergestellt wird, auf jeden Zellklebstoffbereich (den Bereich, der mit PDMS-Stempeln und adsorbiertem Protein kontaktiert wurde) in Petrischalen hinzu. Inkubieren Sie Zellen mit der Lösung auf einem Eisblock für 15 min.
        HINWEIS: Die Lösung bleibt aufgrund der Hydrophobie der Pluronischen F-127 Adsorption an anderer Stelle nur auf dem Zellklebstoffbereich. Diese Funktion ermöglicht eine erfolgreiche und ausreichende Proteinextraktion für liniengemusterte SCs.
      3. Schrott-SCs mit einem Zellschaber für 5 min. Lysat in ein beschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr sammeln.
      4. Mikrozentrifugieren Lysat bei 12.000 x g für 15 min bei 4°C. Überstand mit einer 1.000-L-Pipette sammeln und in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr geben. Zelle lysieren bei -20 °C.
  3. Substratcharakterisierung
    HINWEIS: Um die Mechanik des Polymers auf dem Deckblatt zu charakterisieren, werden in der Regel mehrere Methoden eingesetzt, einschließlich Massenkompressionstests11,33 oder Atomkraftmikroskopie-Tests34. Dieses Protokoll beschreibt Massenkomprimierungstests.
    1. Gießen Sie den PDMS-Vorläufer des gewünschten Mischungsverhältnisses (Schritt 1,1) in eine 30 mm Petrischale, stellen Sie sicher, dass die Dicke der PDMS-Schicht innerhalb der Petrischale mindestens 20 mm beträgt.
    2. Die Petrischale mit erstarrtem PDMS nach 1 H aus dem 60 °C-Ofen nehmen und bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Polymer in 10 mm x 10 mm Quadrate schneiden. Messen Sie die Dicke von PDMS mit Bremssätteln.
    3. PdMS auf die Bühne der Kompressionskraftmessmaschine stellen. Stecken Sie den Kompressionskraftsensor (Modell: 112C) an den Sensoranschluss und fixieren Sie den Sensor an der Achse der Prüfmaschine.
    4. Stellen Sie die Höhe des Sensors auf ca. 0,5 cm über dem PDMS-Stempel ein, indem Sie die "Jog"-Steuerung auf der Vorderseite des Instruments verwenden.
    5. Öffnen Sie die zugehörige Software mit "Test Setup" Fenster, wählen Sie "Servoprofil", und öffnen Sie das "Segment" Fenster. Geben Sie imFensterSegment " " " " "Control Rate" und "End Amount" für den Test ein.
      HINWEIS: Die Steuerrate bestimmt die Geschwindigkeit, mit der der Sensor nach unten zum PDMS fährt. Der Endbetrag bestimmt die Gesamtentfernung, die der Sensor zurücklegt.
    6. Verwenden Sie die Taste "Z" auf dem Bedienfeld der Software, um alle Messungen an dieser Stelle zurückzusetzen.
    7. Bewegen Sie den Sensor nach unten, um PDMS leicht zu berühren, bis 1-2 Newton (N) geladen sind. Die Beladung und der Abstand, den der Sensor zurücklegt, werden in der Software angezeigt.
    8. Nachdem Sie die Schaltfläche "Z" verwendet haben, führen Sie die Messung mit "Play" aus und speichern Sie die Dateiaufnahmekraft und -entfernung.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3 bis 1.3.8 für jede experimentelle Erkrankung von PDMS.
    10. Öffnen Sie die Datei und verwenden Sie die folgende Formel, um den Young-Modul (E) von PDMS für jedes Verhältnis zu berechnen. (F = Kompressionskraft, A = Bereich des PDMS-Stempels, -L = Fahrabstand des Sensors und L0 = Originaldicke des PDMS-Stempels).
      figure-protocol-1

2. Quantifizierung der zellulären Eigenschaften auf abstimmbaren Substraten

  1. Proliferation assay
    1. Samen-SCs auf Substraten, die ab Schritt 1.1.9 mit einer2 Dichte von 5.000 Zellen/cm2 in einer 6-Well-Platte hergestellt werden. Lassen Sie SCs für 48 h unter Standard-Zellkulturbedingungen (37 °C und 5%CO2)inkubieren.
    2. 12 l von 10 mM Bromodeoxyuridin (BrdU) Stammlösung in 12 ml 37 °C Zellkulturmedium verdünnen, gut mit Pipette mischen, um 10 M BrdU Etikettierlösung zu machen.
    3. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie SCs 2x mit PBS.
    4. Fügen Sie 2 ml BrdU-Etikettierlösung in jeden Brunnen und inkubieren SCs für 2 h.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit der BrdU-Etikettierungslösung hängt von der spezifischen Zellproliferationsrate ab. Die RT4-D6P2T SC-Linie hat eine hohe Proliferationsrate, so dass 2 h Inkubationszeit verwendet wurde.
