Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.
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Methodenartikel
Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Äußere Kräfte sind ein wichtiger Faktor bei der Bildung, Entwicklung und Erhaltung von Gewebe. Die Auswirkungen dieser Kräfte werden oft mit spezialisierten In-vitro-Dehnungsmethoden untersucht. Verschiedene verfügbare Systeme verwenden 2D-Substrat-basierte Keilrahmen, während die Zugänglichkeit von 3D-Techniken zum Belasten weicher Hydrogele eingeschränkter ist. Hier beschreiben wir eine Methode, die das äußere Dehnen von weichen Hydrogelen aus ihrem Umfang ermöglicht, wobei ein elastischer Silikonstreifen als Probenträger verwendet wird. Das in diesem Protokoll verwendete Stretching-System besteht aus 3D-gedruckten Teilen und kostengünstiger Elektronik, so dass es einfach und leicht in anderen Labors repliziert werden kann. Der experimentelle Prozess beginnt mit der Polymerisation dicker (>100 μm) weicher Fibrinhydrogele (Elastizitätsmodul von ~100 Pa) in einem Ausschnitt in der Mitte eines Silikonstreifens. Silikon-Gel-Konstrukte werden dann an der bedruckten Dehnvorrichtung befestigt und auf den konfokalen Mikroskopstand gelegt. Unter Live-Mikroskopie wird das Dehnungsgerät aktiviert und die Gele werden in verschiedenen Dehnungsgrößen abgebildet. Die Bildverarbeitung wird dann verwendet, um die resultierenden Gelverformungen zu quantifizieren und relativ homogeneDehnungen und Faserausrichtung über die gesamte 3D-Dicke des Gels (Z-Achse) zu demonstrieren. Zu den Vorteilen dieser Methode gehören die Fähigkeit, extrem weiche Hydrogele während der In-situ-Mikroskopie in 3D zu belasten, und die Freiheit, die Geometrie und Größe der Probe nach den Bedürfnissen des Benutzers zu manipulieren. Darüber hinaus kann diese Methode bei richtiger Anpassung verwendet werden, um andere Arten von Hydrogelen (z. B. Kollagen, Polyacrylamid oder Polyethylenglykol) zu dehnen und die Analyse der Reaktion von Zellen und Geweben auf äußere Kräfte unter biomimetischen 3D-Bedingungen zu ermöglichen.
Einleitung
Die Reaktion des Gewebes auf mechanische Kräfte ist ein integraler Bestandteil einer Vielzahl biologischer Funktionen, einschließlich Genexpression1, Zelldifferenzierung2und Gewebeumbau3. Darüber hinaus können kraftinduzierte Veränderungen in der extrazellulären Matrix (ECM) wie Faserausrichtung und Verdichtung das Zellverhalten und die Gewebebildung beeinflussen4,5,6. Die faserige Netzstruktur des ECM hat faszinierende mechanische Eigenschaften, wie nichtlineare Elastizität, nicht-affine Verformung und p....
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Protokoll
1. Lösungsvorbereitung (im Voraus durchzuführen)
- Fibrinogen-Markierung
HINWEIS: Der Markierungsschritt ist nur erforderlich, wenn die Analyse der Verformung des Fibringels gewünscht wird. Für zelluläre Experimente ist es möglich, ein unmarkiertes Gel zu verwenden.- 38 μL 10 mg/ml Succinimidylester-Fluoreszenzfarbstoff (gelöst in DMSO) zu 1,5 ml 15 mg/ml Fibrinogenlösung (Molverhältnis 5:1) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. Anschließend legen Sie das Röhrchen für 3 Minuten bei 800 x g (Raumtemperatur) in die Zentrifuge.
- Filtern Sie den Überstand aus dem vorherigen S....
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Ergebnisse
Repräsentative Daten von statischen Dehnungen zunehmender Größenordnungen, die auf den Silikonstreifen mit einem 3D-Fibrinhydrogel aufgebracht werden, eingebettet mit 1 μm fluoreszierenden Perlen, sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Analyse zeigt die Wirkung von Silikondehnung auf geometrische Veränderungen des Ausschnitts sowie die entwickelten Dehnungen innerhalb des Gels. Z-Stapelbilderdes gesamten Gels werden verwendet, um die Verformung des ursprünglichen kreisförmige.......
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Diskussion
Die hier vorgestellte Methode und das Protokoll basieren weitgehend auf unserer früheren Studie von Roitblat Riba et al.41 Wir schließen hier die vollständigen Computer-Aided Design (CAD), Python- und Mikrocontroller-Codes des SCyUS-Geräts ein.
Zu den wesentlichen Vorteilen der vorgestellten Methode gegenüber bestehenden Ansätzen gehört die Möglichkeit, sehr weiche 3D-Hydrogele (Elastizitätsmodul von ~100 Pa) aus ihrem Umfang und unter konfokale Live-Bildge.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Einige hier enthaltene Figuren wurden mit Genehmigung des Copyright Clearance Center angepasst: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Straining von 3D-Hydrogelen mit gleichmäßigen Z-Achsen-Dehnungen bei gleichzeitiger Ermöglichung von Live-Mikroskopie-Bildgebung, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 Carbonsäure, Succinimidylester | Invitrogen | A20002 | |
| Zellmedium (DMEM mit hohem Glukosegehalt) | Biologische Industrie | 01-052-1A | Fügen Sie 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat |
| Deckglas hinzu #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22 mal; 40 mm |
| DIMETHYLSULFOXID 99,5 % GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Biologische Industrie | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrinin Dichtstoff (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/ml, Thrombin: 800-1200 IE/mL |
| Fibrinogenpuffer | N/A | Rezept für 1L: 7g NaCl, 2,94g Trinatriumcitratdihydrat, 9g Glycin, 20g Argininhydrochlorid & 0,15 g Calciumchlorid-Dihydrat. Bringen Sie das Endvolumen auf 1 l mit PuW (pH 7,0-7,2) | |
| Fluoreszierende Mikrokügelchen FluoSpheres (1 µ m) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Wird als Suspension (2 % Feststoffe) in Wasser plus 2 mM Natriumazid |
| geliefert Hochtemperatur-Silikonkautschuk | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µ m-dick E = 1,5 mpa Poisson-Verhältnis = 0,48 Zugfestigkeit = 4,8 MPa Obergrenze der Dehnung = +300 % technische Dehnung |
| HiTrap-Entsalzungssäule 5 mL (Sephadex G-25 verpackt) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G Hochvakuum-Dichtungsmasse | Shin-Etsu Chemical Co., GmbH. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI Software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| Mikrocontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Zentrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert Lichtmikroskop | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systè mes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Servomotor - TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Zentrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | Für 50 mL Röhrchen |
| Steril 10 cm Nicht-Kulturplatten | Corning | 430167 | |
| Thrombin Puffer | N/A | Rezept für 1L: 20 g Mannitol, 8,77 g NaCl, 2,72 g Natriumacetattrihydrat, 24 ml 25 % Humanserumalbumin, 5,88 g Calciumchlorid. Bringen Sie das Endvolumen auf 1 l mit PuW (pH 7,0) | |
| Trypsin EDTA Lösung B (0,25%), EDTA (0,05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB-Kabel (Typ B Stecker auf Typ A Stecker) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Konfokalmikroskop | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (schwarz) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
Referenzen
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816(2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cycli....
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Nachdrucke und Genehmigungen