    5. BrdU-Etikettierlösung entfernen und SCs 3x mit PBS waschen. Fügen Sie 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBS zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei Raumtemperatur für 15 min zur Zellfixierung.
      VORSICHT: Formaldehyd ist ein menschliches Karzinogen; führen Sie daher alle Arbeiten innerhalb einer chemischen Rauchhaube mit entsprechendem Schutz durch.
      HINWEIS: Beim Waschen mit PBS gibt es kein Zellkulturmedium im Brunnen, und daher kann die PDMS-Oberfläche hydrophob sein. Ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die Oberfläche des Substrats nicht vollständig zu trocknen, um Zellschäden zu verhindern.
    6. Formaldehydlösung ansaugen und 3x mit PBS (je 3 min) waschen. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS zu jedem Brunnen hinzu, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Inkubieren Sie SCs mit Triton X-100 Lösung für 20 min bei Raumtemperatur.
    7. Entfernen Sie Triton X-100 Lösung und waschen Sie SCs 3x mit PBS (jeweils 3 min).
    8. Fügen Sie 1 ml 1 N HCl in jeden Brunnen und inkubieren auf Eis für 10 min. Entfernen Sie 1 N HCl und fügen Sie 1 ml 2 N HCl in jedem Brunnen und inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. HCl Behandlung ist für DNA-Hydrolyse.
    9. Mischen Sie 182 ml 0,2 mM Na2HPO4 und 18 ml 0,1 ml Zitronensäure, um einen Phosphat-/Zitronensäurepuffer für die Antigenrückgewinnung zu erzeugen. 2 N HCl entfernen und 1 ml Phosphat/Zitronensäurepuffer in jeden Brunnen geben und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
    10. Waschen Sie SCs 3x mit 0,2% Triton X-100 in PBS. Fügen Sie 2 ml 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS in jeden Brunnen und inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindung des Antikörpers zu takten.
    11. Verdünnung des BrdU-Primärantikörpers mit Alexa Fluor 488 in 3% BSA-Lösung im Verhältnis 1:300 für BrdU-Färbelösung. Inkubieren Sie SCs mit Färbelösung über Nacht bei Raumtemperatur, während die Platte mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
    12. Zur Quantifizierung der Proliferation werden Bild-SCs mit dem FITC- und DAPI-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops zum Nachweis von BrdU bzw. Kernen verwendet. Speichern Sie Bilder als "nd.2"-Dateien.
    13. Öffnen Sie "nd.2"-Dateien für jedes Bild, das an identischen räumlichen Positionen aufgenommen wurde.
    14. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Hintergrund, um das Fenster "Automatisierte Messergebnisse" und "Automatisierte Messung" im Abschnitt "Analysesteuerung" zu öffnen.
    15. Wählen Sie im Menü" Count & Taxonomy" "Count" aus. Klicken Sie auf dem FITC-Bild auf jeden Kern mit grüner Fluoreszenz (BrdU-positiv) und mit der rechten Maustaste auf das Bild.
      HINWEIS: Die Anzahl der BrdU-positiven Zellen wird im Fenster"Automatisierungen und Messungen" angezeigt.
    16. Wiederholen Sie für DAPI-Bilder Schritt 2.1.14, um die Anzahl der Gesamtkerne zu zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen für dieses Bild.
    17. Wiederholen Sie Schritt 2.1.13 bis 2.1.16 für andere Bilder zu statistischen Zwecken und berechnen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz der BrdU-positiven Zellen für jede Substratbedingung.
  2. Quantifizierung der c-Jun-Expression durch immunfluoreszierende Bildanalyse
    1. Zellen, die in 6-Well-Platten aus Schritt 1.1.9 und 1.2.23 hergestellt werden, werden mit den zuvor beschriebenen Verfahren fixiert und permeabilisiert (Schritt 2.1.5-2.1.7).
      HINWEIS: Um genaue Vergleiche der Fluoreszenzintensität über Zellen unterschiedlicher ECM-Bedingungen hinweg durchzuführen, wenden Sie kameraeinstellungen auf alle Proben identisch an, wobei alle Proben die gleichen Parameter aufweisen.
    2. Speichern Sie Bilder als ".nd2"-Dateien.
    3. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware. Rechtsklick Hintergrund, um das Fenster "Automatisierte Messergebnisse" und "Automatisierte Messung" im Abschnitt "Analysesteuerung" zu öffnen.
    4. Wählen Sie unter "Automatisierte Messergebnisse" "Objektdaten" aus. Aktivieren Sie die Schaltfläche "Messung aktualisieren".
    5. Wählen Sie im oberen Bereich der Software "Measure" gefolgt von "Objektfunktionen" aus. Fügen Sie "Mean Intensity" dem Abschnitt von "Selected for Measurement" hinzu.
    6. Öffnen und verschmelzen Sie zwei ".nd2"-Bilddateien, die Bilder von c-Jun und Kernen enthalten.
    7. Wählen Sie im oberen Bereich "ROI" und "Zeichnen des rechteckigen ROI" aus. Zeichnen Sie einen rechteckigen Bereich, der den Kernbereich einer einzelnen Zelle enthält.
      HINWEIS: der c-Jun-Ausdruck ist innerhalb der Kerne35konzentriert.
    8. Wählen Sie im oberen Bereich der Software "Binary" und "Define Threshold" ein neues Fenster aus, um den c-Jun-Fluoreszenzbereich genau zu definieren.
    9. Klicken Sie im neuen Fenster auf"Vollbild/ROIverwenden ", um das Programm vom vollständigen Bildmodell zum ROI-Modell zu wechseln. Verwenden Sie "Intensität", um die Nachschlagetabelle auf der linken Seite des Fensters anzupassen, um die Größe/Form des hervorgehobenen Bereichs innerhalb des rechteckigen ROI anzupassen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Größe/Form des hervorgehobenen Bereichs mit dem Kern identisch ist.
    10. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK", um die mittlere FITC-Intensität im Fenster"Automatisierte Messergebnisse" zu erhalten, und klicken Sie dann auf "Daten speichern".
    11. Im Fenster "Automatisierte Messung", " Objektlöschen", um den rot markierten Bereich zu entfernen. Verwenden Sie auf der linken Seitenseite "Zeigewerkzeug", um den rechteckigen ROI auszuwählen und zu löschen.
    12. Wiederholen Sie Schritt 2.2.6 bis 2.2.11, um die mittlere FITC-Intensität für jede weitere Zelle zu messen.
    13. Wählen Sie im Fensterbereich von "Automatisierte Messergebnisse" "Gespeichert" aus und alle gespeicherten Daten werden angezeigt. Verwenden Sie die Funktion "Exportieren" und wählen Sie "Daten nach Excel", um die exportierte Kalkulationstabelle zu speichern und zusätzliche Berechnungen durchzuführen.
  3. Quantifizierung der nuklearen Dehnung
    1. Fix- und Permeabilize-SCs, die ab Schritt 1.2.22 nach den Schritten 2.1.5-2.1.7 erstellt wurden. Führen Sie die Kernfärbung mit Montagemedium mit DAPI durch.
    2. Mit dem DAPI-Kanal und einem 40-fachen Objektiv können Sie Bilder des Samples erfassen und als ".nd2"-Dateien speichern.
    3. Folgen Sie den Schritten 2.2.3 und 2.2.4, um das Fenster"Automatisierte Messergebnisse" und"Automatisierte Messung" in der Bildanalysesoftware zu öffnen.
    4. Verwenden Sie in "Automated Measurement Results" die Funktion Option, gefolgt von "Objektfeatureauswählen ".Option Wählen Sie in der Spalte "Feature" " "" "Dehnung" aus und fügen Sie der Spalte "Ausgewählt für Messungen" hinzu. Verwenden Sie "Aktualisierungsmessung beibehalten", um diese Funktion zu aktivieren.
    5. Öffnen Sie die Bilddatei "nd.2", die die Kernbilder enthält. Wählen Sie im Fenster"Automatisierte Messung" die Funktion"Auto-Erkennung" und wählen Sie einen Kern aus. Rechtsklick auf das Bild und das gemessene kerntechnische Seitenverhältnis wird in "Automatisierte Messergebnisse" angezeigt.
    6. Wiederholen Sie Schritt 2.3.5, um die nuklearen Seitenverhältnisse für andere Kerne innerhalb des Bildes zu quantifizieren. Wählen Sie "Daten speichern" im Fenster "Automatisierte Messergebnisse" aus.
    7. Wiederholen Sie 2.3.5 bis 2.3.6 für zusätzliche Bilder. Exportieren Sie die Daten zur Analyse in eine Tabellenkalkulationsdatei, wie zuvor in 2.2.13.
  4. Western Blot zur Quantifizierung der Proteinexpression
    1. Befolgen Sie Standardprotokolle für die Western Blot-Analyse, die an anderer Stelle detailliert sind32. Die Verdünnungen der in der Studie verwendeten Antikörper sind unten dargestellt: Rabbit anti c-Jun 1:2,000; Maus-Anti-Actin 1:1.000; Kaninchen anti p75NTR 1:1.000; Kaninchen anti Myelin Grundprotein 1:1.000; Anti-Maus/Kaninchen IgG, HRP-gebundener Antikörper 1:10.000.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um das Zusammenspiel zwischen Substratsteifigkeit und Proteinzusammensetzung auf SC-Phänotyp zu analysieren und zu quantifizieren, wurde ein abstimmbares PDMS-Zellkultursubstrat entwickelt (Abbildung 1A). Kompressionsprüfung des Polymers auf unterschiedlicher Basis: Härtungsmittelverhältnisse wurden verwendet, um den Young-Modul (E) des Substrats zu quantifizieren (Abbildung 1B). Der resultierende Modulbereich stellt physiologisch relevante Substratbedingungen d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SCs können die Nervenregeneration aufgrund ihrer phänotypischen Transformation und des regenerativen Potenzials nach Einer Nervenverletzung fördern. Wie ECM-Cues diese regenerative Neutungsfähigkeit regulieren, bleibt jedoch weitgehend unklar, was möglicherweise nicht nur die Entwicklung von Biomaterialien behindert, die die Nervenregeneration fördern sollen, sondern auch das Verständnis der Mechanismen, die an der Nervenregeneration beteiligt sind. Um dieses Zusammenspiel zu untersuchen, wurden Zellkultursubstrate gesch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Förderung durch die Universität Cincinnati. Die Autoren danken auch Ron Flenniken von der University of Cincinnati Advanced Materials Characterization Laboratory für die Unterstützung.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin aus Rinderserum (BSA), Texas Rotes KonjugatThermo Fisher ScientificA23017BSA-Färbung zur Darstellung von Mikromustern
Anti-Maus-IgG, HRP-linked AntikörperCell Signaling Technology7076SAntikörper für die Western-Blot-Analyse
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-linked AntikörperCell Signaling Technology7074SAntikörper für die Western-Blot-Analyse
BrdUThermo Fisher ScientificB23151Reagenz zur Messung der Zellproliferation
BrdU-Primärantikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificB35130Zur Visualisierung von BrdU in Zellproliferationsassays
Kollagen IThermo Fisher ScientificA10483-01Protein zur Beschichtung von Deckgläsern
DruckkraftprüfmaschineTestResourcesInstrument zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von Polymeren
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11965092Zellkulturmedium
Fötales RinderserumThermo Fisher Scientific16000044Zellkulturmedium ergänzend
FibronektinThermo Fisher Scientific33010-018Protein zur Beschichtung von Deckgläsern
Fluoreszenz MikroskopNikonEclipse Ti2Fluoreszenzmikroskop
Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78440Protease- und Phosphatase-Inhibitor
LamininThermo Fisher Scientific23017015Protein zur Beschichtung von Deckgläsern
Eindeckmedium mit DAPIThermo Fisher ScientificP36971Deckglas-Eindeckmittel und Zellkernfärbung
Maus c-Jun PrimärantikörperThermo Fisher Scientific711202Primärantikörper zur Visualisierung des c-Jun-Proteins
Maus β-Aktin-PrimärantikörperCell Signaling Technology3700SBeladungskontrolle für Western-Blot-Experimente
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Zellkulturmedium ergänzend
Photoresist SU 2010KAYAKUSU8-2010Photoresist
Pluronic F-127Sigma AldrichP-2443Block unspezifische Proteinbindung
Kaninchen c-Jun primärer AntikörperCell Signaling Technology9165SPrimärer Antikörper zur Visualisierung von c-Jun
Kaninchen Myelin basisches Protein Primärer AntikörperAbcamab40390Primärer Antikörper zur Visualisierung von MBP
Kaninchen p75NTR PrimärantikörperCell Signaling Technology8238SPrimärer Antikörper zur Visualisierung von p75NTR
Rhodamin PhalloidinThermo Fisher ScientificR415Visualisierung des Zellzytoskeletts
RIPA PufferAbcamab156034Zelllysepuffer
RT4-D6P2T Schwann ZelllinieATCCCRL-2768Zelllinie verwendet in Experimente
SYLGARD 184 PDMS-Basis und HärterSigma Aldrich761036Tunables Polymer zur Beschichtung von Deckgläsern
TrypsinThermo Fisher Scientific15090-046Zelldissoziationsreagenz
UV-Ozon-ReinigerNovascanErhöhung der Hydrophizilität von PDMS
Versene (1x)Thermo Fisher Scientific15040066Zelldissoziation Reagenz
Protein

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33(2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335(2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247(2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065(2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308(2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337(2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Schwann Cell PhenotypeExtracellular Matrix MicroenvironmentsTunable PDMS SubstrateMicrocontact Printing TechniqueCellular Spreading AreaCellular Elongation AnalysisImmunofluorescent StainingWestern Blot AnalysisLaminin Coated Substratesc Jun Expression

Related Articles